羅教秀， 儲(chǔ) 兵， 曹曉珊， 陳應(yīng)智， 吳師珍

(中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科， 廣東 中山 528403)

免疫熒光和幾種特殊染色在腎活檢病理診斷中的應(yīng)用*

羅教秀， 儲(chǔ) 兵*， 曹曉珊， 陳應(yīng)智， 吳師珍

(中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科， 廣東 中山 528403)

目的：分析免疫熒光染色及其他幾種特殊染色法在腎活檢病理診斷中的應(yīng)用效果。方法：臨床納入58例我院2014年9月至2016年9月期間收治的慢性腎臟疾病患者作為研究對象，所有患者均進(jìn)行腎穿刺活檢，穿刺取得組織采用石蠟制片，分別采用免疫熒光法、六胺銀染色法、甲醇剛果紅染色法、黏蛋白染色法(PAS)以及Masson三色染色，對比不同方法染色的結(jié)果。結(jié)果：不同類型腎病患者中，免疫熒光染色中狼瘡性腎病中IgA、IgM、IgG、C3以及Clq診斷陽性率明顯高于IgA腎病和膜性腎病患者，P<0.05。在不同染色方法的對比中發(fā)現(xiàn)，免疫熒光染色法在腎病檢測IgA、IgM、IgG、C3以及Clq診斷陽性率明顯低于其他染色方法的診斷率，P<0.05。其他染色方法診斷率均無差異，P>0.05。結(jié)論：免疫熒光染色相對于其他染色方式對腎活檢病理診斷率稍低，臨床上推薦采用其他特殊染色方法對腎組織進(jìn)行病理診斷。

免疫熒光； 六胺銀； 甲醇剛果紅； 黏蛋白染色； Masson三色染色診斷

腎活檢組織病理檢查包括免疫病理、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡等，其中免疫病理檢查常采用石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色[1]。雖然臨床研究顯示冰凍切片相對于石蠟切片來說免疫組化染色敏感性、特異性更高，但由于冰凍切片對溫度要求高，且運(yùn)送條件苛刻，組織不容易保存[2]，本文采用石蠟切片進(jìn)行免疫熒光染色以及其他幾種特殊染色，觀察不同染色方法對腎活檢組織病理的診斷作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本次選取58例我院2014年9月至2016年9月期間腎內(nèi)科收治的慢性腎臟疾病患者作為研究對象，其中男性患者34例，女性患者24例，年齡28～76歲，平均年齡(51.2±4.3)歲。病理類型：IgA腎病患者12例，膜性腎病患者9例，狼瘡性腎病患者37例。

1.2 方 法

1.2.1 準(zhǔn)備工作：所有患者均采用腎活檢進(jìn)行檢查，取腎活檢標(biāo)本脫水、浸蠟等制成石蠟切片，采用10%福爾馬林于4℃冰箱中固定24h。 ①玻片：重酪酸清潔液浸泡載玻片24h，自來水洗凈后采用蒸餾水浸泡24h，再使用無水酒精浸泡24h，最后撈出烘干，43℃水浴展片，57℃下干燥24h，備用。②配備PBS緩沖液，將PBS粉劑溶于1000mL蒸餾水中，充分?jǐn)嚢璨㈧o置，制成PBS緩沖液。③稀釋抗體：5uL抗體加入45uLPBS緩沖液稀釋，對抗體IgA、IgM、IgG、C3以及Clq進(jìn)行檢測。④組織脫水包埋切片，免疫熒光1μm厚切片，10張用防脫片劑(多聚賴氨酸)處理過載玻片進(jìn)行撈片，置60℃烤箱烤片、備用。幾種特殊染色2～3μm ，5張用上述處理過的玻片撈片，置60℃烤箱烤片、備用。

