袁玉娟，徐晨偉

（1.江蘇省固體廢棄物資源化高技術研究重點實驗室·南京農(nóng)業(yè)大學 南京 210095；2.南通科技職業(yè)學院 江蘇南通 226007）

枯草芽孢桿菌SQR9促進黃瓜生長的效果

袁玉娟1,2，徐晨偉1,2

（1.江蘇省固體廢棄物資源化高技術研究重點實驗室·南京農(nóng)業(yè)大學 南京 210095；2.南通科技職業(yè)學院 江蘇南通 226007）

在溫室條件下，通過組培試驗和盆栽試驗，探究SQR9促進黃瓜生長的效果。試驗結果表明，在健康水稻土中添加SQR9菌液的處理組1、2、3的地上部分株高分別為CK的1.46、2.21和2.30倍，根系長度比CK分別增加了17%、75%、126%，處理1、2、3的黃瓜干質(zhì)量分別是CK的1.19、1.84、1.91倍。處理組的葉綠素含量和光合速率都有不同程度提高。SQR9在盆栽試驗中能有效促進黃瓜生長。

黃瓜；SQR9；生長；效果

PGPR（plant growth promoting rhizobacteria），泛指生存于植物根際環(huán)境中、能促進植物生長的一類有益細菌。迄今為止，研究比較深入系統(tǒng)的并在生產(chǎn)實踐中推廣應用較多的主要PGPR類細菌有放射土壤桿菌、假單胞桿菌和芽孢桿菌。對PGPR的研究，已日益成為植物病害生防的熱點課題?？莶菅挎邨U菌SQR9是從黃瓜種植發(fā)病區(qū)的健康植株根際分離到的一株微生物，能強烈抑制土傳枯萎病病原真菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum J.H.Owen,FOC)，本試驗通過組培及盆栽試驗，研究SQR9對促進黃瓜植株生長的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 枯草芽孢桿菌SQR9，由南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省固體廢棄物資源化高技術研究重點實驗室篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基。無機培養(yǎng)基，配方如下：826 mg·L-1Ca(NO3)2；607 mg·L-1K2SO4；53 mg·L-1NH4NO3；370 mg·L-1MgSO4；181 mg·L-1KH2PO4；5 mg·L-1EDTA-Fe，Hoagland 微量元素，3.2 g·L-1Phytagel，pH 6.8～7.0。將培養(yǎng)基進行高溫滅菌，滅菌后的培養(yǎng)基在倒入組培瓶（ZP5-330，高107 mm×口徑60 mm×底徑70 mm，容量330 mL）之前加入無菌碘硝基四唑紫(購自阿拉丁試劑公司)至10 mg·L-1，然后在室溫冷卻凝固。

1.1.3 黃瓜品種 供試黃瓜品種為‘津春4號’，由天津黃瓜研究所提供。

1.1.4 供試土壤 未種植過黃瓜的健康水稻土。組培試驗于2009年8月3日至2010年8月24日在南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院組培室中進行；盆栽試驗于2009年9月17日至2009年11月8日在江蘇新天地生物肥料工程中心（南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省固體廢棄物資源化高技術研究重點實驗室）溫室中進行。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 取-70℃保存的SQR9菌液在LB固體平板上活化，取單菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。再以1%的接種量轉接于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、170 r·min-1震蕩培養(yǎng) 24 h，12 000 r·min-1離心，棄上清液，加 100 mL ddH2O制成菌落懸浮液。

1.2.2 無菌黃瓜芽制備 將黃瓜種子消毒，消毒方法：用60℃的溫水浸泡種子并不斷攪拌直至冷卻到室溫，再將種子在無菌環(huán)境下用10%（φ）的H2O2消毒10 min，最后用無菌水漂洗6次。將消毒好的種子放入無菌器皿中在30℃環(huán)境下催芽5 d。將黃瓜芽再次消毒，消毒方法：用70%的酒精浸泡15 s，再用1%的升汞消毒3 min，最后用無菌水漂洗6次，即制備成無菌黃瓜芽。

1.2.3 試驗設計 組培試驗設計：無菌條件下，消毒的黃瓜芽浸泡在SQR9菌液中16 h后作處理，以浸泡在無菌液體培養(yǎng)基中的無菌黃瓜芽作CK。放入組培瓶后在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：28℃、12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)15 d，然后收集黃瓜植株根系制片，觀察培養(yǎng)基顏色變化及植株生長狀況。盆栽試驗設計見表1。

