胡建平， 左 柯， 萬(wàn) 華

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 數(shù)學(xué)與信息學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

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新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及其抑制劑研究進(jìn)展

胡建平1，2， 左 柯1，2， 萬(wàn) 華3

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 數(shù)學(xué)與信息學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，作為一線抗生素被廣泛用于各類(lèi)細(xì)菌感染的臨床治療.由位于質(zhì)粒的基因blaNDM-1編碼的新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1可高效水解幾乎所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的應(yīng)用造成了極大的威脅，開(kāi)發(fā)有效的抑制劑新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1抑制劑迫在眉睫.而抑制劑分子的設(shè)計(jì)改造工作的開(kāi)展有賴(lài)于對(duì)新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1結(jié)構(gòu)和催化功能的研究，本綜述旨在總結(jié)目前有關(guān)新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及其抑制劑的相關(guān)研究進(jìn)展，為基于新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計(jì)、改造等研究提供幫助.

細(xì)菌耐藥；NDM-1；催化機(jī)理；抑制劑；藥物設(shè)計(jì)

0 引 言

自1929年，人類(lèi)發(fā)現(xiàn)第一種抗生素——青霉素以來(lái)，抗生素已挽救了無(wú)數(shù)的生命.目前，以青霉素和頭孢菌素為代表的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，是治療細(xì)菌感染的常用藥物，該類(lèi)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有一個(gè)發(fā)揮藥效必需的四元β-內(nèi)酰胺環(huán)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示.當(dāng)其作用于細(xì)菌時(shí)，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)環(huán)，與細(xì)菌細(xì)胞壁合成途徑中的羧肽酶和轉(zhuǎn)肽酶發(fā)生?；饔茫种圃撁傅纳锘钚远购铣傻募?xì)胞壁出現(xiàn)缺陷，最終導(dǎo)致菌體裂解死亡[1-2].

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥問(wèn)題也日益凸顯[3]，同時(shí)攜帶多種耐藥基因的“超級(jí)細(xì)菌"，如泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等也頻頻被報(bào)道[4-6].在細(xì)菌耐藥機(jī)制中，產(chǎn)生一種或多種水解酶或鈍化酶滅活抗菌藥物最為常見(jiàn)，而β-內(nèi)酰胺酶是一種可催化β-內(nèi)酰胺環(huán)水解開(kāi)環(huán)的水解酶.基于氨基酸序列的同源性[7]，β-內(nèi)酰胺酶可分為A、B、C和D 4類(lèi).其中，A、C和D類(lèi)酶的活性位點(diǎn)為絲氨酸殘基，故又統(tǒng)稱(chēng)為絲氨酸-β-內(nèi)酰胺酶(serine-β-lactamase,SBL)；而B(niǎo)類(lèi)酶則依靠1個(gè)或2個(gè)金屬離子行使催化功能，因此又稱(chēng)為金屬-β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamase,MBL),具體可細(xì)分為B1、B2和B3 3個(gè)亞類(lèi).

圖1 β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)是一種廣譜高效的B1 MBL，于2009年首次被報(bào)道[8-9].目前，研究人員已發(fā)現(xiàn)同類(lèi)的另外14個(gè)變種[10]，依次命名為NDM-2～NDM-15.NDM-1由位于質(zhì)粒的blaNDM-1基因編碼，可水解除氨曲南和美西林外幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素[8，10-11].研究發(fā)現(xiàn)，blaNDM-1基因并不僅限于在醫(yī)院獲得性菌種間傳遞，同時(shí)也可在社區(qū)高度流行的菌種間傳播[12-13]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近10種細(xì)菌表達(dá)NDM-1[14].這些表達(dá)NDM-1的細(xì)菌可引起包括尿道和肺部感染、腹膜炎、軟組織感染及敗血癥等疾病，為相關(guān)病癥的臨床治療造成了嚴(yán)重威脅.

隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，比如，改良Hodge試驗(yàn)[15-16]和基于顯色培養(yǎng)基篩選法[17-19]等表型方法，基于PCR的體外蛋白表達(dá)技術(shù)[20]、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法[21-22]等基因型方法，以及分子方法均可有效檢測(cè)出產(chǎn)NDM-1的菌株.同時(shí)，在治療方面，雖然有報(bào)道聯(lián)用多種抗菌藥物并口服磷霉素成功治愈產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌引發(fā)的尿道感染的個(gè)案[23]，但目前仍缺乏對(duì)產(chǎn)NDM-1菌株特效的治療藥物.

考慮到β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素良好的藥效和較低的毒副作用，開(kāi)發(fā)有效的NDM-1抑制劑并與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素配伍使用是目前主要的研發(fā)思路.而掌握NDM-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理等生物化學(xué)信息，可為其抑制劑的設(shè)計(jì)、改造等提供有力的技術(shù)支撐.

1 NDM-1的分子結(jié)構(gòu)

獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)是NDM-1發(fā)揮水解功能的基礎(chǔ)，同時(shí)也是篩選、設(shè)計(jì)抑制劑的重要依據(jù).截至2017年3月，RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)共收錄了30個(gè)NDM-1晶體結(jié)構(gòu)，除3S0Z(PDB ID)為大腸桿菌NDM-1外，其余均來(lái)自肺炎克雷伯菌.NDM-1為雙金屬M(fèi)BL[24-27]，在30個(gè)NDM-1晶體結(jié)構(gòu)中，活性口袋中含有金屬離子的結(jié)構(gòu)有23個(gè)(3SFD為單鋅離子結(jié)構(gòu))，同時(shí)結(jié)合β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)縮為14個(gè)，其中結(jié)合抑制劑的結(jié)構(gòu)有3個(gè)(5A5Z、4U4L、4EXS).表1列出了NDM-1-底物/抑制劑復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的具體信息.

