張智，王露，尹文哲，李杰

響應(yīng)面法優(yōu)化PLD-01生產(chǎn)抑菌素發(fā)酵條件的研究

張智1，王露1，尹文哲2，李杰3

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱150086; 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

采用類(lèi)芽孢桿菌PLD-01發(fā)酵生產(chǎn)抑菌素，優(yōu)化最佳生產(chǎn)條件，為其食品生物防腐劑領(lǐng)域應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，Minitab 15軟件數(shù)據(jù)分析，獲得PLD-01產(chǎn)抑菌素最佳培養(yǎng)條件：PLD-01最佳培養(yǎng)基為葡萄糖1%、大豆粉2%、無(wú)機(jī)鹽為KH2PO40.2%；初始pH 7、發(fā)酵溫度36℃、搖床轉(zhuǎn)速179 r·min-1時(shí)，產(chǎn)生抑菌素抑菌效果最佳，此時(shí)抑菌圈直徑為15.7 mm。

響應(yīng)面法；類(lèi)芽孢桿菌；發(fā)酵條件；生物防腐劑；抑菌素

為延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，化學(xué)防腐劑使用普遍，對(duì)人體有一定毒副作用。因此，使用安全、高效的生物防腐劑代替化學(xué)防腐劑成為研究熱點(diǎn)[1]。食品生物防腐劑較多使用Nisin和納他霉素[2]。類(lèi)芽孢桿菌作為廣譜抑菌活性細(xì)菌易于分離培養(yǎng)[3]，產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物能力較強(qiáng)，可分泌抗生素、抗菌蛋白或多肽類(lèi)物質(zhì)，具有較好生物防腐劑作用[4]。

目前，類(lèi)芽孢桿菌應(yīng)用于新鮮蔬菜保鮮、工業(yè)酶生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。劉海燕等發(fā)現(xiàn)一株類(lèi)芽孢桿菌菌株可顯著降解微囊藻毒素[5]；陳海英等發(fā)現(xiàn)多粘類(lèi)芽孢桿菌菌株對(duì)荔枝霜疫霉菌等真菌有較強(qiáng)抑制效果[6]。Canova等類(lèi)芽孢桿菌研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)對(duì)立枯絲核菌等有良好抑制效果[7-8]。最適培養(yǎng)基組成和最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件可使菌數(shù)和發(fā)酵產(chǎn)物最大化[9]。因此本研究采用響應(yīng)面法以金黃色葡萄球菌為指示菌，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究類(lèi)芽孢桿菌PLD-01菌株生產(chǎn)抗菌素最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 試驗(yàn)菌株

類(lèi)芽孢桿菌菌株P(guān)LD-01由東北林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程微生物實(shí)驗(yàn)室保存。金黃色葡萄球菌菌株，由黑龍江省科學(xué)院微生物所提供。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，酵母浸粉，NaCl均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

YXQ-LS-18S手握式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；IS-RSD3臺(tái)式恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；SWCJ-IFD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ALC-210.1電子天平（北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件

1.2.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)[10]：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0~7.2，121℃滅菌20 mim。培養(yǎng)條件：37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。用于活化類(lèi)芽孢桿菌。

1.2.2 LB培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母0.5%，NaCl 1%，用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌。

1.3 方法

1.3.1 類(lèi)芽孢桿菌PLD-01生長(zhǎng)曲線繪制

從經(jīng)37℃活化培養(yǎng)24 h PLD-01菌株斜面挑取一環(huán)接種于100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于37℃震蕩培養(yǎng)（180 r·min-1），每隔3 h取樣1次，測(cè)量OD600值，重復(fù)3次，取平均值，確定類(lèi)芽孢桿菌PLD-01生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 PLD-01菌株發(fā)酵培養(yǎng)

以2%接種量，接入50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于30℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h后，將發(fā)酵液9 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。

1.3.3 PLD-01菌株抑菌活性試驗(yàn)方法

采用紙片法測(cè)定類(lèi)芽孢桿菌抗菌活性。將活化后金黃色葡萄球菌接種于LB培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24 h，備用。將直徑為6 mm無(wú)菌濾紙片浸泡在類(lèi)芽孢桿菌發(fā)酵離心后上清液中。無(wú)菌鑷子取出后分別貼于金黃色葡萄球菌平板，每個(gè)設(shè)置3次重復(fù)，然后放入37℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)48 h，觀察抑菌情況并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.4.1.1 碳源種類(lèi)對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