1.2.2 免疫熒光染色法：①脫蠟至水：二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，20min/次，進(jìn)行2次。梯度酒精至水，每個(gè)步驟進(jìn)行5min。②抗原修復(fù)：采用由武漢博士德公司生產(chǎn)的檸檬酸(PH為6.0)進(jìn)行修復(fù)，微波熱修復(fù)，3min中火，停2min，再3min低火。取出切片后自然冷卻至室溫，采用北京中杉公司生產(chǎn)的胰酶消化，在37℃水浴中恒溫放置15min。③滴加抗體：用潔凈吸水紙擦去切片組織外蒸餾水，馬克筆在載玻片背面圈出組織部分，將50uLFITC標(biāo)記兔抗人免疫球蛋白抗IgA、IgM、IgG以及補(bǔ)體抗體C3、Clq稀釋液滴加至組織上，使抗體稀釋液完全覆蓋標(biāo)本組織。④濕盒孵育：滴加了抗體稀釋液的切片平放于濕盒中，避光后置于7℃冰箱中過夜孵育，時(shí)間為24h。⑤沖洗：孵育后采用PBS沖洗3次，5min/次。甘油封片在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3 六胺銀染色法:工作液配置：50mL硼砂溶液、六次甲基四胺銀粉劑。將硼砂溶液倒入六次甲基四胺銀粉劑瓶內(nèi)，搖勻2min，再將六次甲基四胺銀溶液倒入硼砂溶液瓶，重復(fù)三次上述步驟，保證粉劑充分溶解，得到工作液。染色步驟：①將工作液放入62℃恒溫水浴箱預(yù)熱。②切片脫蠟至水。③高碘酸溶液氧化標(biāo)本15min，流水沖洗6遍，5min/遍。④切片放入62℃六胺銀工作液中30min，保證溫度為62℃恒溫，至黃棕色切片出現(xiàn)黑色反應(yīng)時(shí)取出，蒸餾水洗滌后鏡下檢查。⑤流水沖洗。⑥硫代硫酸鈉溶液處理3min，流水沖洗。⑦M(jìn)ayer蘇木素染色細(xì)胞核5min。⑧流動(dòng)自來水沖洗3min并甩干。⑨伊紅染液復(fù)染1min。⑩梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.4 甲醇剛果紅染色法：①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。②甲醇剛果紅染液染色20min。③堿性酒精分化液分化標(biāo)本30s。④水洗5min。⑤Mayer蘇木素染色細(xì)胞核2min，水洗5min。⑥常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.5 黏蛋白染色法(PAS)：①切片脫蠟至水。②蒸餾水洗2min。③高碘酸溶液氧化10min。④充分蒸餾水洗滌，吸水紙吸干。⑤雪夫試劑染色15min。⑥流動(dòng)自來水沖洗10min。⑦M(jìn)ayer蘇木素染色細(xì)胞核5min。⑧流動(dòng)自來水沖洗3min并甩干。⑨95%乙醇和無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.6 Masson三色染色法：①將切片脫蠟至水后置入Bouin氏固定液中室溫過夜(18～24h)。②流水沖洗至切片上的黃色消失。③Weigert鐵蘇木素染色10min，流水稍洗。④1%鹽酸酒精分化，流水沖洗5min。⑤麗春紅酸性品紅染5min，流水銷沖洗。⑥磷鉬酸溶液5min，苯胺藍(lán)染液復(fù)染5min。⑦1%冰醋酸1min，95%酒精、無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 觀察指標(biāo)：觀察直接免疫熒光法、六胺銀染色法、甲醇剛果紅染色法、PAS以及Masson三色染色液染色的結(jié)果，判斷陽性率情況。陽性判斷情況[3]，①免疫熒光法，分為 -、±、+、++、+++、++++，-：陰性，±：低倍鏡下不顯，高倍鏡下似乎可見；+：低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下可見；++：低倍鏡下可見，高倍鏡下較清晰；+++：低倍鏡下較清晰，高倍鏡下耀眼；++++：低倍鏡下耀眼，高倍鏡下刺眼。++及以上為陽性。②六胺銀染色：腎小球囊基底膜和腎毛細(xì)血管球基底膜呈黑色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，背景粉紅色。③剛果紅染色：細(xì)胞核呈藍(lán)色，基底膜藍(lán)色，淀粉樣物質(zhì)、紅細(xì)胞紅色，背景淡黃粉色。④PAS染色：細(xì)胞核呈藍(lán)色，基底膜呈紅色，腎小球系膜基質(zhì)呈紅色。⑤Masson染色：細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，基底膜，膠原纖維、呈藍(lán)色，免疫復(fù)合物呈紅色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 染色結(jié)果:不同類型腎病患者中，免疫熒光染色中狼瘡性腎病中IgA、IgM、IgG、C3以及Clq診斷陽性率明顯高于IgA腎病和膜性腎病患者，P<0.05。在不同染色方法的對比中發(fā)現(xiàn)，免疫熒光染色法在腎病檢測IgA、IgM、IgG、C3以及Clq診斷陽性率明顯低于其他染色方法的診斷率，P<0.05。其他染色方法診斷率均無差異，P>0.05。見表1。

表1 不同染色方法對腎活檢病理診斷情況對比n(%)

注：相同組間對比，*P<0.05；不同染色法對比，#P<0.05

2.2 鏡下染色情況

圖1 免疫熒光染色

圖2 免疫熒光染色

圖3 六胺銀染色

圖4 剛果紅染色

圖5 Masson染色

圖6 PAS染色

圖1：IgA沉積在腎小球系膜區(qū)，為顆粒狀發(fā)光物。圖2：IgM沉積在腎小球系膜區(qū)，為團(tuán)塊狀發(fā)光物。圖3：六胺銀染色顯示膜性腎病基膜廣泛空泡。圖4：剛果紅染色顯示腎小球淀粉樣物質(zhì)陽性，呈磚紅色。圖5：Masson染色顯示玫瑰紅色沉淀物沿毛細(xì)血管壁上皮細(xì)胞側(cè)分布。圖6：PAS染色顯示腎小球基質(zhì)、腎小管基膜等呈玫瑰紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