表1 NDM-1-底物/抑制劑復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)信息

1.1 NDM-1的整體結(jié)構(gòu)

NDM-1由單多肽鏈構(gòu)成，共含有270個(gè)氨基酸殘基，呈典型的αβ/βα夾層結(jié)構(gòu)[28-30]，具體如圖2所示.

圖2 NDM-1的整體結(jié)構(gòu)

從圖2中可以看出，分子暴露在溶劑中的兩側(cè)分別為2段α螺旋，從N端往C端依次為α1、α2、α5和α6；2個(gè)β折疊通過(guò)一段α-β-α的結(jié)構(gòu)相連接位于分子的內(nèi)層.其中，靠近N端的β折疊由7股平行或反平行的β折疊片構(gòu)成，而靠近C端的β折疊則由4股組成[26].3段loop區(qū)L3(L65-V73)、L7(T119～M126)和L10(C208～L221)組成了活性口袋的主體部分，具有催化活性的2個(gè)Zn2+(Zn1與Zn2)則位于口袋底部[31].

此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌體內(nèi)，NDM-1以單體形式發(fā)揮催化活性[31]，而目前解析得到的NDM-1晶體結(jié)構(gòu)則多為二聚體，其在膜結(jié)合與純化狀態(tài)下能通過(guò)疏水與范德華相互作用進(jìn)行二聚被推測(cè)與該酶獨(dú)特的耐藥機(jī)制有關(guān)[28].

1.2 NDM-1的活性位點(diǎn)

圖3給出了NDM-1活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)：位于活性中心的Zn1與H120、H122、H189及水分子/OH-(與晶體生長(zhǎng)時(shí)的pH有關(guān)[27,35])結(jié)合構(gòu)成四面體構(gòu)型，即組氨酸位點(diǎn)；Zn2與D124、C208和H250結(jié)合構(gòu)成三角錐形結(jié)構(gòu)形成半胱氨酸位點(diǎn)；Zn1與Zn2通過(guò)D124的側(cè)鏈相聯(lián)系[26,30-31].

圖3 NDM-1活性位點(diǎn)的局部放大圖

從圖3可以看出，Zn1與水解后的苯唑西林(oxacillin,OXA)的β-羧基間存在相互作用，Zn2還與噻唑環(huán)上的N和羧基配位結(jié)合，提示Zn2+在NDM-1與底物的結(jié)合和催化水解反應(yīng)的過(guò)程中均具有重要作用.Zn2+與底物間的這種相互作用，使β-內(nèi)酰胺環(huán)維持在易被進(jìn)攻的空間取向狀態(tài)，從而使得水解反應(yīng)得以高效進(jìn)行[36].晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，Zn2+可以被其他金屬離子，如Cd2+、Mn2+、Co2+等，替換[30].

Yang等[37]測(cè)定了野生型NDM-1和Zn/Co、Co/Co和Co/Cd 3種金屬離子替換后的NDM-1水解chromacef的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，以及紫外—可見(jiàn)光光譜(UV-vis)、核磁共振氫譜(1H NMR)、電子順磁共振譜(EPR)、X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)譜(EXAFS)等數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示：金屬替換后，NDM-1的酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)出現(xiàn)明顯變化，具有順磁性的金屬取代NDM-1，比如Co/Cd和Zn/Co，與底物反應(yīng)時(shí)有顯著的結(jié)構(gòu)變化；與其他B1 MBLs相比，NDM-1的活性位點(diǎn)擁有更大的表面積，這顯然與構(gòu)成活性位點(diǎn)的L3和L10均距離鋅離子中心較遠(yuǎn)有關(guān)[28].Yuan等[38]通過(guò)分子對(duì)接預(yù)測(cè)了160種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素在NDM-1活性位點(diǎn)處的構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)NDM-1在結(jié)合底物后，其活性位點(diǎn)構(gòu)象并未出現(xiàn)較為顯著的變化.這為NDM-1水解底物的廣譜性提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).

此外，科研人員對(duì)活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)分析還發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵識(shí)別殘基，例如：K125通過(guò)與周?chē)鷼埢纬傻臍滏I網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定L7的構(gòu)象，同時(shí)對(duì)與Zn1結(jié)合的殘基有一定的空間位阻排斥效應(yīng)[27]；Y229對(duì)穩(wěn)定活性位點(diǎn)的構(gòu)象同樣具有重要意義[27,31]；定點(diǎn)突變L65A導(dǎo)致氨芐西林和一些頭孢菌素的最低抑菌濃度下降，而定點(diǎn)突變N220A則導(dǎo)致NDM-1對(duì)氨芐西林、頭孢吡肟、美羅培南和亞胺培南的水解能力大大降低[39].Zhu等[40]對(duì)NDM-1與氨芐西林、頭孢硝噻吩和美羅培南形成的3個(gè)復(fù)合物體系進(jìn)行了30 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，位于L3上的L65、M67和F70均與氨芐西林和頭孢硝噻吩的側(cè)鏈形成了較強(qiáng)的疏水作用，此對(duì)于維持復(fù)合物的穩(wěn)定性具有重要意義，并給出了L3在整個(gè)模擬過(guò)程中具有3簇主要構(gòu)象，并呈現(xiàn)出較大的片段柔性.相關(guān)研究表明：Q123與D124側(cè)鏈的氧原子可與臨近的β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素側(cè)鏈形成氫鍵[27]；K211、G219、N220與H189在IMP-1、CcrA等同類(lèi)MBLs中高度保守，K211除了參與底物的識(shí)別與水解反應(yīng)外，還可通過(guò)與底物形成鹽鍵維持其有利于水解反應(yīng)的正確取向；N220可與底物的羰基氧原子形成氫鍵，還可與Zn1形成相互作用，后者可能與維持水解反應(yīng)中的四面體中間產(chǎn)物的穩(wěn)定有關(guān)[26-28,39,41].

