趙 宇，沈 佳，李 季，張 璐，婁群峰，陳勁楓

(作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室·南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院 南京 210095)

黃瓜線粒體DNA指紋圖譜的構建及其在雜交品種純度鑒定中的應用

趙 宇，沈 佳，李 季，張 璐，婁群峰，陳勁楓

(作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室·南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院 南京 210095)

為實現(xiàn)黃瓜雜交種子純度的快速鑒定，利用分子標記技術構建‘長春密刺’等21份黃瓜品種的線粒體DNA指紋圖譜。結果表明：從69對線粒體引物中，共篩選出13對在21份黃瓜品種中呈現(xiàn)出多態(tài)性的引物。同時，基于親本材料的指紋圖譜，利用引物mtSSR 4對‘南水3號’商品種子進行檢測，分子標記鑒定純度為95.7%，且真、假雜種編號與田間形態(tài)鑒定結果一致。黃瓜線粒體DNA指紋圖譜的構建，不僅能為‘南水3號’等雜交種的純度檢測工作提供新的技術指導，還可為黃瓜品種的鑒定、遺傳親緣關系分析等提供一種新的方法。

黃瓜；純度鑒定；分子標記；線粒體；指紋圖譜

DNA指紋圖譜是指某一品種具有的不同于其他品種的特異DNA片段，其表現(xiàn)方式為一系列電泳圖譜的差異，是鑒別不同品種和品系以及子代與親本遺傳相關方面的有力工具[1]。隨著各種DNA分子標記的出現(xiàn)，已經(jīng)構建了部分作物的RFLP指紋圖譜[2]、RAPD 指紋圖譜[3]、AFLP 指紋圖譜[4]、SSR指紋圖譜[5-6]、ISSR指紋圖譜[7-8]、SRAP指紋圖譜[9-10]和SNP指紋圖譜[11]等。RFLP技術具有共顯性，但是檢測時間長；RAPD技術成本低，但是不能鑒定雜合子；AFLP技術多態(tài)性豐富、結果穩(wěn)定可重復，但是該技術已經(jīng)申請專利，在應用中具有局限性；SSR技術與AFLP技術相比，多態(tài)性更強，但是微衛(wèi)星標記的開發(fā)具有一定困難；ISSR技術穩(wěn)定性和多態(tài)性都很好，但一般為顯性標記，不能鑒定雜合子；SRAP技術可顯示大量的共顯性標記；SNP技術可以快速地進行基因型分型。

根據(jù)已有報道，黃瓜線粒體DNA表現(xiàn)為嚴格的父系遺傳[12-13]，并且黃瓜線粒體基因組巨大，達到了1 685 kb，且短的分散重復序列占黃瓜線粒體基因組的13%[14]，這都為線粒體標記的開發(fā)和應用奠定了基礎。線粒體DNA指紋圖譜是根據(jù)不同品種間線粒體DNA多態(tài)性構建的，對于品種鑒定、遺傳多樣性研究、種子純度分析、遺傳親緣關系分析等具有同樣重要的意義。尤其對于線粒體父系遺傳物種而言，它能快速檢測雜交種子純度，追蹤花粉污染源。

隨著黃瓜良種培育工作的迅速開展，市場上出現(xiàn)了許多同名異物和同物異名現(xiàn)象，品種混亂問題給黃瓜生產(chǎn)造成了很大損失。分子標記技術的迅猛發(fā)展為品種鑒定開辟了一種新的途徑[15]。DNA指紋鑒定技術，以分子標記為基礎，在實際操作過程中具有快速準確、易于自動化的優(yōu)點，通過構建品種DNA指紋圖譜實現(xiàn)品種快速鑒定，已成為未來的發(fā)展趨勢?；邳S瓜核基因組的雙親遺傳特性，RAPD[16-17]、SSR[18-19]、SRAP[20]等分子標記構建的部分黃瓜品種的指紋圖譜已有報道。但是由于黃瓜育種材料遺傳基礎較為狹窄，新育成的品種間遺傳差異越來越小，這就需要更多方法來有效鑒定一些性狀差異小的品種。

