劉福輝

(福建省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，福建 福州 350003)

植物在生長發(fā)育過程中會受到各種非生物因子的脅迫，其中溫度是影響植物生長的主要因子之一。高溫脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)部酶促反應(yīng)會發(fā)生劇烈變化，酶活性變化會引發(fā)系列植物細(xì)胞代謝失衡，使光合作用和呼吸過程受到影響[1]。植物通過調(diào)節(jié)新陳代謝進(jìn)行熱脅迫響應(yīng)，如產(chǎn)生能促進(jìn)蛋白和細(xì)胞重建的物質(zhì)、調(diào)節(jié)滲透來保持細(xì)胞膨脹、改變體內(nèi)氧化系統(tǒng)來重建細(xì)胞平衡和穩(wěn)態(tài)等。當(dāng)高溫脅迫不斷加強(qiáng)，將導(dǎo)致植物細(xì)胞膜損傷、光合作用受到抑制、細(xì)胞老化死亡，甚至植物表現(xiàn)出外觀形態(tài)的熱害癥狀[2]。圓齒野鴉椿(Euscapiskonishii)為省沽油科(Staphyleaceae)野鴉椿屬(Euscapis)的常綠小喬木，分布福建、廣東、廣西、江西等省區(qū)[3]。其樹形婆娑優(yōu)美，春夏之際，新枝鮮紅，老枝暗紅，黃綠花序多而密；秋季，蓇葖果由綠轉(zhuǎn)紅，紅果期跨越秋、冬和翌年春三季。成熟果實沿內(nèi)腹縫線開裂，鮮紅色內(nèi)果皮外翻呈兩瓣蝴蝶翅狀，觀果期長達(dá)8個月，是一極具潛力的園林綠化樹種[4，5]。作為傳統(tǒng)民間藥用植物，其根、果性溫，味微苦，有祛風(fēng)除濕，止血止痛，發(fā)表散寒等功效[6]。目前，對圓齒野鴉椿的研究集中于生物學(xué)特性、種苗繁育技術(shù)、生理生化特性以及開發(fā)利用等方面[5，7～8]，未見有關(guān)高溫脅迫下圓齒野鴉椿幼苗的光合特性、抗氧化酶和碳水化合物代謝方面的報道。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2016年3月，將經(jīng)過1年沙藏處理的裂口5%左右的圓齒野鴉椿種子播種于上口徑15 cm、下口徑10 cm、高10 cm的塑料花盆中，栽培基質(zhì)為炭化谷殼、黃心土和泥炭土，按體積比2∶1∶1混合均勻，每盆均勻撒播30～40粒種子。放入福建農(nóng)林大學(xué)田間試驗溫室中育苗。

1.2 試驗設(shè)計與處理

每盆留苗25～30株，待苗高約15 cm時，選健康、無病蟲害、長勢好的作為試驗苗，共計20盆。轉(zhuǎn)入人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)。生長條件為晝夜溫度25℃/20℃，相對濕度65%～75%，光周期為10h.d-1。預(yù)培養(yǎng)7d后進(jìn)行溫度處理，其中一個生長箱晝夜溫度為25℃/20℃(對照)，另一個生長箱晝夜溫度為35℃/25℃(高溫處理)，每個處理10次重復(fù)，相對濕度仍為65%～75%，光周期為10h.d-1。各處理盆栽土壤含水量保持30%～35%。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 葉綠素含量測定

溫度處理后，分別于第1天、第2天、第3天和第4天，取正常生長的新鮮幼苗葉片各0.2 g，剪碎后研磨成勻漿，徹底離心后選用分光光度法對類胡蘿卜素的含量加以測定，而葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量的測定則采用Arnon的方法[9]。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

分別于高溫處理20 min、25 min、30 min、35 min后，隨機(jī)選取各組幼苗10片葉，采用FMS-2型熒光儀進(jìn)行測定。葉綠素?zé)晒鉁y定過程中，提前將試驗材料暗處理30 min，之后再利用12 000 μmol·m-2·s-1的飽和脈沖光照射，試驗完畢后測定PSII最大的光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm、光化學(xué)猝滅系數(shù)qP、PSII系數(shù)和1- qP[9]。