2 NDM-1的催化機(jī)理

作為B1類(lèi)MBL成員之一，NDM-1催化底物水解的機(jī)理與同類(lèi)MBLs類(lèi)似[27]，主要包括，β-內(nèi)酰胺羰基與Zn1結(jié)合，OH-的親核進(jìn)攻，質(zhì)子向N原子的轉(zhuǎn)移和C-N鍵的斷裂，具體如圖4所示.但其水解機(jī)理中的具體細(xì)節(jié)尚未被全部闡明，還有待進(jìn)一步的探究.

A表示青霉素類(lèi)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素時(shí)可能的水解途徑；B表示頭孢菌素類(lèi)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素時(shí)可能的水解途徑；C表示碳青霉烯類(lèi)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素時(shí)可能的水解途徑.E表示NDM-1，S表示底物，I表示中間體，P表示產(chǎn)物，W表示水.機(jī)理的繪制參考文獻(xiàn)[37,42,45].

圖4 NDM-1可能的催化機(jī)理

關(guān)于反應(yīng)中的親核試劑和廣義堿，有學(xué)者認(rèn)為，溶劑環(huán)境中的水分子在水解反應(yīng)中作為親核試劑，而位于活性位點(diǎn)中的OH-作為廣義堿，溶劑環(huán)境中的水分子向OH-給出質(zhì)子后生成新的OH-，然后進(jìn)攻β-內(nèi)酰胺環(huán)的羰基碳原子，該反應(yīng)的發(fā)生需要越過(guò)約80 kJ/mol的能壘[27，35]；也有學(xué)者認(rèn)為，親核試劑可能是位于活性位點(diǎn)的水分子，而D124或環(huán)境中的水分子作為廣義堿接受質(zhì)子，該情況下的反應(yīng)能壘大于或等于200 kJ/mol[42].

有學(xué)者認(rèn)為，按照其他MBLs的反應(yīng)機(jī)理，位于Zn1和Zn2間的OH-作為親核試劑進(jìn)攻β-內(nèi)酰胺環(huán)后，C-N鍵可立即斷裂形成氮負(fù)離子中間體[43].但Zhang等[42]提出，β-內(nèi)酰胺環(huán)受到OH-進(jìn)攻后，C-N鍵的斷裂可能與負(fù)離子的質(zhì)子化反應(yīng)協(xié)同進(jìn)行，并不產(chǎn)生氮負(fù)離子中間體.但無(wú)論是上述哪種情況，氮原子上的質(zhì)子均來(lái)自親核進(jìn)攻的OH-.而科研人員在NDM-1Δ6、NDM-1Δ21和NDM-1Δ36(分別表示移除分子的前6、21和36個(gè)氨基酸)的酶促動(dòng)力學(xué)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，NDM-1的催化機(jī)理中可能存在不只一個(gè)中間體[44].在探究NDM-1對(duì)頭孢菌素類(lèi)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的水解機(jī)制中，F(xiàn)eng等[25]通過(guò)1H NMR監(jiān)測(cè)到了二氫噻嗪環(huán)中雙鍵轉(zhuǎn)移的情況，最終質(zhì)子并不是轉(zhuǎn)移至N原子，而是根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)遷移至不同的部位，并得到了反應(yīng)中間體的晶體結(jié)構(gòu).

此外，研究人員在對(duì)金屬取代NDM-1催化機(jī)理的研究中還發(fā)現(xiàn)：金屬離子的種類(lèi)并不能顯著影響反應(yīng)的能壘；產(chǎn)物的釋放速率與半胱氨酸位點(diǎn)的金屬路易斯酸性大小有關(guān)(Zn>Co>Cd)，但同時(shí)也受到組氨酸位點(diǎn)處金屬種類(lèi)的影響；當(dāng)用Co2+離子取代Zn1時(shí)，生成產(chǎn)物的速率比未取代時(shí)快2～3倍，這可能與Co2+離子改變了與底物反應(yīng)時(shí)的電子結(jié)構(gòu)，降低了電子結(jié)構(gòu)對(duì)稱(chēng)性有關(guān)；當(dāng)用Cd2+離子取代Zn2時(shí)，中間體的生成速率有明顯影響，提示Zn2在親核進(jìn)攻和穩(wěn)定中間體的過(guò)程中具有重要意義[37].

目前，分子動(dòng)力學(xué)模擬和混合量子力學(xué)/分子力學(xué)模擬等理論研究方法在酶催化反應(yīng)的機(jī)理研究中應(yīng)用廣泛.Zheng等[42]使用SCC-DFTB/CHARMM混合力場(chǎng)模擬了NDM-1與底物氨芐西林和抑制劑L-卡托普利的結(jié)合模式，并根據(jù)密度泛函理論對(duì)氨芐西林的開(kāi)環(huán)過(guò)程進(jìn)行了理論計(jì)算，模擬結(jié)果顯示：OH-位于兩個(gè)Zn2+的中間位置，并通過(guò)氫鍵與D124相連；氨芐西林的羧基并未與Zn2相連，而是通過(guò)氫鍵與K211和N220連接；后續(xù)OH-親核進(jìn)攻、C-N鍵斷裂、形成氮負(fù)離子中間體以及開(kāi)環(huán)后羧基與Zn2配位鍵的形成幾乎同時(shí)進(jìn)行(見(jiàn)圖4).Zhu等[45]使用ONIOM算法對(duì)NDM-1催化美羅培南的水解機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，離子化的D124是C-N鍵斷裂的有利因素；在沒(méi)有水分子與Zn2結(jié)合時(shí)，反應(yīng)過(guò)程中更傾向于形成氮負(fù)離子中間體，且K211在底物結(jié)合和催化反應(yīng)的過(guò)程中均具有重要意義.由于NDM-1高效的水解速率，目前很難通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)理論計(jì)算得出的過(guò)渡態(tài)進(jìn)行驗(yàn)證.相關(guān)研究也表明，針對(duì)不同類(lèi)型的底物NDM-1的催化機(jī)理各不相同.為了指導(dǎo)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抑制劑，NDM-1催化下的水解機(jī)理還有待在分子層面做進(jìn)一步探究.