以液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選擇蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、環(huán)糊精、淀粉為碳源替代發(fā)酵培養(yǎng)基中牛肉膏[11]，分別制備1%、2%、3%三個(gè)濃度單一碳源培養(yǎng)基，再將菌懸液以5%接種量接種到培養(yǎng)基中，置于30℃，180 r·min-1下培養(yǎng)24 h，按照1.3.3抑菌試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，確定最佳碳源種類(lèi)。

1.4.1.2 氮源種類(lèi)對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

以?xún)?yōu)化后碳源為基礎(chǔ)，選擇蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，硫酸銨、大豆粉為氮源，分別制備1%、2%、3%三個(gè)濃度單一氮源培養(yǎng)基，再將菌懸液以5%接種量接種到培養(yǎng)基中，置于30℃，180 r·min-1下培養(yǎng)24 h，按照1.3.3抑菌試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，確定最佳氮源種類(lèi)。

1.4.1.3 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

在確定最佳碳源、氮源種類(lèi)基礎(chǔ)下，選擇KH2PO4、CaCl2、MgS04、FeSO4、MnCl2、NaCl等不同無(wú)機(jī)鹽離子添加到培養(yǎng)基中，再將菌懸液以5%接種量接種到培養(yǎng)基中，置于30℃，180 r·min-1下培養(yǎng)24 h，按照1.3.3抑菌試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，確定最佳無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽影響。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.4.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

在250 mL錐形瓶中分別加入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，將2%菌懸液接種到培養(yǎng)液中，在37℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r·min-1下分別培養(yǎng)12、24、36、48、60 h，按照1.3.3抑菌試驗(yàn)方法，觀察抑菌情況，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4.2.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

在250 mL錐形瓶中分別加入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，將2%菌懸液接種到培養(yǎng)液中，在37℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h，分別采用100、140、180、220、260 r·min-1不同搖床轉(zhuǎn)速培養(yǎng)。按照1.3.3抑菌試驗(yàn)方法，觀察抑菌情況，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4.2.3 發(fā)酵pH對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

在250 mL錐形瓶中分別加入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，將2%菌懸液接種到培養(yǎng)液中，用HCl和NaOH溶液將培養(yǎng)基pH分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，37℃振蕩培養(yǎng)24 h。按照1.3.3抑菌試驗(yàn)方法，觀察抑菌情況，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

在250 mL錐形瓶中分別加入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，將2%菌懸液接種到培養(yǎng)液中，分別于25、30、35、40、45℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，按照1.3.3抑菌試驗(yàn)方法，觀察抑菌情況，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化類(lèi)芽孢桿菌發(fā)酵條件

通過(guò)分析影響PLD-01生長(zhǎng)因素，確定在單因素條件下適合PLD-01生長(zhǎng)搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵pH、發(fā)酵溫度。Minitab15軟件響應(yīng)面分析優(yōu)化PLD-01發(fā)酵條件，獲得PLD-01最佳發(fā)酵條件，測(cè)量抑菌圈直徑，驗(yàn)證響應(yīng)面分析方法適用性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 類(lèi)芽孢桿菌PLD-01菌株生長(zhǎng)曲線繪制

由圖1可知，發(fā)酵初期，類(lèi)芽孢桿菌PLD-01繁殖菌體少且生長(zhǎng)緩慢。隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，6~21 h繁殖菌體數(shù)增加，菌體迅速生長(zhǎng)，代謝旺盛，為菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適合作種子液。21~36 h時(shí)為菌株穩(wěn)定期，PLD-01生長(zhǎng)消耗大量培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有害代謝產(chǎn)物積累，影響菌體生長(zhǎng)繁殖速度。36 h后為衰亡期，活菌數(shù)量減少。

圖1 類(lèi)芽孢桿菌PLD-01菌株生長(zhǎng)曲線Fig.1Growth curve of Paenibacillus PLD-01 strain

2.2 抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，類(lèi)芽孢桿菌PLD-01對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，抑菌圈平均直徑為12.2 mm。抑菌圈直徑與拮抗菌抑菌物質(zhì)活性、產(chǎn)生量和擴(kuò)散能力有關(guān)，通常抑菌圈直徑與拮抗菌抑菌活性成正比[12]。