筆者首次報道了基于黃瓜線粒體基因組父系遺傳特性構建的黃瓜線粒體DNA指紋圖譜，并以‘長春密刺’等21份黃瓜品種為材料，利用黃瓜線粒體基因組開發(fā)的標記構建了21份黃瓜品種的線粒體DNA指紋圖譜，為黃瓜品種特異性、真實性、純度鑒定、遺傳親緣關系分析等提供了重要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院黃瓜課題組保存的21份黃瓜種質(zhì)為試驗材料（表1），2015年春季定植于南京農(nóng)業(yè)大學江浦實驗基地。

表1 21份黃瓜種質(zhì)材料

1.2 黃瓜基因組DNA提取及檢測

取苗期新鮮幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA，用1%（ω）的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 黃瓜線粒體引物多態(tài)性篩選

試驗所用引物為南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院黃瓜課題組開發(fā)的69對線粒體引物，對21份黃瓜品種進行擴增分析，從中選取穩(wěn)定擴增且具有多態(tài)性的用于構建線粒體DNA指紋圖譜。

以‘長春密刺’等21份黃瓜品種的基因組DNA為模板，PCR 反應體系為：2×Mix 12 μL，滅菌ddH2O 9 μL，正反向 10 μmol·L-1引物各 1 μL，模板50 ng·μL-1DNA 1 μL，總體積 24 μL，擴增程序優(yōu)化后確定為：94℃預變性2 min，94℃變性20 s，68℃退火1 min，72℃延伸30 s，共6個循環(huán)，94℃變性20 s，58℃退火 1 min，72℃延伸 30 s，共 9個循環(huán)，94℃變性20 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共 13個循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存；PCR擴增結束后采用8%（ω）聚丙烯酰胺凝膠，180 V電泳3 h后檢測PCR擴增產(chǎn)物，銀染顯色后記錄數(shù)據(jù)，拍照采集電泳圖像。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的電泳結果，在凝膠的某個相同遷移率位置上，有清晰條帶記為1，無條帶記為0，模糊不清的條帶不予統(tǒng)計，依據(jù)分子質(zhì)量從小到大的順序進行統(tǒng)計。應用NTSYS-pc軟件生成聚類圖。

1.5 雜種1代群體驗證

‘南水3號’是以‘13479 F’為母本和‘13560 F’為父本雜交獲得的雜種1代。從2014年秋季南京農(nóng)業(yè)大學黃瓜課題組生產(chǎn)的‘南水3號’商品種子中隨機取70粒，父母本各取1粒，于2015年春季定植于南京農(nóng)業(yè)大學江浦實驗基地。分別提取黃瓜基因組DNA，利用在親本中具有多態(tài)性的1對線粒體引物進行種子純度鑒定，3次重復。將分子鑒定結果與田間形態(tài)鑒定結果進行比較，驗證2種方法的一致性。

2 結果與分析

2.1 線粒體引物擴增分析

從69對線粒體引物中篩選出13對帶型清晰、多態(tài)性較好的引物用于分析21份黃瓜品種的多態(tài)性。13對引物都位于黃瓜線粒體第1條環(huán)上，每對引物可以檢測到1～3個數(shù)目不等的多態(tài)性片段，共26個多態(tài)性片段，擴增產(chǎn)物片段在100～400 bp之間，引物數(shù)據(jù)見表 2。mtSSR5、mtSSR10、mtSSR52、mtindels87可以擴增出3種多態(tài)性片段，mtSSR4、mtSSR46、mtSSR63、mtindels73、mtindels79 可以擴增出 2 種多態(tài)性片段，mtSSR40、mtindels81、mtindels82、mtindels83可以擴增出1種多態(tài)性片段。通過上述結果可以看出，黃瓜線粒體基因組具有較高的多態(tài)性。

表2 線粒體基因組多態(tài)性引物及其序列

2.2 指紋圖譜構建

采用以上13對引物對21份黃瓜材料進行指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)每對引物都只能將21份黃瓜材料分為若干個組，沒有任何一對引物能將21份黃瓜材料完全區(qū)分。例如，21份黃瓜材料，可被引物mtSSR10分成3組（圖1-A），可被引物mtindels81分成2組(圖1-B)。因此，需要對引物進行組合才能完全鑒定21份黃瓜材料。