1.3.3 碳水化合物的提取

待培養(yǎng)1個月后，取若干葉片樣本，各試驗組中摘取0.1 g葉片研磨后置于試管中，15 min后向其中倒入8 ml濃度為75%的乙醇進(jìn)行80℃水浴30 min，后全部離心再反復(fù)進(jìn)行提純，用活性炭對提取液中的色素進(jìn)行吸附。將試管烘干，加入3 ml蒸餾水后搖勻放置于沸水中加熱片刻，待徹底冷卻后向其中滴入3 ml濃度9 mol·L-1高氯酸反復(fù)進(jìn)行提取后將上清液取出待用[9]。

1.3.4 酶液的提取

待培養(yǎng)1個月后，各試驗組中分別摘取0.2 g新鮮葉片，研磨后向其中注入2 mL 25 mM的HEPES和2.5%的非溶性PVP，研磨后離心15 min取其上清液待檢測酶液[9]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用EXCELL 2003和SPSS.19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對碳水化合物代謝的影響

高溫脅迫下圓齒野鴉椿葉片中蔗糖、可溶性糖、還原性糖比對照組分別提高47.8%、9.8%、18.6%；但淀粉含量僅為非高溫脅迫下淀粉含量的68.5%。淀粉含量的下降可能是由于溫度升高導(dǎo)致圓齒野鴉椿幼苗葉片內(nèi)淀粉發(fā)生降解，直接導(dǎo)致了蔗糖、還原性糖等可溶性糖含量直接升高，其作用在于使植物細(xì)胞膜的成分更加固定，一定程度上能夠降低高溫脅迫對圓齒野鴉椿幼苗的危害。碳水化合物含量的變化能一定程度上體現(xiàn)當(dāng)前時間段圓齒野鴉椿幼苗光合作用效率的高低。一般情況下，光合作用效率的提升能夠使得植物體內(nèi)碳水化合物含量得到提高，而本試驗中碳水化合物含量的變化也證明了試驗過程中圓齒野鴉椿幼苗的光合作用效率發(fā)生了變化。

圖1 高溫脅迫對圓齒野鴉椿碳水化合物含量的影響

2.2 對葉綠素含量的影響

高溫脅迫下，圓齒野鴉椿幼苗葉片內(nèi)葉綠素a含量、葉綠素b含量、總?cè)~綠素含量和類胡蘿卜素含量比對照組降低了20.5～31.5%、20～30%、22.5～30.5%和18.5～29.5%，降幅依次為26%、25%、26.5%和24%。隨著高溫脅迫的不斷持續(xù)，圓齒野鴉椿幼苗體內(nèi)葉綠素和類胡蘿卜素的含量均呈現(xiàn)先降后升的趨勢，但總體是明顯下降。

圖2 高溫脅迫對圓齒野鴉椿幼苗葉綠素、類胡蘿卜素含量的影響

圖3 高溫脅迫對圓齒野鴉椿葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.3 對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

Fv/Fm代表PSII最大的光化學(xué)量子產(chǎn)量，qP代表光化學(xué)猝滅系數(shù)，反映PSII中心電化學(xué)反應(yīng)的能力強(qiáng)弱，系數(shù)越大，則表明電子傳遞活性的強(qiáng)度也就越高。高溫脅迫導(dǎo)致了Fv/Fm呈下降趨勢，PSII系數(shù)也呈下降趨勢，但是在25～30 min的過程中對照組和高溫脅迫之后的圓齒野鴉椿都有些許波動，表明高溫脅迫下，圓齒野鴉椿幼苗同化力(NADPH、ATP)的形成受阻，影響了植物對碳的固定和同化。隨著脅迫時間的延長，qP逐漸降低，而1-qP逐漸升高，表明PSII的還原狀態(tài)在高溫脅迫下相對較高。

