楊春艷，陳 英，劉 飛*，胡 瓊

(1.玉溪師范學(xué)院 物理系，云南 玉溪 653100； 2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，云南 昆明 650212)

蘋果葉部病害的傅里葉變換紅外光譜鑒別研究

楊春艷1，陳 英1，劉 飛1*，胡 瓊2

(1.玉溪師范學(xué)院 物理系，云南 玉溪 653100； 2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，云南 昆明 650212)

為建立一種基于傅里葉變換紅外光譜技術(shù)結(jié)合光譜檢索和逐步判別分析的蘋果葉部病害快速鑒別方法，以白粉病、花葉病、炭疽葉枯病和早期落葉病4種病害,共60份樣本的紅外光譜、一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜為指標(biāo)，利用Omnic 8.5 軟件中光譜檢索功能依次與相應(yīng)光譜庫進(jìn)行檢索鑒別。檢索結(jié)果顯示：基于一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜的檢索正確率均為96.7%，高于基于紅外光譜檢索的83.3%。同時，以樣品光譜差異較大的1 800～1 000 cm-1波數(shù)內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜數(shù)據(jù)作為判別變量，利用SPSS 20.0軟件中的逐步判別分析功能，比較了基于5種挑選判別變量方法建立的判別模型的鑒別效果。鑒別結(jié)果顯示：采用Mahalanobis 距離逐步判別法建立的模型對蘋果葉部病害的鑒別效果最好，對訓(xùn)練樣本的回判正確率為100.0%，對測試樣本的預(yù)測正確率為80.8%，總正確率最高，為92.3%。綜上表明，傅里葉變換紅外光譜技術(shù)結(jié)合光譜檢索法或逐步判別分析法，均能較好地診斷蘋果葉部病害種類，可為蘋果葉部病害的鑒別和診斷提供一種省時、易行的方法。

蘋果病害； 鑒別； 傅里葉變換紅外光譜； 光譜檢索； 逐步判別分析

蘋果性味溫和，含有豐富的糖類、有機酸、纖維素、維生素、礦物質(zhì)、多酚等人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)，是公認(rèn)的營養(yǎng)程度較高的健康水果之一。生產(chǎn)中，各類細(xì)菌、真菌和病毒引起的病害使蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響，給果農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，及時、準(zhǔn)確地診斷病害，對提高蘋果的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。

目前，蘋果病害的鑒別主要是通過技術(shù)人員到現(xiàn)場，根據(jù)病株的發(fā)病部位、時期、病斑形狀和顏色等診斷，存在主觀性強、誤差大的缺點。生物學(xué)檢測、生理生化測定等方法雖然準(zhǔn)確性高，但需進(jìn)行病原分離、培養(yǎng)等一系列復(fù)雜過程，操作繁瑣、耗時長、成本高。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術(shù)以準(zhǔn)確性高、制樣簡單、速度快、成本低等優(yōu)點，已經(jīng)用于植物病蟲害的鑒別，如李志永等[1]基于FTIR技術(shù)，利用主成分分析的方法研究鑒別了不同的蠶豆病害，劉飛等[2]通過FTIR技術(shù)結(jié)合判別分析方法對蠶豆病蟲害進(jìn)行了鑒別研究，任先培等[3]利用FTIR技術(shù)結(jié)合相關(guān)性分析的方法對煙葉病害進(jìn)行了鑒別研究，劉艷等[4]通過FTIR技術(shù)結(jié)合聚類分析的方法對柳樹病葉進(jìn)行研究，但利用FTIR技術(shù)對蘋果病害進(jìn)行研究，同時利用光譜檢索的方法對植物病害進(jìn)行鑒別均未見報道。因此，基于蘋果病害葉片樣品的傅里葉變換紅外光譜及其一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜，分別采用光譜檢索、逐步判別分析的方法對蘋果葉部病害進(jìn)行鑒別研究，以期為蘋果葉部病害的及時、準(zhǔn)確診斷提供思路。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與制備

試驗用白粉病、花葉病、炭疽葉枯病和早期落葉病4種蘋果病害葉片均采自昭通市昭陽區(qū)灑漁鄉(xiāng)果園，每類病害各取15片葉，共60個樣本。采集的葉片經(jīng)洗凈、晾干，測試前放入烘箱中以40 ℃恒溫烘至恒質(zhì)量。測試光譜時，避開主葉脈取樣。樣品放入瑪瑙研缽磨為均勻細(xì)粉后，按樣品和溴化鉀1∶70的質(zhì)量比加入溴化鉀攪磨均勻，壓片測試光譜。每個葉片樣品壓制1個掃描片。