3 NDM-1抑制劑的研究現(xiàn)狀

目前，科研人員為應(yīng)對(duì)NDM-1帶來(lái)的耐藥問(wèn)題采取的主要策略為：在了解NDM-1結(jié)構(gòu)及可能水解機(jī)制的情況下，不斷開(kāi)發(fā)或?qū)ふ也灰妆籒DM-1水解的新抗生素；篩選設(shè)計(jì)NDM-1抑制劑，并與傳統(tǒng)抗生素制成合劑.

3.1 含硫類(lèi)抑制劑

硫元素是生命活動(dòng)中的重要元素之一，也常出現(xiàn)在各類(lèi)藥物分子中.含硫類(lèi)抑制劑的結(jié)構(gòu)式及IC50值如圖5所示.

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利中含有巰基結(jié)構(gòu)，是經(jīng)典的抗高血壓藥物.研究發(fā)現(xiàn)，D-卡托普利1對(duì)NDM-1表現(xiàn)出較好的抑制活性(IC50=7.9 μM)，而L-卡托普利的抑制活性相對(duì)較弱，其IC50為202.0 μM[31].Li等[46]為進(jìn)一步探究NDM-1抑制劑的藥效基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成并測(cè)試了系列D-卡托普利類(lèi)似物2-6的抑制活性，發(fā)現(xiàn)R構(gòu)型的芐胺類(lèi)似物6a表現(xiàn)出了較高的抑制活性，其IC50值為1.5 μM，遠(yuǎn)高于S型旋光異構(gòu)體.Shen等[47]發(fā)現(xiàn)噻吩羧酸類(lèi)衍生物7-9對(duì)NDM-1具有一定的抑制作用，與美羅培南聯(lián)合給藥可提高美羅培南的抗菌活性.此外，Wang等[48]通過(guò)多步虛擬篩選從含有280萬(wàn)個(gè)類(lèi)藥分子的ZINC化合物庫(kù)中篩出3個(gè)磺胺類(lèi)NDM-1抑制劑10-12，其分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，分子中的磺酰胺基直接與Zn1結(jié)合，從而阻礙水解反應(yīng)的發(fā)生，提示磺酰胺基可能是開(kāi)發(fā)NDM-1抑制劑式可選的優(yōu)勢(shì)骨架結(jié)構(gòu).

3.2 苯并吡喃類(lèi)抑制劑

苯并吡喃類(lèi)NDM-1抑制劑的結(jié)構(gòu)如圖6所示.

利用分子對(duì)接方法，Proschak等[49]將SPECS數(shù)據(jù)庫(kù)中的分子對(duì)接至NDM-1等4種MBLs晶體結(jié)構(gòu)中.分子對(duì)接同時(shí)使用MOE、GOLD和PLANTS 3款軟件進(jìn)行，以3款軟件預(yù)測(cè)結(jié)合模式的均方根偏差小于或等于0.2 nm為判據(jù)進(jìn)行分子片段篩選；在篩得的分子片段中，僅保留MBLs中結(jié)合模式均方根偏差值小于或等于0.2 nm的片段進(jìn)行Fluorocillin試驗(yàn)評(píng)價(jià)活性，由此得到抑制活性最好的苯并吡喃類(lèi)化合物13(IC50=50±9 μM)[50].此外，Gan等[51]還從青霉菌株(Penicillium sp. 109F 484)中分離得到2種具有微弱NDM-1抑制活性的聚酮化合物14和15，二者的IC50分別為94.9 μM和87.9 μM.抗菌實(shí)驗(yàn)顯示，化合物14和15對(duì)產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌均無(wú)抑制活性，與美羅培南聯(lián)合使用時(shí)，也無(wú)法提高美羅培南的抗菌活性.

圖5 含硫類(lèi)NDM-1抑制劑的結(jié)構(gòu)

圖6 苯并吡喃類(lèi)NDM-1抑制劑的結(jié)構(gòu)

3.3 共價(jià)結(jié)合型抑制劑

共價(jià)結(jié)合型NDM-1抑制劑的結(jié)構(gòu)如圖7所示.