圖1 mtSSR10（A）和mtindels81（B）對21份黃瓜品種資源的擴增結果

以1代表擴增出某個多態(tài)性DNA帶，0代表未擴增出某個多態(tài)性DNA帶，對擴增片段從小到大進行轉換，將這些圖譜轉換為由1和0組成的字串。根據(jù)上述13對線粒體多態(tài)性引物的0、1統(tǒng)計結果，構建了21份黃瓜品種線粒體DNA數(shù)字化指紋圖譜（表3），通過不同的字串排列順序，鑒定出不同黃瓜品種。

表3 21份黃瓜品種線粒體DNA數(shù)字化指紋圖譜

2.3 聚類分析

通過UPGMA聚類分析，得到21份黃瓜品種的遺傳關系樹狀圖(圖2)。以遺傳相似系數(shù)0.71為標準，可將21份黃瓜品種分為4個類群：A、B、C、D類。A 類包括‘長春密刺’‘EC5’‘朝優(yōu) 3 號’‘L8’‘歐美佳’‘P01’‘二早子’‘8419s’‘JC3’‘樹春美雅’‘13560F’‘翠玉八號’；B 類包括‘平望（G）’‘JC1’‘寧佳 7 號’‘407 Beit Alpha’‘Homenmade Pickles’；C 類包括‘Amir’‘Boothbyls Blonde’‘13479F’；D 類只有‘Hardwickii’。通過上述結果可以看出，華北型黃瓜集中在A類，華南型和歐洲溫室型黃瓜也主要集中在A類，加工型黃瓜主要集中在B類，野生型‘Hardwickii’親緣關系遠，單獨聚為D類。聚類結果說明黃瓜品種的親緣關系與地域分布有較為明顯的關系，同一栽培區(qū)域育成的品種在不同程度上聚在一起。

2.4 雜交種純度鑒定

2.4.1 分子標記鑒定結果 ‘南水3號’種子中的假種子主要是母本自交種。很明顯，引物mtSSR4對黃瓜雜交種F1及其親本能利用黃瓜線粒體父系遺傳特性（F1的條帶與父本的是一致的）進行有效區(qū)分（圖3）。擴增電泳結果顯示：67粒種子條帶與父本一致為真雜種，3粒種子條帶與母本一致（泳道17、32、52）即母本自交種，為假雜交種，種子純度為95.7%。

圖2 21份黃瓜品種的聚類結果

2.4.2 田間鑒定結果 ‘南水3號’植株高，瓜條形狀為長棒狀；‘13479 F’植株高度中等，瓜條形狀為圓筒形，在田間易于區(qū)分（圖4）。經(jīng)過田間統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代植株性狀多數(shù)表現(xiàn)一致。70株黃瓜，67株為‘南水 3 號’，3株為‘13479 F’（編號為 17、32、52），純度為95.7%，與分子標記鑒定結果一致，說明可以利用線粒體基因組開發(fā)出來的分子標記檢測黃瓜雜交種子純度。

圖3 mtSSR4對‘南水3號’的純度檢測

圖4 ‘13479F’和‘南水3號’性狀比較

3 討論與結論

目前，利用線粒體基因組開發(fā)的標記已經(jīng)構建了部分水稻[21]、高粱[22]、大豆[23]等作物的指紋圖譜。高等植物線粒體DNA存在多種遺傳方式，有雙親、母系和父系遺傳[24]，其中大多數(shù)為母系遺傳。黃瓜線粒體DNA為父系遺傳，基因組序列大小為1 685 kb，并且基因組中含有約605 kb的重復DNA序列[25-26]。本研究利用黃瓜線粒體基因組標記探索了黃瓜線粒體DNA的多態(tài)性，利用黃瓜線粒體DNA父系遺傳特性，首次構建了‘長春密刺’等21份黃瓜品種的線粒體DNA指紋圖譜，為黃瓜品種鑒別、品種資源評價與保存、種子純度鑒定、遺傳親緣關系分析等研究提供了一種新的方法。