2.4 對抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶是動植物體內(nèi)抵抗細(xì)胞衰老的重要物質(zhì)，其機(jī)理在于組織細(xì)胞與氧氣的直接接觸，從而減緩細(xì)胞氧化速度。高溫脅迫下圓齒野鴉椿葉片、根莖中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性均大于對照組；葉片中愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(GPX)的活性大于對照組，但根莖中GPX的活性比對照組小。

圖4 高溫脅迫對圓齒野鴉椿葉片和根莖抗氧化酶活性的影響

3 討論

3.1 高溫對圓齒野鴉椿幼苗碳水化合物代謝的影響

高溫脅迫可引起植物細(xì)胞膜滲透性增大而導(dǎo)致電解質(zhì)滲透。為防止電解質(zhì)過多外滲，植物通過調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和含量以適應(yīng)逆境，其中可溶性糖是植物組織中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一[10]。本研究結(jié)果表明，高溫脅迫下，圓齒野鴉椿幼苗中可溶性糖含量比對照組高。當(dāng)可溶性糖含量較高時，可以降低細(xì)胞的滲透勢從而維持細(xì)胞的膨壓，防止細(xì)胞內(nèi)大量的被動脫水。淀粉是植物主要的能量儲藏物質(zhì)，是在葉綠體或淀粉體中通過一系列酶促反應(yīng)合成的，在高溫脅迫下，植物呼吸作用加強(qiáng)從而加快淀粉分解[11]。本研究結(jié)果中，高溫脅迫下淀粉的含量明顯比對照組低，說明淀粉在圓齒野鴉椿幼苗的耐熱性中起了重要作用。蔗糖是植物糖分的重要組成部分，它是植物光合作用的主要產(chǎn)物，是碳運輸?shù)闹饕问剑彩羌?xì)胞代謝的調(diào)控因子[12]。高溫脅迫下，蔗糖含量高于對照組，可能是因為幼苗為了適應(yīng)逆境，加快光合作用。

一般而言，溫度對于植物生長具有十分重要的影響，過高或過低都無法滿足植物生長。圓齒野鴉椿幼苗生長過程中，其新陳代謝的發(fā)生與體內(nèi)一系列的酶促反應(yīng)息息相關(guān)，當(dāng)溫度未達(dá)到抑制酶促反應(yīng)發(fā)生所需的最高溫度，則當(dāng)溫度升高時，幼苗體內(nèi)的酶活性提升，所引發(fā)的酶促反應(yīng)相對更加劇烈。在此情況下，圓齒野鴉椿幼苗葉片內(nèi)蔗糖、還原性糖、可溶性糖含量分別提升，而隨著溫度的不斷升高，淀粉開始分解，進(jìn)而提升蔗糖、還原性糖、可溶性糖的整體含量，而在此過程中淀粉含量逐漸降低。

3.2 高溫對圓齒野鴉椿幼苗葉片光合作用的影響

光合作用是一切生物直接或間接的能量來源，是植物進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量代謝的關(guān)鍵。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)通過對植物光合過程中熒光特性的探測可了解植物的生長、病害及受脅迫等生理狀態(tài)[13]。研究表明正常生長植物葉片中光能轉(zhuǎn)化效率達(dá)到0.85。當(dāng)對正常生長的植物進(jìn)行高溫脅迫時，光能轉(zhuǎn)化效率會降低，反映在高溫脅迫過程中植物葉片細(xì)胞的光合作用受到抑制[14]。PSII指標(biāo)反映光合作用過程中線性電子傳遞電子流的能力強(qiáng)弱，在正常的光合作用過程中線性電子傳遞電子流的能量對于植物的正常生長發(fā)育至關(guān)重要。本研究中，在高溫脅迫下，PSII、Fv/Fm和qP明顯降低，而1-qP增大，這與Abdul K等人的研究結(jié)果一致[15]。表明光合電子傳遞以分子態(tài)氧為受體的支路反應(yīng)增強(qiáng)和PSII的部分失活，抑制光合碳代謝電子供應(yīng)，導(dǎo)致光合作用受阻[16]，同時葉片細(xì)胞的有機(jī)物合成能力也受到抑制。