研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)氫鍵、范德華等非鍵相互作用與靶點(diǎn)可逆性結(jié)合是大多數(shù)藥物在發(fā)揮藥效時(shí)與靶點(diǎn)的結(jié)合特點(diǎn)，但也不乏通過(guò)形成共價(jià)鍵與靶點(diǎn)不可逆結(jié)合的例子，如細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥物.在NDM-1共價(jià)結(jié)合型抑制劑的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，Christopeit等[52]報(bào)道了2種可逆共價(jià)結(jié)合型非β-內(nèi)酰胺類(lèi)抑制劑16(Kd=181 μM)和17(Ki=580 nM)，其電噴霧離子化質(zhì)譜和氨基酸定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)顯示，化合物16和17通過(guò)單鍵與NDM-1活性位點(diǎn)的K224結(jié)合；通過(guò)共價(jià)分子對(duì)接還發(fā)現(xiàn)，化合物17的酮羰基與Zn2之間存在極性相互作用，并與W87、I35和V67間形成輸水相互作用.Thomas等[53]通過(guò)高通量篩選也得到了2種共價(jià)結(jié)合型NDM-1抑制劑，對(duì)氯汞苯甲酸18和硝普鈉19，兩者的抑制活性(IC50)分別為2.3 μM和9.0 μM，通過(guò)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)和C208D突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化合物18可以選擇性共價(jià)修飾NDM-1活性位點(diǎn)結(jié)合Zn2的C208，從而發(fā)揮抑制作用.另外，Thomas等[54]還報(bào)道了頭孢克洛20通過(guò)K211介導(dǎo)的多步反應(yīng)，不可逆地共價(jià)抑制NDM-1的活性(Ki=2.3±0.1 mM)，提示K211可能是開(kāi)發(fā)共價(jià)結(jié)合型抑制劑的關(guān)鍵氨基酸殘基.依布硒啉21是一種新型非甾體抗炎藥，臨床上主要用于缺血和中風(fēng)的治療，研究發(fā)現(xiàn)：依布硒啉可與鍵合Zn2的C208形成S-Se鍵，從而影響NDM-1的催化功能；以(1.3～1.4)∶1的比例聯(lián)合使用依布硒啉和氨芐西林或美羅培南，可使得β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的MICs分別下降4和35倍[55].

圖7 共價(jià)結(jié)合型NDM-1抑制劑的結(jié)構(gòu)

3.4 金屬螯合劑

金屬離子作為NDM-1發(fā)揮催化功能的關(guān)鍵輔助因子，若使用金屬螯合劑封閉NDM-1活性位點(diǎn)的Zn2+，理論上可有效抑制其催化活性.典型NDM-1金屬螯合劑的結(jié)構(gòu)如圖8所示.

圖8 金屬螯合劑的結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)，乙二胺四乙酸22是常見(jiàn)的金屬螯合劑，可有效抑制NDM-1(IC50=1.6 μM)，但由于其具有較強(qiáng)的毒性，并不適合直接用于臨床治療[56].Azumah等[57]評(píng)價(jià)了3種金屬螯合劑23～25在與美羅培南聯(lián)合使用時(shí)，NDM-1對(duì)美羅培南的耐藥情況：當(dāng)化合物23用量在4和8 mg/L時(shí)活性最佳，可使美羅培南的MICs分別降低至0.5和0.06 mg/L；化合物24在8和16 mg/L的劑量時(shí)，同樣也可將美羅培南的MICs分別降至1和0.125 mg/L；但化合物25對(duì)NDM-1的抑制效果較差，需要將用量提至32 mg/L才可將美羅培南的MICs降低至0.06 mg/L.此外，F(xiàn)alconer等[58]還報(bào)道了一類(lèi)二氫吲哚螺噻二唑類(lèi)金屬螯合劑26，并通過(guò)產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌小鼠感染模型證明了該類(lèi)化合物對(duì)NDM-1的抑制活性，其單晶結(jié)構(gòu)顯示，原化合物26的S-Cspiro鍵斷裂，噻二唑環(huán)開(kāi)環(huán)形成亞胺結(jié)構(gòu)，暴露的S與亞胺N構(gòu)成二齒配體與Zn2+進(jìn)行螯合，從而發(fā)揮抑制作用.

3.5 其 他

其他NDM-1抑制劑分子的結(jié)構(gòu)如圖9所示.

圖9 其他NDM-1抑制劑分子的結(jié)構(gòu)

曲霉明A 27是一種從雜色曲霉菌株中分離得到的一種天然產(chǎn)物.研究發(fā)現(xiàn)，曲霉明對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶均有良好的抑制作用，其IC50值分別為1.2 μM和3.4 μM[59-61].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，曲霉明對(duì)NDM-1的抑制作用同樣出色(IC50=4.0±1.0 μM)[62].研究人員利用電感耦合質(zhì)譜證實(shí)，曲霉明對(duì)NDM-1的抑制主要通過(guò)耗盡NDM-1活性位點(diǎn)中的Zn2+實(shí)現(xiàn)，屬于一種不可逆抑制作用，但這種抑制作用造成的失活狀態(tài)可通過(guò)加入過(guò)量的ZnSO4實(shí)現(xiàn)完全復(fù)活[62].雖然曲霉明在抑制活性和毒性等方面的表現(xiàn)令人滿(mǎn)意，但由于其較高的親水性，其藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)還有待進(jìn)一步改善[62].Chrestopeit等[63]使用正交篩選聯(lián)合表面等離子共振技術(shù)得到了另外3種對(duì)NDM-1有一定抑制作用的片段分子28～30，其QM-polarized分子對(duì)接結(jié)果顯示：28～30的羧基可與Zn2結(jié)合，并與K224和N233形成氫鍵；28和30與W87、L59和V67間還存在一定的疏水作用.這些結(jié)合力可能是維持這些片段分子發(fā)揮抑制活性的關(guān)鍵因素.

4 展 望

產(chǎn)NDM-1的耐藥菌感染對(duì)使用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的臨床治療造成了嚴(yán)重威脅.自2009年首次報(bào)道NDM-1至今，各國(guó)學(xué)者已在NDM-1的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及其抑制劑等領(lǐng)域開(kāi)展了一系列研究，并基于不同底物提出了NDM-1多種可能的催化機(jī)理，但對(duì)于催化機(jī)理中的堿、親核試劑及中間體質(zhì)子化過(guò)程等具體細(xì)節(jié)仍在探討之中.就目前開(kāi)發(fā)的抑制劑而言，抑制活性普遍維持在微摩爾級(jí)，雖在體外或體內(nèi)均取得了較為滿(mǎn)意的結(jié)果，但又由于分子固有的毒性或較差的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等，尚未能成功開(kāi)發(fā)為藥物上市銷(xiāo)售.