‘翠玉八號’和‘Boothbyls Blonde’在引物mtindels73中具有特征譜帶；‘Hardwickii’分別在引物mtSSR5、mtSSR10、mtSSR46中具有特征譜帶。在進行DNA指紋檢測的過程中，僅采用1個特征引物即可鑒別出相對應的黃瓜品種，簡單方便。然而，就本研究而言，只有‘翠玉八號’‘Boothbyls Blonde’和‘Hardwickii’具有特征引物，鑒別能力有限。本研究的21份黃瓜品種，需要13對線粒體引物進行組合鑒別，然而隨著黃瓜品種數(shù)量的增加，這13個引物組合的鑒別效果可能會逐漸減弱，可根據(jù)具體檢測情況適當增加線粒體引物。

目前市場上廣泛存在黃瓜雜交1代品種，然而人工制種的種子質(zhì)量難以控制，容易出現(xiàn)偽劣種子。雜交種純度低不僅會使品種推廣年限變短，還會導致產(chǎn)量降低，影響農(nóng)民收益。因此，黃瓜雜交種品種純度的鑒定是一項很重要的任務。試驗結果表明可利用本研究構建的黃瓜線粒體指紋圖譜進行黃瓜雜交1代種子純度的快速鑒定，這與李海梅等[27]利用線粒體基因組開發(fā)的4對SSR標記進行種子純度鑒定的結果一致。與核基因組指紋圖譜相比，基于黃瓜線粒體基因組父系遺傳特性構建的指紋圖譜，F(xiàn)1種子純度僅需檢測父本條帶即可。根據(jù)已有報道，黃瓜線粒體DNA表現(xiàn)為嚴格的父系遺傳[12-13]，未出現(xiàn)母系滲漏現(xiàn)象。因此，本文利用引物mtSSR4對‘南水3號’的70粒商品種子進行檢測，該標記的準確率達到了100%。擴大樣本容量后，理論上準確率仍能達到100%。但在實際操作過程中，由于試驗誤差等原因，準確率可能會降低。筆者利用13對線粒體基因組開發(fā)的引物構建了21份黃瓜品種的線粒體DNA指紋圖譜，利用在親本中具有多態(tài)性的引物mtSSR4對雜交種‘南水3號’進行快速的純度檢測，檢測結果與田間形態(tài)學鑒定結果一致，說明利用黃瓜線粒體指紋圖譜進行黃瓜雜交1代種子純度快速鑒定的可靠性強、準確率高。它不僅能為種子純度鑒定提供技術支持，還可以為黃瓜新品種審定和保護提供重要依據(jù)。

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Construction of mitochondrial DNA fingerprinting on cucumber and its application in purity identification of hybrid varieties

ZHAO Yu，SHEN Jia，LI Ji，ZHANG Lu，LOU Qunfeng，CHEN Jinfeng

(State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,Jiangsu,China)

For the purpose of cucumber hybrid seed identification rapidly,molecular markers technology was used to establish mitochondrion DNA fingerprinting for 21 cucumber accessions included‘Changchun Mici’.The results showed that out of the 69 pairs of primers,13 pairs exhibited polymorphism among the 21 cucumber accessions were screened.Additional,using primer mtSSR 4 for purity identification of‘Nanshui3’,the result indicated that the purity was 95.7%,which were consistent with testing results in the field.The constructed mitochondrion DNA fingerprinting of the cucumber variety would not only provide a new technical guidance for the purity identification of the hybrid such as‘Nanshui 3’,but also provide a new method for the identification and genetic relationship analysis of cucumber varieties.

Cucumber;Purity identification;Molecular markers;Mitochondrial;DNA fingerprinting

2016-11-17；

2017-02-03

國家自然科學基金面上項目“CsWHY2基因調(diào)控黃瓜線粒體父系遺傳的作用和機制研究”（31572134）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項“長三角地區(qū)設施蔬菜高產(chǎn)高效關鍵技術研究與示范”（201403032）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［CX（15）1019］；國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0100204-25）；“十二五”國家科技支撐計劃（2013BAD01B04-10）

趙 宇，女，在讀碩士研究生，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術。Tel：025-84396279；E-mail：981225346@qq.com

陳勁楓，男，教授，博導，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術。Tel：025-84396279；E-mail：jfchen@njau.edu.cn