2.3 最佳培養(yǎng)基篩選

2.3.1 最佳碳源篩選

以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，研究蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、環(huán)糊精、淀粉為碳源對(duì)PLD-01產(chǎn)抗菌素影響，每種碳源分別設(shè)置1%、2%、3%三個(gè)濃度，以抑菌圈直徑（mm）作指標(biāo)，檢驗(yàn)抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，類(lèi)芽孢桿菌PLD-01菌株在利用蔗糖和葡萄糖時(shí)抑菌圈直徑較大，產(chǎn)生較多抗菌素。說(shuō)明形成產(chǎn)物過(guò)程中蔗糖和葡萄糖優(yōu)于其他碳源，其中葡萄糖濃度為1.0%時(shí)，抑菌圈直徑最大，說(shuō)明此時(shí)PLD-01菌株有較高產(chǎn)生抗菌素能力，篩選最適碳源為1.0%葡萄糖。高于此濃度，產(chǎn)物合成受到抑制。

圖2 不同碳源對(duì)PLD-01菌株抑菌效果影響Fig.2Effects of different carbon sources on PLD-01

2.3.2 最佳氮源篩選

以葡萄糖為碳源，研究蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，硫酸銨、大豆粉為氮源對(duì)PLD-01產(chǎn)抗菌素影響，每種氮源分別設(shè)置1%、2%、3%三個(gè)濃度，以抑菌圈直徑（mm）作指標(biāo)，檢驗(yàn)抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，PLD-01菌株在利用大豆粉和蛋白胨時(shí)抑菌圈較大，產(chǎn)生較多抗菌素。其中大豆粉濃度為2.0%時(shí)，抑菌圈直徑最大，說(shuō)明此時(shí)PLD-01菌株有較高產(chǎn)抗菌素能力，篩選2.0%大豆粉為最適氮源。

2.3.3 最佳無(wú)機(jī)鹽篩選

在以葡萄糖為碳源，大豆粉為氮源基礎(chǔ)上，選擇KH2PO4、CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、NaCl等不同無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)PLD-01產(chǎn)抗菌素影響，以抑菌圈直徑（mm）作指標(biāo)，檢驗(yàn)抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 不同氮源對(duì)PLD-01菌株抑菌效果影響Fig.3Effects of different nitrogen sources on PLD-01

圖4 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)PLD-01抑菌效果影響Fig.4Effects of different inorganic salts on PLD-01

由圖4可知，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽為KH2PO4時(shí)，抑菌圈直徑最大，說(shuō)明影響PLD-01產(chǎn)抗菌素顯著因素是KH2PO4，可促進(jìn)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生，抑菌效果提高顯著，其他無(wú)機(jī)鹽無(wú)顯著效果。選擇KH2PO4為最佳無(wú)機(jī)鹽。

最終確定葡萄糖為碳源，大豆粉為氮源，KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽。

2.4 發(fā)酵條件對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

2.4.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

由圖5可知，類(lèi)芽孢桿菌PLD-01在12~60 h均有抑菌圈形成，12 h時(shí)，類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌圈直徑最小，發(fā)酵產(chǎn)抑菌素較少。隨發(fā)酵時(shí)間增加，24 h時(shí)抑菌圈直徑最大，相對(duì)發(fā)酵產(chǎn)抑菌素最多。隨發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，消耗培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有害代謝產(chǎn)物積累，抑菌活性降低。因此，24 h為最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)PLD-01抑菌效果影響Fig.5Effect of fermentation time on PLD-01

2.4.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

由圖6可知，PLD-01菌株在100~260 r·min-1之間均有抑菌圈產(chǎn)生，轉(zhuǎn)速較小時(shí)，空氣流通量較小，阻礙菌體生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)速過(guò)大，空氣流通量較大，可能引起菌體自溶，活菌量減少。轉(zhuǎn)速為180 r·min-1時(shí)抑菌圈直徑最大，產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物最多。因此，最佳搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。

2.4.3 發(fā)酵起始pH對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

由圖7可知，pH 5~9均有抑菌圈產(chǎn)生，PLD-01菌株在pH 5時(shí)，抑菌圈較小，說(shuō)明抑菌活性較弱。在pH 6時(shí)，抑菌圈直徑增加，抑菌活性增強(qiáng)。在pH 7時(shí)，抑菌圈直徑最大，說(shuō)明抑菌活性最大。pH 8~9時(shí)，抑菌圈直徑減小，抑菌活性減弱。由此說(shuō)明過(guò)酸或過(guò)堿環(huán)境均影響細(xì)菌生長(zhǎng)。因此，pH 7為PLD-01最適生長(zhǎng)條件。

2.4.4 發(fā)酵溫度對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01抑菌效果影響

由圖8可知，溫度在25和45℃時(shí)，抑菌圈直徑較小，影響菌株生長(zhǎng)。溫度在30~35℃時(shí)，抑菌圈直徑增大，35℃時(shí)抑菌圈直徑最大，35℃為