隨著各學(xué)科的交叉融合及大數(shù)據(jù)時(shí)代的來(lái)臨，對(duì)NDM-1研究而言，根據(jù)量子或分子力學(xué)等理論，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬NDM-1的水解機(jī)理或其與抑制劑分子間的結(jié)合模式，并通過(guò)數(shù)學(xué)建模定量探究分子結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系，為NDM-1抑制劑分子的設(shè)計(jì)與改造提供理論指導(dǎo)等已取得了一定的成效.隨著計(jì)算科學(xué)的飛速發(fā)展，模擬精度的逐步提高，藥學(xué)科研工作中計(jì)算機(jī)輔助的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越多，相信在不久的將來(lái)，基于理論的計(jì)算可望成為應(yīng)對(duì)諸如細(xì)菌耐藥問(wèn)題等各類(lèi)醫(yī)、藥學(xué)難題時(shí)不可缺少的主要工具之一.

[1]Wilke M S,Lovering A L,Strynadka N C.Beta-lactamantibioticresistance:acurrentstructuralperspective[J].Curr Opin Microbiol,2005,8(5):525-533.

[2]Rawat D,Nair D.Extended-spectrumβ-lactamasesingramnegativebacteria[J].J Glob Infect Dis,2010,2(3):263-274.

[3]World Health Organization.Antimicrobialresistance:globalreportonsurveillance2014[R].Geneva,Switzerland：World Health Organization,2014.

[4]Protic D,Pejovic A,Andjelkovic D,et al.Nosocomialinfectionscausedbyacinetobacterbaumannii:arewelosingthebattle?[J].Surg Infect,2016,17(2):1-7.

[5]Stoesser N,Mathers A J,Moore C E,et al.Colistinresistancegenemcr-1andpHNSHP45plasmidinhumanisolatesofescherichiacoliandklebsiellapneumoniae[J].Lancet Infect Dis,2016,16(3):285-286.

[6]Labarca J A,Salles M J C,Seas C,et al.Carbapenemresistanceinpseudomonasaeruginosaandacinetobacterbaumanniiinthenosocomialsettinginlatinamerica[J].Crit Rev Microbiol,2016,42(2):276-292.

[7]Bush K,Jacoby G A.Updatedfunctionalclassificationofbeta-lactamase[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(3):969-976.

[8]Yong D,Toleman M A,Giske C G,et al.Characterizationofanewmetallo-beta-lactamasegene,bla(NDM-1),andanovelerythromycinesterasegenecarriedonauniquegeneticstructureinKlebsiellapneumoniaesequencetype14fromIndia[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(12):5046-5054.

[9]Moellering R C J.NDM-1—acauseforworldwideconcern[J].New Engl J Med,2010,363(25):2377-2379.

[10]Groundwater P W,Xu S,Lai F,et al.Newdelhimetallo-β-lactamase-1:structure,inhibitorsanddetectionofproducers[J].Future Med Chem,2016,8(9):993-1012.

[11]Marrs E C,Day K M,Perry J D.InvitroactivityofmecillinamagainstenterobacteriaceaewithNDM-1carbapenemase[J].J Antimicrob Chemother,2014,69(10):2873-2875.

[12]Denis C,Poirel L,Carricajo A,et al.NosocomialtransmissionofNDM-1-producingescherichiacoliwithinanon-endemicareainFrance[J].Clin Microbiol Infec,2012,18(5):E128-E130.

[13]Walsh T R,Weeks J,Livermore D M,et al.DisseminationofNDM-1positivebacteriainthenewdelhienvironmentanditsimplicationsforhumanhealth:anenvironmentalpointprevalencestudy[J].Lancet Infect Dis,2011,11(5):355-362.

[14]Berrazeg M,Diene S,Medjahed L,et al.Newdelhimetallo-beta-lactamasearoundtheworld:aneReviewusinggooglemaps[J].Euro Surveil,2014,19(20):2-15.

[15]Girlich D,Poirel L,Nordmann P.Valueofthemodifiedhodgetestfordetectionofemergingcarbapenemasesinenterobacteriaceae[J].J Clin Microbiol,2012,50(2):477-479.

[16]Abidin N Z Z,Sulong A,Alfizah H,et al.Screeningfornewdelhimetallo-β-lactamase-1inenterobacteriaceae:istherearoleforthemodifiedhodgetest?[J].Pak J Med Sci,2015,31(6):1340-1343.

[17]Perry J D,Naqvi S H,Mirza I A，et al.PrevalenceoffaecalcarriageofenterobacteriaceaewithNDM-1carbapenemaseatmilitaryhospitalsinpakistan,andevaluationoftwochromogenicmedia[J].J Antimicrob Chemother,2011,66(10):2288-2294.

[18]Nordmann P,Poirel L,Walsh T R,et al.TheemergingNDMcarbapenemases[J].Trends Microbiol,2011,19(12):588-595.

[19]Nordmann P,Poirel L,Carrr A,et al.Howtodetectndm-1producers[J].J Clin Microbiol,2011,49(2):718-721.

[20]Huang L,Hu X,Zhou M,et al.RapiddetectionofNewdelhimetallo-β-lactamasegeneandvariantscodingforcarbapenemaseswithdifferentactivitiesbyuseofaPCR-basedinvitroproteinexpressionmethod[J].J Clin Microbiol,2014,52(6):1947-1953.