前期營養(yǎng)缽處理：營養(yǎng)缽規(guī)格為高10.2 cm、上口直徑8 cm、底部直徑5 cm，2株幼苗，在溫室中培養(yǎng)，溫度23～30℃，每天按需澆水，每營養(yǎng)缽加入健康水稻土300 g，待幼苗生長出4～5片真葉后移栽至大盆缽中生長。后期盆缽處理：盆缽規(guī)格為外徑24 cm、底徑18.5 cm、高20.6 cm，每缽1株苗，設置30個重復，每10個盆缽1個區(qū)組，分3個區(qū)組，每缽加入健康水稻土壤5 kg，培育在溫室中，溫度23～30℃，每d按需澆水，每10 d用100 mL菌液強化1次。

表1 盆栽試驗處理

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 黃瓜移苗后，每隔10 d記錄植株生長狀況。

植株長度測量方法：將黃瓜苗小心從盆缽中取出，用蒸餾水沖洗去除根部的土壤，然后用吸水紙吸干水分，將黃瓜苗平鋪于吸水紙上，測量植株高度。截取黃瓜根部，用蒸餾水沖洗根部土壤，采用根系掃描儀測量地下部長度，掃描儀為EPSON perfection Various V700 photo。

光合作用及葉綠素含量測定：凈光合速率晴天用LI-6400(Li-co Ltd.USA)光合作用測定儀測定；用葉綠素儀SPAD-502(Minolta,Japan)分別測定頂端第一片葉的葉綠素含量。

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel處理，采用SPSS 11.5進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理根際顏色變化

從圖1可以看到，用SQR9菌液浸泡的黃瓜芽，其根系在生長過程中始終伴隨著強烈的紅色反應，而CK則沒有。碘硝基四唑紫在培養(yǎng)基中本來是無色的，當遇到微生物活動后會變紅色。在黃瓜生長過程中，根際始終伴隨強烈的紅色反應，表明SQR9能在黃瓜根際沿著根的生長方向不斷生長繁殖。經(jīng)過SQR9菌液浸泡后，黃瓜苗長勢明顯優(yōu)于CK處理。

圖1 不同處理下黃瓜根際顏色反應

2.2 不同處理對植株地上部高度的影響

從植株的地上部高度來看，不同處理存在顯著差異（圖2）。處理1、2、3的地上部株高分別為CK的1.46、2.21和2.30倍，而處理2和3間差異不顯著。結果表明，加入SQR9菌液能顯著促進植株生長。

2.3 不同處理對植株根系長度的影響

不同處理對黃瓜根系長度的影響如圖3所示，與CK相比，處理1、2、3的根系長度有顯著的提高；處理1、2、3的根系長度分別比CK增加了17%、75%、126%。處理2、3都表現(xiàn)出了良好的促進生長的能力，僅盆缽用SQR9強化的處理2略低于營養(yǎng)缽和盆缽都用SQR9強化的處理3，而僅營養(yǎng)缽用SQR9強化的處理1的促進生長的效果顯著低于處理 2和 3。

圖2 不同處理對黃瓜地上部高度的影響

圖3 不同處理對黃瓜根系長度的影響

2.4 不同處理對黃瓜干質(zhì)量的影響

不同處理對黃瓜生物量的影響如圖4所示，與CK相比，處理1、2、3的黃瓜干質(zhì)量有顯著的提高；處理1、2、3的黃瓜干質(zhì)量分別是CK的1.19、1.84、1.91倍。僅營養(yǎng)缽用SQR9強化的處理1略低于處理2和3，而營養(yǎng)缽和盆缽用SQR9共同強化的處理3與僅盆缽用SQR9強化的處理2間沒有顯示出顯著的差異。

圖4 不同處理對黃瓜干質(zhì)量的影響

2.5 不同處理對黃瓜葉綠素含量的影響

葉綠素是重要的光合作用物質(zhì)，葉綠素含量的多少在一定程度上反映了植物光合作用強度的高低，從而影響植物的生長。處理1、2、3葉綠素含量相比CK均有升高（圖5）。與CK相比，處理1沒有顯著差異，處理2、3葉綠素含量分別升高了54%、91%，差異均達到顯著水平。

圖5 不同處理對黃瓜葉綠素含量的影響

2.6 不同處理對光合速率的影響

不同處理光合速率變化由圖6可知，適宜環(huán)境條件下，不同處理光合速率存在顯著差異。CK的光合速率明顯低于其他處理，處理1、2、3較CK分別高出了31%、54%、138%，其中處理3是CK的2.38倍。