PLD-01菌株最適生長(zhǎng)溫度。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)PLD-01抑菌效果影響Fig.6Effect of shaker speed on PLD-01

圖7 pH對(duì)PLD-01抑菌效果影響Fig.7Effect of pH on PLD-01

圖8 溫度對(duì)PLD-01抑菌效果影響Fig.8Effect of temperature on PLD-01

通過(guò)以上試驗(yàn)獲得類(lèi)芽孢桿菌PLD-01產(chǎn)抗菌素最適宜發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間24 h、搖床轉(zhuǎn)速180 r·min-1、發(fā)酵pH 7、發(fā)酵溫度35℃。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化類(lèi)芽孢桿菌PLD-01發(fā)酵條件

2.5.1 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)搖床轉(zhuǎn)速、pH、溫度設(shè)計(jì)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)作響應(yīng)面分析（見(jiàn)表1），在中心值重復(fù)3次試驗(yàn)，分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5.2 模型建立以及統(tǒng)計(jì)分析

利用Minitab15軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)二次多元回歸擬合，獲得抑菌圈直徑值對(duì)編碼自變量A、B、C二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=15.8000+0.10000A+0.350000B+0.40000C-1.85000A2-0.75000B2-1.25000C2-0.770000AB+ 0.300000AC-0.600000BC（1）

對(duì)回歸模型（1）方差分析（見(jiàn)表3），結(jié)果表明，模型極顯著（P<0.01）?；貧w模型R-Sq=98.44%，決定系數(shù)為0.9844，說(shuō)明該模型可解釋98.44%變化。因此模型可分析和預(yù)測(cè)PLD-01不同條件下生長(zhǎng)情況。

由表4可知，一次項(xiàng)中影響極顯著因素為C，顯著因素為B。二次項(xiàng)A2、B2、C2和AB、BC均為顯著影響因子。其他項(xiàng)不顯著，說(shuō)明起始pH和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)類(lèi)芽孢桿菌PLD-01影響較大。在所選各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)結(jié)果影響排序C>B>A，即發(fā)酵溫度>起始pH>搖床轉(zhuǎn)速。3個(gè)因素中，搖床轉(zhuǎn)速和起始pH、溫度和起始pH間存在較顯著交互作用。失擬項(xiàng)F值為2.17，不顯著。

根據(jù)回歸方程各項(xiàng)方差分析（見(jiàn)表3），由于失擬項(xiàng)誤差較小，方程擬合情況良好，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)分析和預(yù)測(cè)結(jié)果。

表2 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 2Response surface analysis program and test results

表3 回歸模型方差分析Table 3Analysis of Variance in Regression Model

表4 回歸方程系數(shù)和顯著性試驗(yàn)結(jié)果Table 4Regression equation coefficients and significance test results

2.5.3 等值線圖和響應(yīng)分析

利用Minnitab15軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)作二次多元回歸擬合，獲得二次回歸方程響應(yīng)面（見(jiàn)圖9~11）?？梢?jiàn)，溫度與pH、pH與搖床轉(zhuǎn)速對(duì)PLD-01抑菌效果交互作用顯著，而溫度與搖床轉(zhuǎn)速對(duì)PLD-01抑菌效果交互作用不顯著。

利用Minitab 15軟件，通過(guò)BOX-Behnken試驗(yàn)結(jié)果分析，確立搖床轉(zhuǎn)速，起始pH，溫度3個(gè)影響因素優(yōu)化點(diǎn)（A、B、C）即（179.19、7.38、36.11）此時(shí)Y值取最大值15.86，復(fù)合合意性達(dá)到96.2%（見(jiàn)圖12）。

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面分析獲得PLD-01最佳培養(yǎng)條件，做3次平行試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。獲得抑菌圈直徑為15.7 mm，與預(yù)測(cè)15.8 mm基本相符，證實(shí)響應(yīng)面分析法可靠。

圖9 溫度與起始pH交互作用對(duì)PLD-01抑菌效果影響Fig.9Effect of temperature and initial pH on PLD-01

圖10 搖床轉(zhuǎn)速與溫度交互作用對(duì)PLD-01抑菌效果影響Fig.10Effect of shaker speed and temperature on PLD-01

圖11 搖床轉(zhuǎn)與起始pH交互作用對(duì)PLD-01抑菌效果影響Fig.11Effect of shaker speed and initial pH on PLD-01

