潘潔雪+葉龍云

[摘要] 目的 探索上皮型卵巢癌細胞卡鉑耐藥的機制，為提高卵巢癌患者化療效果提供前期基礎(chǔ)。 方法 應(yīng)用CCK8方法檢測卵巢癌細胞對卡鉑的IC50濃度，用Western blot方法檢測卡鉑處理后細胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（EMT）蛋白E-Cadherin和Vimentin表達情況，使用siRNA敲降A(chǔ)QP3后再觀察卡鉑對其作用。 結(jié)果 卵巢癌細胞系SKOV3與A2780的卡鉑IC50分別為2.814 μg/mL與1.516 μg/mL，同時發(fā)現(xiàn)卡鉑能誘導(dǎo)卵巢癌細胞發(fā)生EMT，基因芯片結(jié)果顯示水通道蛋白AQP3顯著上調(diào)，進一步敲降A(chǔ)QP3基因后，能顯著減弱卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細胞產(chǎn)生EMT的效果。 結(jié)論 AQP3在卵巢癌細胞卡鉑耐藥機制中具有重要作用，降低AQP3的表達可以減弱卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變的效果。

[關(guān)鍵詞] 卵巢癌；卡鉑；上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變；水通道蛋白

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）15-0027-03

[Abstract] Objective To discuss the mechanism of carboplatin resistance in epithelial ovarian cancer cells and to provide basis for improvement of chemotherapy effect in patients with ovarian cancer. Methods The IC50 concentration of ovarian cancer cells towards carboplatin was detected by CCK8， the expression of EMT proteins E-Cadherin and Vimentin after management of carboplatin was detected by Western blot， and the effect of carboplatin was observed again after AQP3 was knocked down by siRNA. Results The carboplatin IC50 was 2.814 μg/mL in SKOV3 ovarian cancer cell line and 1.516 μg/mL in A2780 line. Carboplatin could induce EMT in ovarian cancer cells. As to the result of gene chip， AQP3 was significantly up-regulated. When AQP3 gene was knocked down， EMT effect induced by carboplatin in ovarian cancer cells could be significantly reduced. Conclusion AQP3 has significant effect in the mechanisom of carboplatin resistance in ovarian cancer cells and reduction of the expression of AQP3 can reduce the EMT effect in ovarain cancer cells.

[Key words] Ovarian cancer； Carboplatin； Epithelial-mesenchymal transition； AQP

上皮型卵巢癌是女性生殖器最為常見的惡性腫瘤之一[1]，盡管近年來對卵巢癌的治療，包括手術(shù)、放化療及靶向治療已經(jīng)有了長足的進步，但卵巢癌患者預(yù)后仍較差，其中化療耐藥導(dǎo)致卵巢癌患者化療效果差、早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是重要因素之一[2]?；熢诼殉舶┗颊咝g(shù)后綜合治療中有著舉足輕重的地位，鉑類為基礎(chǔ)的化療方案是卵巢癌患者的一線治療方案，但是大多數(shù)患者在經(jīng)歷了幾個治療療程后會產(chǎn)生耐藥，尤其是對常用的化療藥卡鉑耐藥[3]。因而為了進一步提高卵巢癌患者根治術(shù)后的生存率，提高現(xiàn)有化療藥物的療效是治療關(guān)鍵。但對卡鉑化療耐藥更深入的機制仍不清楚，具有局限性，因而進一步研究卵巢癌內(nèi)在調(diào)控化療耐藥的分子信號途徑，尋找新的化療藥物，逆轉(zhuǎn)現(xiàn)有的化療耐藥現(xiàn)狀為我們制定新的卵巢癌治療方針提供了重要思路。

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）廣泛參與人體細胞內(nèi)各種生理活動，在細胞膜上廣泛分布，在哺乳動物中總共有13種AQP（AQP 0～12）[4]，而其中，AQP3被認為可以使細胞侵襲能力增強[5]，但是在卵巢癌中的研究尚屬空白，基于此，本文觀察AQP蛋白在卵巢癌中的作用，為進一步解決卡鉑耐藥奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人卵巢癌細胞株A2780和SKOV3購自中國科學院上海生物科學研究院。使用RPMI-1640培養(yǎng)基，其中胎牛血清濃度為10%、1%青霉素/鏈霉素，均來自Gibco公司。細胞在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2 細胞活性檢測

采用Dojindo公司CCK8試劑盒，檢測細胞的活性。將細胞種在96孔培養(yǎng)板后，待細胞貼壁，分別加入指定的卡鉑濃度，并培養(yǎng)48 h，加入CCK8試劑，并于490 nm處測OD值。

1.3 Real-time PCR 檢測細胞AQP3的表達

分別提取對照組與卡鉑組卵巢癌細胞的RNA，采用SYBR Premix Ex Taq Kit （TAKARA公司）進行Real-time PCR 檢測AQP3的表達，將目的基因與內(nèi)參基因的CT值比較（△CT）后，再將卡鉑組與對照組比較（△△CT）。

1.4 Western blot檢測E-Cadherin、Vimentin、AQP3蛋白水平

RIPA裂解細胞，提取蛋白，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，隨后使用濕轉(zhuǎn)法，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜。之后封閉洗過，用E-Cadherin（CST，1∶1000）、Vimentin （CST，1∶1000）、AQP3（Abcam，1∶500）與GAPDH（CST，1∶2000）等一抗4℃過夜。取出膜，使用TBST液洗滌，再使用相應(yīng)的二抗4℃孵育2 h。使用化學發(fā)光法檢測印跡。使用Quantity One軟件進行條帶灰度定量。