圖6 不同處理對黃瓜光合速率的影響

3 討論

枯草芽孢桿菌SQR9是本實驗室分離篩選到的一株高效拮抗菌，該菌株促進植物生長的效果已經(jīng)被證實[1]，梁曉琳等[2]對設施番茄的研究表明，施用含菌株SQR9的復合微生物肥料能夠有效提高單季設施番茄的產(chǎn)量。

筆者通過建立“Phytagel-植物-PGPR”限菌系統(tǒng)來進一步驗證其促進生長的能力，排除了其他因素的干擾而進行組培試驗，能夠較好地研究PGPR菌株在根部的定殖和擴展方式，觀察了SQR9對黃瓜生長狀況的影響。而在制樣過程中，培養(yǎng)基又很易被洗掉，不影響試驗結果的觀察。同時，也補充了盆栽試驗，進一步驗證SQR9促進黃瓜生長的能力。

其他研究表明，在無機培養(yǎng)基上，微生物的活動由于缺乏營養(yǎng)物質(zhì)會受到限制[3]。本試驗采用無機培養(yǎng)基，觀察SQR9在黃瓜根際的活動，試驗結果表明，SQR9處理的黃瓜根系在整個生長過程中都伴隨強烈的紅色反應，SQR9處理的黃瓜苗長勢優(yōu)于CK處理（圖1）。加入碘硝基四唑紫的培養(yǎng)基中本來是無色的，當遇到微生物活動后會變紅色。根際的顏色變化表明，SQR9能在黃瓜根系生長過程中沿著根的生長方向不斷滋生，并在根系表面大量繁殖，形成生物墻。因為培養(yǎng)基中基本全為無機營養(yǎng)，細菌的生長受到限制，而在培養(yǎng)基中SQR9能在黃瓜根際大量繁殖，且黃瓜生長旺盛，表明SQR9能利用黃瓜根系分泌物提供的碳源、氮源進行繁殖，同時促進了黃瓜的生長。

為了研究菌株的促進生長的效果，本試驗分別測定了處理植株的株高和干質(zhì)量，其中地上部株高分別為CK的1.46、2.21和2.30倍（圖2），植株干質(zhì)量分別是 CK 的 1.19、1.84、1.91倍（圖 4）。處理 2、3間差異都不顯著，而處理1和處理2、3間存在顯著差異。結果表明，枯草芽孢桿菌SQR9在黃瓜生長前期不能明顯的提高其株高，但在生長后期卻表現(xiàn)明顯。這可能是由于前期在室內(nèi)育苗，受環(huán)境條件的限制，SQR9未能及時占領有利生態(tài)位點并適應根際微生態(tài)環(huán)境，而后期由于土壤、水分、溫度的適宜，SQR9充分發(fā)揮了其促進生長的效應。

Sánchez-Cailderón 等[4]指出，缺磷時主根生長受到抑制，而營養(yǎng)元素在側根發(fā)生和生長中起到了很大的作用[5-7]，缺素環(huán)境中根系的生長因營養(yǎng)脅迫發(fā)生變化。本試驗研究結果表明，加入SQR9菌液的處理1、2、3的根系長度分別比CK增加了17%、75%、126%（圖3）。說明SQR9能夠給黃瓜提供營養(yǎng)元素，促進了黃瓜根系的生長。

葉綠素主要存在于植物的葉片中，絕大多數(shù)葉綠素在光反應中吸收光能并將光能轉變成電能，所以，葉片中葉綠素含量與光反應有很大關系，植株葉片葉綠素含量增加，使光反應加強，提高植物的光合速率，加快碳水化合物的合成以滿足植物加快生長的需要[8]。所以說植物體內(nèi)葉綠素含量的高低直接影響光合作用的強弱，對植物的生長起決定性作用。從測定結果可以看出（圖5），僅營養(yǎng)缽加入SQR9的處理1的葉綠素水平稍有提高，而盆缽加入SQR9的處理2、3的葉綠素含量較CK分別升高了54%、91%，差異均達到顯著水平。葉片中葉綠素的上升也直接影響了植株的光合作用。圖6也顯示，黃瓜光合速率與葉綠素含量成正相關。SQR9顯著地提高了葉片葉綠素含量，促進了植株光合作用，從而間接地促進了黃瓜的生長。

前人研究總結，促進生長的作用機制包括菌體產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)促進植物生長，產(chǎn)生的代謝物質(zhì)抑制或阻抗根部病原菌的發(fā)展，間接促進植物生長[9]。細菌可以通過多種方式促進植物生長，如生物固氮[10]，產(chǎn)生植物激素[11-13]，通過誘導寄主植物產(chǎn)生植物激素、改善植物對礦物質(zhì)的利用率[14]，通過改變寄主植物對霜凍等有害環(huán)境條件[15]及有害病原生物的敏感性進而防治植物病害的發(fā)生或誘導作物對可變環(huán)境條件的抗性等。SQR9以何種方式促進黃瓜的生長，還有待于進一步研究。