圖12 最佳優(yōu)化條件Fig.12Best condition

3 結(jié)果與討論

類(lèi)芽孢桿菌作為生物防腐劑，產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，培養(yǎng)基組成及適宜發(fā)酵條件影響抑菌圈直徑，即產(chǎn)生抗菌素量。培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)中，確定1%葡萄糖為碳源，2%大豆粉為氮源，KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽，此時(shí)抑菌圈平均直徑為14.5 mm，優(yōu)化前平均直徑12.2 mm，結(jié)果較優(yōu)化前提高1.19倍。而文鳳云等優(yōu)化后培養(yǎng)基組成為蛋白胨、酵母浸出粉，MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O為無(wú)機(jī)鹽，預(yù)測(cè)抑菌圈直徑為13.3 mm[13]?？赡芤?yàn)榇蠖狗圩鳛榈磿r(shí)利于抗菌物質(zhì)合成，優(yōu)于蛋白胨。因此確定最佳培養(yǎng)基為1%葡萄糖，2%大豆粉，KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽。在培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)中，pH 7抑菌效果最佳，與林茂茲等研究多粘類(lèi)芽孢桿菌抑菌效果結(jié)果一致[14]。pH過(guò)高或過(guò)低均不利于抗菌素產(chǎn)生，影響抑菌效果。搖床轉(zhuǎn)速在180 r·min-1時(shí)抑菌效果較好，與陳小煌等對(duì)類(lèi)芽孢桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果基本一致[15]，說(shuō)明此時(shí)溶氧量利于產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。溫度為35℃時(shí)抑菌效果較好，與程愛(ài)芳在優(yōu)化多粘類(lèi)芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶條件結(jié)果一致[16]，說(shuō)明35℃適宜類(lèi)芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)，可以產(chǎn)生較多抗菌物質(zhì)。

綜上所述，類(lèi)芽孢桿菌PLD-01生長(zhǎng)適應(yīng)性較強(qiáng)，優(yōu)化后抑菌圈直徑是優(yōu)化前1.3倍，達(dá)到預(yù)期效果。根據(jù)單因素試驗(yàn)，獲得最佳培養(yǎng)基配方為大豆粉2%，葡萄糖1%，無(wú)機(jī)鹽為KH2PO4。綜合考慮搖床轉(zhuǎn)速、pH、溫度3個(gè)主要因素對(duì)菌體生長(zhǎng)影響，采用響應(yīng)面分析方法，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到菌體生長(zhǎng)模型，模型各因素最優(yōu)水平以及最佳條件發(fā)酵條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，類(lèi)芽孢桿菌PLD-01最佳培養(yǎng)條件為：溫度為36℃、發(fā)酵液pH 7、搖床轉(zhuǎn)速179 r·min-1。雖然類(lèi)芽孢桿菌不同菌株最佳生長(zhǎng)條件存在差異，但優(yōu)化PLD-01生長(zhǎng)條件對(duì)其他菌株具有參考價(jià)值。

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PaenibacillusPLD-01 was used to ferment to produce antibiotics,and optimized its optimal production conditions,the aim is to apply antibiotics to the field of food preservatives.On the basis of single factor test,use Minitab 15 software for data analysis and mapping,obtained optimal medium composition and optimal culture conditions ofPLD-01:the best medium forPLD-01 was 1% glucose,2%soybean meal,0.2%KH2PO4as inorganic salt.At the initial pH 7,the fermentation temperature was 36℃and the shaking speed was 179 r·min-1,the bacteriostatic effect was the best, and the diameter of the inhibition zone was 15.7 mm.

response surface methodology;paenibacillus;fermentation;biological preservatives; ablastin

TS201.3

A

1005-9369（2017）06-0033-10

時(shí)間2017-6-26 17:42:14[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170626.1742.022.html

Optimization ofPLD-01 producing antibiotics fermentation conditions

by response surface methodology/ZHANG Zhi1,WANG Lu1,YIN Wenzhe2,LI Jie3

(1.School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China;2.The Second Affiliated Hospital,Harbin Medical university,Harbin 150086,China;3.School of Life Sciences, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

2017-04-07

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃重大項(xiàng)目（GA15B203）

張智（1964-），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向發(fā)酵工業(yè)、功能食品。E-mail:ldzhangzhi@163.com

張智,王露,尹文哲,等.響應(yīng)面法優(yōu)化PLD-01生產(chǎn)抑菌素發(fā)酵條件的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(6):33-42.

Zhang Zhi,Wang Lu,Yin Wenzhe,et al.Optimization ofPLD-01 producing antibiotics fermentation conditions by response surface methodology[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(6):33-42.(in Chinese with English abstract)