葉綠素作為植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量在一定程度上反映了葉片光合作用能力的大小[17]。本研究表明，高溫脅迫導(dǎo)致圓齒野鴉椿幼苗葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量明顯降低，原因可能有3點：一是高溫脅迫降低葉綠素合成速率。大多數(shù)植物即使在短時間(15～60 min)的高溫(35～40℃)脅迫下，其光合作用就會受到明顯的抑制[18]。二是高溫脅迫導(dǎo)致活性氧的積累，加速葉綠素的降解[19]。三是本研究中葉綠素a、b下降的不平衡性，導(dǎo)致葉片光合作用的降低，這與張桂蓮[20]等人的研究結(jié)果相同。類胡蘿卜素既是光合色素，又是細(xì)胞內(nèi)源抗氧化劑，一方面吸收光能并傳遞給反應(yīng)中心，另一方面可以吸收剩余能量，淬滅活性氧，防止膜質(zhì)過氧化，因此類胡蘿卜素的減少，也可導(dǎo)致葉綠素含量的降低[21]。

3.3 高溫對圓齒野鴉椿幼苗抗氧化酶活性的影響

植物正常生長的細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，自由基水平很低，不會傷害細(xì)胞。當(dāng)植物受到高溫脅迫時，植物體內(nèi)的活性氧含量增加，若不及時清除，必導(dǎo)致氧化脅迫，膜系統(tǒng)受到破壞，打破自由基的平衡，導(dǎo)致植物體內(nèi)的自由基清除機(jī)制遭到破壞[22]。為避免這種傷害，植物在長期的進(jìn)化過程中，形成一套活性氧的清除體系，主要包括酶促防御系統(tǒng)和非酶促防御系統(tǒng)[23]。酶促防御系統(tǒng)主要由SOD、AXP、GPX和CAT構(gòu)成，其中，CAT通過催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的分解，防止膜質(zhì)過氧化[24]；APX利用抗壞血酸為電子供體的H2O2清除劑，大量研究表明葉綠體中的H2O2由APX清除[25]；GPX是動物細(xì)胞中的一種重要H2O2清除劑，但是現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)在植物中GPX也具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害的作用[26]。在本研究中，高溫脅迫下，圓齒野鴉椿葉片中SOD、AXP、GPX和CAT的活性提高，表明葉片對高溫脅迫產(chǎn)生的適應(yīng)反應(yīng)；根莖SOD、AXP和CAT的活性也提高了，但GPX活性卻呈現(xiàn)下降趨勢，可能是根莖還不適應(yīng)高溫環(huán)境。

[1] 王利琳, 龐基良, 胡江琴, 等．溫度對植物成花的影響 [J]．植物學(xué)通報, 2002, 19 (2): 5-8．

[2] 屠小菊, 汪啟明, 饒力群. 高溫脅迫對植物生理生化的影響 [J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013 (7): 28-30.

[3] 鄒小興, 劉宇, 鄒雙全. 圓齒野鴉椿葉及枝化學(xué)成分初步研究 [J]. 中國野生植物資源, 2016, 35(1): 70-72.

[4] 敖小朋, 徐耀東, 童志剛．野生賞藥兼用植物野鴉椿 [J]．廣西農(nóng)學(xué)報, 2009, 24 (1): 45-46．

[5] 孫維紅，袁雪艷，吳玲嬌，等.圓齒野鴉椿開花動態(tài)特征和繁育系統(tǒng) [J]. 植物生理學(xué)報,2017,53 (12): 2215-2221.