1.2 試驗儀器

試驗所用儀器為PE公司生產(chǎn)的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀，裝備DTGS探測器，光譜掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，累加掃描次數(shù)為16次。

1.3 試驗方法

所有測試所得光譜均已扣除背景，在Omnic 8.5軟件中進(jìn)行自動基線校正、平滑和縱坐標(biāo)歸一化處理，計算了各樣品紅外光譜的一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜，以及各類樣品的平均紅外光譜及其一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜，并依次建立Lib1、Lib2、Lib3 共3個光譜庫。

1.3.1 光譜檢索方法 光譜檢索是一種將未知類別物品的光譜與光譜庫中譜圖進(jìn)行逐點掃描，以找到最佳匹配，從而鑒別未知物類別的方法，匹配得分越高，說明相似度越高。鑒別中，未知分類樣品光譜與光譜庫中已知分類的光譜匹配得分最高的，即視為同類[5]。

Omnic 8.5 軟件中光譜檢索功能模塊共設(shè)置有專家檢索、相關(guān)性檢索、絕對差檢索、絕對微分差檢索、平方差檢索和平方微分差檢索6種檢索算法，其中絕對微分差檢索算法對特征性差的波譜帶不敏感，對信噪比差的未知物光譜檢索較為有利[6]，故本試驗選擇用絕對微分差檢索算法進(jìn)行蘋果葉部病害類型的鑒別。

1.3.2 逐步判別分析法 基于樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)，通過SPSS 20.0軟件中的逐步判別分析，按照Fisher函數(shù)系數(shù)選擇方法，建立判別模型進(jìn)行蘋果葉部病害類型的鑒別。判別分析中，在每類病害樣品中任意選擇9個樣本作為訓(xùn)練樣本，余下的6個樣本作為測試樣本，即共有36個訓(xùn)練樣本，24個測試樣本；使用的光譜數(shù)據(jù)在1 800～1 000 cm-1波數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果病害葉片的紅外光譜特征

從圖1可明顯看出，蘋果各類病害葉片的紅外光譜非常相似。在4 000～700 cm-1波數(shù)內(nèi)，顯示了3 343、2 927、2 858、1 726、1 626、1 518、1 447、1 375、1 314、1 247、1 208、1 167、1 073、894、831、778 cm-1附近共16個主要吸收峰。3 343 cm-1附近強且寬的吸收峰來自多糖中O-H的伸縮振動吸收和蛋白質(zhì)中N-H伸縮振動吸收的疊加，為光譜的最強峰；2 927、2 858 cm-1附近吸收峰來自甲基和亞甲基中C-H反對稱和對稱伸縮振動吸收。在1 800～1 500 cm-1波數(shù)內(nèi)C=O和C-O混合振動區(qū)，1 726 cm-1附近吸收峰歸屬脂類中C=O伸縮振動；1 626 cm-1附近的強吸收峰歸屬木質(zhì)素中與苯環(huán)相連的C=O的伸縮振動吸收[7]和草酸鈣中C-O反對稱伸縮振動吸收[8]以及蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶中C=O伸縮振動吸收的疊加峰；1 518 cm-1附近弱吸收峰歸屬木質(zhì)素中與苯環(huán)相連的C=O的伸縮振動吸收。在1 500～1 200 cm-1波數(shù)內(nèi)蛋白質(zhì)、木質(zhì)素和纖維素等多糖中C-H、C-O、C-O-C振動的混合吸收區(qū)，1 447、1 375 cm-1附近吸收峰歸屬木質(zhì)素中甲基的反對稱彎曲振動[9]和纖維素中甲基的對稱彎曲振動；1 314 cm-1附近吸收峰來自纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等受氧、氮原子影響的甲基和亞甲基對稱彎曲振動吸收[3]和草酸根負(fù)離子中C-O反對稱伸縮振動吸收的疊加峰[8]；1 247 cm-1附近弱吸收峰為木質(zhì)素中苯烴基C-O的伸縮振動吸收和蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶吸收的疊加峰；1 208 cm-1附近弱吸收峰歸屬木質(zhì)素中C-O-C伸縮振動。1 200～700 cm-1波數(shù)是纖維素等多糖中C-H彎曲振動、C-O-C和C-O伸縮振動以及草酸根中C-O彎曲振動的混合吸收區(qū)。1 167、1 073 cm-1附近吸收峰歸屬纖維素中C-O-C和C-O的伸縮振動吸收；894、831 cm-1附近弱吸收峰歸屬纖維素中C-H剪式振動吸收和木質(zhì)素中C-H面內(nèi)彎曲振動吸收；778 cm-1附近弱吸收峰歸屬草酸根中C-O彎曲振動吸收。上述光譜特征表明，蘋果葉片光譜主要由纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和脂類化合物的吸收帶組成。