[21]Hrabák J,Studentová V,Walková R，et al.DetectionofNDM-1，VIM-1,KPC,OXA-48,andOXA-162carbapenemasesbymatrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrometry[J].J Clin Microbiol,2012,50(7):2441-2443.

[22]Hrabák J,Chudácková E,Walková R.Matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflight(maldi-tof)massspectrometryfordetectionofantibioticresistancemechanisms:fromresearchtoroutinediagnosis[J].Clin Microbiol Rev,2013,26(1):103-114.

[23]Wilkowski P,Ciszek M,Dobrzaniecka K,et al.SuccessfultreatmentofurinarytractinfectioninkidneytransplantrecipientscausedbymultiresistantklebsiellapneumoniaeproducingnewDelhimetallo-beta-lactamase(NDM-1)withstrainsgenotyping[J].Transplant Proc,2016,48(5):1576-1579.

[24]Klingler F,Wichelhaus T A,Frank D,et al.Approveddrugscontainingthiolsasinhibitorsofmetallo-β-lactamases:strategytocombatmultidrug-resistantbacteria[J].J Med Chem,2015,58(8):3626-3630.

[25]Feng H,Ding J,Zhu D,et al.StructuralandmechanisticinsightsintoNDM-1catalyzedhydrolysisofcephalosporins[J].J Am Chem Soc,2014,136(42):14694-14697.

[26]King D T,Worrall L J,Gruninger R,et al.NewDelhimetallo-β-lactamase:structuralinsightsintoβ-lactamrecognitionandinhibition[J].J Am Chem Soc,2012,134(28):11362-11365.

[27]Zhang H,Hao Q.CrystalstructureofNDM-1revealsacommonβ-lactamhydrolysismechanism[J].FASEB J,2011,25(8):2574-2582.

[28]King D,Strynadka N.Crystalstructureofnewdelhimetallo-β-lactamaserevealsmolecularbasisforantibioticresistance[J].Protein Sci,2011,20(9):1484-1491.

[29]Kim Y,Tesar C,Mire J,et al.Structureofapo-andmonometalatedformsofNDM-1—ahighlypotentcarbapenem-hydrolyzingmetallo-β-lactamase[J].Plos One,2011,6(9):e24621.

[30]Green V L,Verma A,Owens R J,et al.Structureofnewdelhimetallo-β-lactamase1(NDM-1)[J].Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun,2011,67(10):1160-1164.

[31]Yu G,Jing W,Niu G,et al.AstructuralviewoftheantibioticdegradationenzymeNDM-1fromasuperbug[J].Protein Cell,2011,2(5):384-394.

[32]Aitha M,Moller A J,Sahu I D,et al.InvestigatingthepositionofthehairpinloopinNewDelhimetallo-β-lactamase,NDM-1,duringcatalysisandinhibitorbinding[J].J Inorg Biochem,2015,156(7):35-39.

[33]Rehman M T,Khan A U.Roleofnon-activesiteresidueTrp-93inthefunctionandstabilityofNewDelhiMetallo-β-Lactamase-1(NDM-1)[J].Antimicrob Agents Chemother,2015,60(1):356-360.

[34]Marcoccia F,Bottoni C,Sabatini A,et al.KineticstudyoflaboratorymutantsofNDM-1metallo-β-lactamase:theimportanceofanisoleucineatposition35[J].Antimicrob Agents Chemother,2016,60(4):2366-2372.

[35]Kim Y,Cunningham M A,Mire J,et al.NDM-1,theultimatepromiscuousenzyme:substraterecognitionandcatalyticmechanism[J].FASEB J,2013,27(5):1917-1927.

[36]Wang Z.Metallo-beta-lactamase:structureandmechanism[J].Curr Opin Chem Biol,1999,3(5):614-622.

[37]Yang H,Aitha M,Marts A R,et al.Spectroscopicandmechanisticstudiesofheterodimetallicformsofmetallo-β-lactamaseNDM-1[J].J Am Chem Soc,2014,136(20):7273-7285.

[38]Yuan Q,He L,Ke H.Apotentialsubstratebindingconformationofβ-lactamsandinsightintothebroadspectrumofNDM-1activity[J].Antimicrob Agents Chemother,2012,56(10):5157-5163.

[39]Chiou J,Leung T Y,Chen S.MolecularmechanismsofsubstraterecognitionandspecificityofNewDelhimetallo-β-lactamase[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(9):5372-5378.

[40]Zhu K,Lu J,Ye F,et al.Structure-basedcomputationalstudyofthehydrolysisofNewDelhimetallo-β-lactmase-1[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,431(1):2-7.

[41]Liang Z,Li L,Wang Y,et al.MolecularBasisofNDM-1,anewantibioticresistancedeterminant[J].PloS One,2010,6(8):e23606.

[42]Zheng M,Xu D.NewDelhimetallo-β-lactamaseI:substratebindingandcatalyticmechanism[J].J Phys Chem B,2013,117(39):11596-11607.

[43]Wang Z,Walter Fast A,Benkovic S J.Onthemechanismofthemetallo-β-lactamasefromBacteroidesfragilisn[J].Biochemistry,1999,38(31):10013-10023.

[44]Yang H,Aitha M,Hetrick A M,et al.Mechanisticandspectroscopicstudiesofmetallo-β-lactamaseNDM-1[J].Biochemistry,2012,51(18):3839-3847.

[45]Zhu K,Lu J,Liang Z,et al.Aquantummechanics/molecularmechanicsstudyonthehydrolysismechanismofNewDelhimetallo-β-lactamase-1[J].J Comput Aid Mol Des,2013,27(3):247-256.