[6] 覃嘉佳, 龍云英．圓齒野鴉椿扦插繁殖技術(shù) [J]．林業(yè)科技開發(fā), 2007, 21 (3): 71-73．

[7] 何碧珠, 何官榕, 鄒雙全．圓齒野鴉椿葉片的植株再生及快速繁殖 [J]．福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010, 39 (3): 257-262．

[8] 黃銘星, 鄒雙全, 陳琳, 等．施用人工菌劑對圓齒野鴉椿幼苗移栽生長的影響 [J]．福建林學(xué)院學(xué)報, 2013, 33 (1): 25-27．

[9] 李合生．植物生理生化試驗原理和技術(shù) [M]．北京: 高等教育出版社, 2000．

[10] Patton A J, Cunningham S M, Volenec J J, et al. Differences in Freeze Tolerance of Zoysiagrasses: II. Carbohydrate and Proline Accumulation All rights reserved. No part of this periodical may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, recording, or any information storage and retrieval system, without permission in writing from the publisher. Permission for printing and for reprinting the material contained herein has been obtained by the publisher [J]. Crop Science, 2007, 47(5): 2170-2181.

[11] 王日明, 熊興耀. 高溫脅迫對黑麥草生長及生理代謝的影響 [J]. 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(8): 81-90.

[12] 張建波, 金云峰, 王莎莎, 等. 生長溫度對不同生育期煙草蔗糖代謝的影響 [J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2015 (10): 2225-2244.

[13] 馮偉, 李曉, 王永華, 等. 小麥葉綠素?zé)晒鈪?shù)葉位差異及其與植株氮含量的關(guān)系 [J]. 作物學(xué)報, 2012, 38(4): 657-664.

[14] 賈虎森, 李德全, 韓亞琴．高等植物光合作用的光抑制研究進(jìn)展 [J]．植物學(xué)通報, 2000, 17 (3): 218-224．

[15] Karim A, Fukamachi H, Hidaka T. Photosynthetic performance of Vigna radiata L. leaves developed at different temperature and irradiance levels [J]. Plant Science, 2003, 164(4): 451-458.

[16] 彭長連, 林植芳. 光氧化脅迫下幾種植物葉片的超氧自由基產(chǎn)生速率和光合特性 [J]. 植物生理學(xué)報, 2000, 26(2): 81-87.

[17] 朱先燦, 宋鳳斌, 徐洪文. 低溫脅迫下叢枝菌根真菌對玉米光合特性的影響 [J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2010, 21(2): 470-475.

[18] Xu Q, Huang B. Lowering soil temperatures improves creeping bentgrass growth under heat stress[J]. Crop Science, 2001, 41(6): 1878-1883.

[19] 徐娜婷, 劉玉民, 劉亞敏, 等. 引種花卉紫串扦插苗對高溫脅迫的生理響應(yīng) [J]. 草業(yè)學(xué)報, 2012, 21(5): 257-263.

[20] 張桂蓮, 陳立云, 張順堂, 等. 抽穗開花期高溫對水稻劍葉理化特性的影響 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007(7)：1345-1352.

[21] 汪炳良. 高溫脅迫對早熟花椰菜葉片抗氧化系統(tǒng)和葉綠素及其熒光參數(shù)的影響 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 37(08): 1245-1245.

[22] 張悅, 井維霞, 劉修堂, 等. 不同濃度安打?qū)煵萦酌?MDA, CAT, APX 和 GPX 的影響 [J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2013 (1): 22-25.

[23] Inzé D, Van Montagu M. Oxidative stress in plants [J]. Current Opinion in Biotechnology, 1995, 6(2): 153-158.

[24] Van Breusegem F, Vranová E, Dat J F, et al. The role of active oxygen species in plant signal transduction [J]. Plant Science, 2001, 161(3): 405-414.

[25] 孫小妹, 張濤, 陳年來, 等. 土壤水分和氮素對春小麥葉片抗氧化系統(tǒng)的影響 [J].干旱區(qū)研究, 2011(2)：205-214.

[26] 王艷, 李建龍, 鄧?yán)? 等. H2O2 對溝葉結(jié)縷草抗氧化系統(tǒng)及其耐寒性的影響 [J]. 中國草地學(xué)報, 2010, 32(2): 92-97.