3 討 論

腎組織活檢是臨床檢查腎臟疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，而腎活檢組織免疫病理檢查在腎組織病理診斷中起到重要價(jià)值[4]。免疫病理檢查包括冰凍切片和石蠟切片，但冰凍切片相對于石蠟切片較厚，免疫熒光染色組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)重疊或不清，因此部分醫(yī)院采用石蠟切片進(jìn)行免疫熒光染色[5]。但石蠟切片雖然能避免冰凍切片較厚的劣勢，但染色背景高，特異性差，在觀察切片同一部位的不同抗原時(shí)存在一定局限性[6]。因此有學(xué)者采用其他免疫組織染色方式對石蠟切片進(jìn)行染色，企圖提高免疫組化染色的診斷率[7]。

本文對我院慢性腎疾病患者進(jìn)行腎活檢病理診斷，采用免疫熒光染色、六胺銀染色法、甲醇剛果紅染色法、PAS染色以及Masson染色對我院患者腎活檢組織進(jìn)行病理診斷，結(jié)果顯示，免疫熒光染色相對于其他幾種特殊染色方法，對IgA腎病、膜性腎病以及狼瘡性腎病的診斷率均較低。而相對于不同類型腎疾病的腎組織活檢時(shí)，免疫熒光染色法對狼瘡性腎病診斷率高于IgA腎病以及膜性腎病。結(jié)果提示，相對于其他染色法，免疫熒光染色對腎活檢組織石蠟切片的診斷率明顯較低。這可能是由于石蠟切片采用福爾馬林進(jìn)行浸泡，在浸泡固定過程中，Ca2+和其他二價(jià)鍵離子形成緊密復(fù)合物封閉抗原，石蠟切片還會(huì)出現(xiàn)脫蠟不充分，導(dǎo)致抗原暴露不充分，引起特異性熒光減弱，影響診斷結(jié)果。六胺銀染色法采用高碘酸氧化組織，使基底膜內(nèi)枯多糖暴露出醛基，醛基將六胺銀還原為黑色金屬銀，硫代硫酸鈉固定顯色銀鹽，去除未反應(yīng)的銀離子，起到診斷作用。甲醇剛果紅染色法采用對剛果紅選擇性親和力的淀粉樣物質(zhì)進(jìn)行著色，剛果紅與淀粉樣物質(zhì)的羥基以及胺基結(jié)合，平行附著在淀粉樣物質(zhì)的纖維上呈紅色[8]。PAS染色法采用氧化劑高碘酸，破壞多糖類結(jié)構(gòu)的碳鍵，使組織中多糖分子的乙二醇基火氨羥基的碳鍵打開，生成醛類化合物，暴露游離的醛基與雪夫試劑作用，生成新的紅至紫紅色復(fù)合物從而得到定位。Masson染色法利用兩種或三種陰離子染料混合完成染色，陰離子染色分子大小和組織的滲透性有關(guān)，根據(jù)不同組織滲透性不同，選擇不同大小陰離子染色可將不同組織顯示出來。

[1] 李昌水,張英杰,鄭江江,等.蛋白酶K修復(fù)石蠟切片免疫熒光染色在腎活檢病理診斷中的應(yīng)用[J].中華病理學(xué)雜志,2014,43(1):38～41.

[2] 張翠薇,劉勇,張旭,等.腎活檢標(biāo)本冰凍切片與石蠟切片免疫熒光染色結(jié)果的比較[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,36(1):31～34.

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[4] 姚倫,劉樹軍,高丹,等.探討變色酸2R-亮綠在腎活檢組織染色中的應(yīng)用[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2015,19(10):1777～1779.

[5] 趙秀芬,錢軍,曾鳴,等.免疫熒光病理在乙型肝炎病毒相關(guān)性腎小球腎炎診斷中的臨床意義[J].江蘇醫(yī)藥,2015,41(12):1406～1408.

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Application of Immunofluorescence and other Special Staining in Pathological Diagnosis of Renal Biopsy

LUOJiaoxiu,CHUBing,CAOXiaoshan,etal

(ZhongshanAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,GuangdongZhongshan528403,China)

Objective:To analyze the effect of immunofluorescence and other special staining methods in the pathological diagnosis of renal biopsy. Methods: 58 patients with chronic kidney disease admitted in our hospital from September 2014 to September 2016 were included in the object of study. All patients underwent renal biopsy puncture to obtain tissue using paraffin, respectively by immunofluorescence, six staining of methanol method, Congo red staining and mucin (PAS) and three Masson dye staining, staining results in different ways. Results: The positive rates of IgA, IgM, IgG, C3 and Clq in the patients with different types of nephropathy were significantly higher than those of IgA nephropathy and membranous nephropathy in patients by immunofluorescence staining. In the comparison of different staining methods, it was found that the positive rate of IgA, IgM, IgG, C3 and Clq detected by immunofluorescence staining was significantly lower than that of other staining methods, P<0.05. There was no difference in the diagnostic rate of other staining methods, P>0.05. Conclusion:Comparing with other methods, the rate of pathological diagnosis of renal biopsy is lower than that of other methods. It is recommended to use other special staining methods to diagnose renal tissue.

Immunofluorescence; Six silver amine; Methanol congo red; Mucin; Masson staining solution

1006-6233(2017)06-0898-04

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目，(編號(hào)：2013B031804)

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.06.06

*【通訊作者】儲(chǔ) 兵