[46]Li N,Xu Y,Xia Q,et al.SimplifiedcaptoprilanaloguesasNDM-1inhibitors[J].Bioorg Med Chem Lett,2014,24(1):386-389.

[47]Shen B,Yu Y,Chen H,et al.Inhibitordiscoveryoffull-lengthnewdelhimetallo-β-lactamase-1(NDM-1)[J].PloS One,2013,8(5):e62955.

[48]Wang X,Lu M,Shi Y,et al.DiscoveryofnovelNewDelhimetallo-β-lactamases-1inhibitorsbymultistepvirtualscreening[J].Plos One,2015,10(3):e0118290.

[49]Rydzik A M,Brem J,van Berkel S S,et al.MonitoringconformationalchangesintheNDM-1metallo-beta-lactamaseby19FNMRspectroscopy[J].Angew Chem Int Edit,2014,53(12):3129-3133.

[50]Klingler F M,Moser D,Büttner D,et al.Probingmetallo-β-lactamaseswithmolecularfragmentsidentifiedbyconsensusdocking[J].Bioorg Med Chem Lett,2015,25(22):5243-5246.

[51]Gan M,Liu Y,Bai Y,et al.Polyketideswithnewdelhimetallo-β-lactamase1inhibitoryactivityfromPenicilliumsp[J].J Nat Prod,2013,76(9):1535-1540.

[52]Christopeit T,Albert A,Leiros H K.Discoveryofanovelcovalentnon-β-lactaminhibitorofthemetallo-β-lactamaseNDM-1[J].Bioorg Med Chem,2016,24(13):2947-2953.

[53]Thomas P W,Spicer T,Cammarata M,et al.Analteredzinc-bindingsiteconfersresistancetoacovalentinactivatorofNewDelhimetallo-beta-lactamase-1(NDM-1)discoveredbyhigh-throughputscreening[J].Bioorg Med Chem,2013,21(11):3138-3146.

[54]Thomas P W,Cammarata M,Brodbelt J S,et al.Covalentinhibitionofnewdelhimetallo-β-lactamase-1(NDM-1)bycefaclor[J].ChemBioChem,2014,15(17):2541-2548.

[55]Chiou J,Wan S,Chan K F,et al.Ebselenasapotentcovalentinhibitorofnewdelhimetallo-β-lactamase(NDM-1)[J].Chem Commun,2015,51(46):9543-9546.

[56]Ma J,McLeod S,MacCormack K，et al.Real-timemonitoringofnewdelhimetallo-β-lactamaseactivityinlivingbacterialcellsby1HNMRspectroscopy[J].Angew Chem Int Edit,2011,126(8):2162-2165.

[57]Azumah R,Dutta J,Somboro A M,et al.Invitroevaluationofmetalchelatorsaspotentialmetallo-β-lactamaseinhibitors[J].J Appl Microbiol,2016,120(4):860-867.

[58]Falconer S B,Reid-Yu S A,King A M,et al.Zincchelationbyasmall-moleculeadjuvantpotentiatesmeropenemactivityinvivoagainstNDM-1-producingklebsiellapneumoniae[J].Acs Infect Dis,2015,1(11):533-543.

[59]Mikami Y,Suzuki T.Novelmicrobialinhibitorsofangiotensin-convertingenzyme,aspergillomarasminesAandB[J].Agric Biol Chem,1983,47(11):2693-2695.

[60]Arai K,Ashikawa N,Nakakita Y,et al.AspergillomarasmineAandB,potentmicrobialinhibitorsofendothelin-convertingenzyme[J].Biosci Biotechnol Biochem,2014,57(11):1944-1945.

[61]Matsuura A,Okumura H,Asakura R,et al.Pharmacologicalprofilesofaspergillomarasminesasendothelinconvertingenzymeinhibitors[J].Jpn J Pharmacol,1993,63(2):187-193.

[62]King A M,Reidyu S A,Wang W,et al.AspergillomarasmineAovercomesmetallo-β-lactamaseantibioticresistance[J].Nature,2014,510(7506):503-506.

[63]Christopeit T,Leiros H S.Fragment-baseddiscoveryofinhibitorscaffoldstargetingthemetallo-β-lactamasesNDM-1andVIM-2[J].Bioorg Med Chem Lett,2016,26(8):1973-1977.

Advance Research on NDM-1:Structure,Catalytic Mechanism and Inhibitors

HUJianping1,2,ZUOKe1,2,WANHua3

(1.School of Pharmacy and Bioengineering，Chengdu University, Chengdu 610106, China;2.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu University, Chengdu 610052, China;3.College of Mathematics and Informatics, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

As the first-line antibiotics,β-lactam antibiotics are widely used in the clinical treatment of various infections.New Delhi metallo-β-lactamase-1(NDM-1) encoded by gene blaNDM-1in plasmid DNA can hydrolyze nearly all kinds of β-lactam antibiotics,posing a critical threat to the application of β-lactamase.It is of great urgency to design novel NDM-1 inhibitors.The design and modification of inhibitor molecules are closely related to the research of both structural information and catalytic mechanism of NDM-1.In this review,structure,catalytic mechanism and inhibitors of NDM-1 all are summarized,which will be helpful for the design and modification of drug molecules targeting NDM-1.

antimicrobial resistance;NDM-1;catalytic mechanism;inhibitor;drug design

1004-5422(2017)02-0115-10

2017-03-02.

國(guó)家自然科學(xué)基金(31600591、 11247018)資助項(xiàng)目.

胡建平(1978 — )， 男， 博士， 教授， 從事計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)研究.

Q55；R915

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