4 結論

由本實驗室篩選出的SQR9菌株能夠在黃瓜根際成功定殖，對黃瓜生長有促進作用。單獨施用SQR9菌液，能夠促進黃瓜植株的生長，黃瓜植株的株高、干質(zhì)量、葉綠素含量和光合速率顯著大于CK處理。

[1] 袁玉娟．Bacillus subtilis SQR9的黃瓜促生和枯萎病生防效果及其作用機制研究[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2011．

[2] 梁曉琳，孫莉，張娟，等．利用Bacillus amyloliquefaciens SQR9研制復合微生物肥料[J]．土壤，2015，47（3）：558-563．

[3] NING L，XUE C，HUANG Q W，et al．Development of a mode of application of bio-organic fertilizer for improving the biocontrol efficacy to Fusarium wilt[J]．BioControl，2010，55（5）：673-683．

[4] SáNCHEZ-CALDERóN L，LóPEZ-BUCIO J，CHACóNLóPEZ A，et al．Phosphate starvation induces a determinate developmental program in the roots of Arabidopsis thaliana[J].Plant Cell Physiol，2005，46：174-184．

[5] JOSéL B，ALFREDO C R，LUIS H E．The role of nutrient availability in regulating root architecture[J]．Current Opinion in Plant Biology，2003，6：280-287．

[6] FORDE B，LORENZO H．The nutritional control of root development[J]．Plant and Soil，2001，232：51-68．

[7] 王樹才，徐郎萊，夏凱，等．側根的發(fā)生及其激素調(diào)控[J]．植物學通報，2003，20（2）：129-136．

[8] 張樹生，楊興明，黃啟為，等.施用氨基酸肥料對連作條件下黃瓜的生物效應及土壤生物性狀的影響[J].土壤學報，2007，(4)：689-694.

[9] JATALA P．Biological control of plant-parasitic nematodes[J]．Annual Review of Phytopathology，2003，24（1）：453-489．

[10]ADHIKARI T B，JOSEPH C M，YANG G，et al．Evaluation of bacteria isolated from rice for plant growth promotion and biological control of seedling disease of rice[J]．Canadian Journal of Microbiology，2001，47（10）：916-924．

[11] BROWN M ．Seed and root bacterization[J]．Annual Review of Phytopathology，2003，12（1）：181-197．

[12] BARBIERI P，GALLI E．Effect on wheat root development of inoculation with an Azospirillum brasilense mutant with altered indole-3-acetic acid production[J]．Research in Microbiology，1993，144（1）：69-75．

[13] HOLLAND M A ．Occam’s razor applied to hormonology（Are cytokinnins produced by plants?）[J]．Plant Physiology，2002，115（3）：865-868．

[14] DAVISON J．Plant beneficial bacteria[J]．Nature Biotechnology，1988，6（6）：282-286．

[15] XU H，GRIFFITH M，PATTEN C L，et al．Isolation and characterization of an antifreeze protein with ice nucleation activity from the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2[J]．Canadian Journal of Microbiology，1998，44（1）：64-73．

Effects of SQR9 on growth promotion of cucumber

YUAN Yujuan1,2,XU Chenwei1,2

（1.Jiangsu Provincial Key Lab for Organic Solid Waste Utilization，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，Jiangsu，China；2.Nantong College of Science and Technology，Nantong 226007，Jiangsu，China）

In order to investigate the effects of SQR9 on cucumber growth,tissue culture and pot experiments were carried out.The results showed that the growth of cucumber could be effectively promoted by the addition of SQR9.The plant height of treatments 1,2 and 3 was 1.46,2.21 and 2.30 times higher than CK.The root length increased 17%,75%and 126%,and the dry weight of cucumber was 1.19,1.84 and 1.91 times heavier than CK,respectively.Meanwhile,the chlorophyll content and photosynthetic rate of treatments were higher than CK.In conclusion,SQR9 showed significant effects on cucumber growth in pot experiment.

Cucumber;SQR9;Growth;Effects

2016-07-30；

2016-12-29

南通市科技計劃項目——利用貝殼粉有機肥生物調(diào)理劑修復連作大棚土壤的研究（MS12015037）；2017江蘇省掛縣強農(nóng)富民工程項目

袁玉娟，女，碩士，主要從事植物營養(yǎng)與病害研究。E-mail:yyj2659@sohu.com