1.5基因芯片

將細胞提取RNA送上?？党缮锕?，使用Agilent表達譜基因芯片進行分析。

1.6統(tǒng)計學分析

計算和分析使用Graph Pad Prism 6軟件，采用兩個獨立樣本均數(shù)的t檢驗進行分析比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌細胞系在卡鉑作用下發(fā)生EMT

首先檢測在SKOV3與A2780兩個卵巢癌細胞系中卡鉑的IC50，分別為2.814 μg/mL與1.516 μg/mL（封三圖1A），發(fā)現(xiàn)卡鉑細胞顯著誘導(dǎo)卵巢癌細胞系EMT，其E-Cadherin蛋白顯著下調(diào)，而Vimentin蛋白顯著上調(diào)（封三圖1B與封三圖1C），灰度定量提示其具有顯著統(tǒng)計學差異，因此認為卡鉑具有誘導(dǎo)卵巢癌細胞系發(fā)生EMT的能力。

2.2 水通道蛋白在卡鉑誘導(dǎo)的EMT中的作用

進一步探索水通道蛋白AQP在卡鉑作用下卵巢癌細胞系中的作用，使用基因芯片篩查水通道蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)在水通道蛋白里，AQP 1、6、10、12a基本不變，而AQP 2、9、11表達稍有降低，而AQP 3、4、5、7、8表達上調(diào)，在這其中AQP3顯著上調(diào)（封三圖2A）。進一步使用Western blot在蛋白水平確定了AQP3在卡鉑作用下的上調(diào)趨勢（封三圖2）。

2.3 敲降A(chǔ)QP3能抑制卡鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細胞系的EMT作用

進一步使用AQP3 siRNA敲降A(chǔ)QP3在卵巢癌細胞中的表達，并與卡鉑聯(lián)合作用，發(fā)現(xiàn)卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細胞系形成EMT的作用被AQP3 siRNA明顯削弱，卡鉑不能誘導(dǎo)卵巢癌細胞系的EMT表型產(chǎn)生，干擾AQP3后，Vimentin表達較卡鉑作用顯著下降，E-Cadherin則顯著上調(diào)（封三圖3A與封三圖3B）。因此推斷，卡鉑誘導(dǎo)卵巢癌細胞系形成EMT的作用有可能是通過AQP3這條通路。

3討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的生命健康，其在全球女性患者的死亡原因中占第七位[6]。據(jù)報道，卵巢癌在美國將近有22 280例的新發(fā)病例，以及14 240例的死亡人數(shù)[6]，而我國卵巢癌患者的發(fā)生率以及死亡率也顯著上調(diào)，其死亡率達到3.31/10萬[7]。卵巢癌患者術(shù)后化療的一線用藥以卡鉑為基礎(chǔ)，鉑類藥物被廣泛用于全身各個臟器的上皮性惡性腫瘤中，包括膀胱癌、睪丸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌等[8]。卵巢癌患者化療耐藥導(dǎo)致的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與其預(yù)后較差相關(guān)，因此卵巢癌患者耐藥問題亟待解決。

鉑類化療藥物耐藥涉及多種機制，包括DNA修復(fù)系統(tǒng)異常、機體對鉑類-DNA復(fù)合物的耐藥性增強、腫瘤血流異常、鉑類藥物攝取降低和排出增快、抗凋亡因子上調(diào)、腫瘤細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變，以及多種耐藥相關(guān)蛋白上調(diào)等，而在這其中EMT轉(zhuǎn)變被認為在腫瘤細胞鉑類耐藥過程中占有重要作用[9-11]。EMT在乳腺癌、肺癌、腸癌與胰腺癌等腫瘤耐藥中起重要作用[12-15]。在EMT過程中，腫瘤細胞喪失上皮細胞特點而轉(zhuǎn)向間質(zhì)性細胞，進而具有更強的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，而且具有更強的耐藥特性，而其機制尚未明確。本文發(fā)現(xiàn)卡鉑在處理卵巢癌細胞后發(fā)生明顯的EMT轉(zhuǎn)變，E-Cadherin表達下調(diào)，Vimentin表達上調(diào)。

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）廣泛分布在機體的細胞膜上，在哺乳動物中總共有13種水通道蛋白（AQP 0～12）[4，16]。AQP3在人體中廣泛分布于腎集合管、上皮組織、結(jié)膜與乳腺中。據(jù)報道AQP3蛋白可以通過對水與甘油的轉(zhuǎn)運從而形成細胞偽足，促進細胞侵襲[17-19]，AQP3缺陷的老鼠可表現(xiàn)為尿液濃縮功能障礙、皮膚愈合功能障礙以及消化道功能異常。而AQP3的功能異常高表達，則有可能促進腫瘤產(chǎn)生與發(fā)展[20]。本文從水通道蛋白（AQPs）入手，廣泛篩查AQP蛋白在卡鉑作用下的耐藥特點，進而發(fā)現(xiàn)AQP3在卡鉑誘導(dǎo)EMT的過程中起重要作用，并且我們進一步敲降A(chǔ)QP3，發(fā)現(xiàn)能逆轉(zhuǎn)卡鉑引起的EMT過程。

綜上，我們認為卡鉑可能是通過AQP3這條通路引起卵巢癌細胞EMT，進而引起卵巢癌細胞耐藥，提示AQP3可以作為卵巢癌患者接受卡鉑治療后的預(yù)后指標。這些結(jié)果可能揭示了一個解決卵巢癌細胞耐藥的新通路，為進一步解決這個問題打下了基礎(chǔ)，當然需要更進一步的研究揭示AQP3與EMT相關(guān)蛋白間具體如何作用。

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