A、B、C、D依次為白粉病、花葉病、炭疽葉枯病、早期落葉病，下同

2.2 蘋果病害葉片的光譜差異

盡管不同蘋果病害葉片的紅外光譜吸收峰的峰形、峰位和峰強非常相似，但在1 800～1 000 cm-1波數(shù)仍存在部分差異，根據(jù)這些差異可以對蘋果葉部病害進(jìn)行鑒別。從表1可知，不同病害葉片的光譜差異主要表現(xiàn)在：(1) 在反映脂類中C=O伸縮振動吸收的1 726 cm-1附近，只有炭疽葉枯病葉片的紅外光譜未顯示明顯的吸收峰；(2)在反映纖維素中甲基對稱彎曲振動吸收的1 375 cm-1附近，只有花葉病葉片的紅外光譜未顯示吸收峰；(3) 白粉病葉片光譜在1 208 cm-1附近顯示了弱的吸收峰，花葉病、炭疽葉枯病、早期落葉病葉片光譜未顯示此峰；(4)在反映纖維素和半纖維素中C-O-C伸縮振動吸收的1 167 cm-1附近，只有早期落葉病葉片光譜未顯示明顯的吸收峰；(5)在反映木質(zhì)素中C=O伸縮振動吸收和草酸鈣中C-O反對稱伸縮振動吸收的疊加峰處(1 626 cm-1附近)，除早期落葉病葉片光譜的吸收峰為強峰外，其余均為極強峰;(6)早期落葉病葉片光譜在1 447 cm-1附近顯示了弱的吸收峰，其余均顯示中等強度吸收峰；(7)在反映木質(zhì)素中苯羥基C-O的伸縮振動和蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ吸收的疊加峰處(1 247 cm-1附近)，白粉病和炭疽葉枯病葉片的光譜顯示了中等強度的吸收峰，花葉病和早期落葉病葉片光譜則顯示了弱吸收峰。

表1 1 800～1 000 cm-1波數(shù)內(nèi)蘋果病害葉片的紅外光譜吸收帶 cm-1

注：vs—極強；s—強；m—中等；w—弱；vw—極弱。

從上述分析可看出，依靠光譜圖上幾個特征吸收峰，可以粗略地將白粉病、花葉病、炭疽葉枯病、早期落葉病葉片的光譜區(qū)別開，為更準(zhǔn)確地區(qū)分4種病害，本研究基于4類樣品的紅外光譜進(jìn)行了光譜檢索鑒別和逐步判別分析鑒別。

2.3 蘋果葉部病害的紅外光譜檢索鑒別

對全部60份樣品的紅外光譜、一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜分別與相應(yīng)光譜庫進(jìn)行絕對微分差算法檢索，結(jié)果顯示，未知分類樣品的紅外光譜和導(dǎo)數(shù)光譜與相應(yīng)光譜庫的檢索匹配正確率均較高。未知分類樣品的紅外光譜與光譜庫Lib1的檢索結(jié)果中，匹配正確的有50個，匹配正確率為83.3%；未知分類樣品紅外光譜的一階導(dǎo)數(shù)光譜與光譜庫Lib2的檢索和二階導(dǎo)數(shù)光譜與光譜庫Lib3的檢索結(jié)果中，均有58個匹配正確，匹配正確率均為96.7%。表2中列出了未知分類樣品的紅外光譜及其導(dǎo)數(shù)光譜與相應(yīng)光譜庫的檢索中，分類不正確的樣品和得分高的前3個病害類型及得分，3種光譜數(shù)據(jù)類型檢索均正確的47份樣品的檢索鑒別信息未列出。

比較分析未知分類樣品的紅外光譜及其導(dǎo)數(shù)光譜分別與相應(yīng)光譜庫進(jìn)行絕對微分差算法檢索的結(jié)果，主要有以下4個特點：(1)檢索得分依次按未知分類樣品的紅外光譜與光譜庫Lib1、一階導(dǎo)數(shù)光譜與光譜庫Lib2和二階導(dǎo)數(shù)光譜與光譜Lib3進(jìn)行檢索的順序由高到低排列。(2)未知分類樣品的紅外光譜與光譜庫Lib1的檢索匹配正確率低于一階導(dǎo)數(shù)光譜與光譜庫Lib2和二階導(dǎo)數(shù)光譜與光譜Lib3進(jìn)行檢索的正確率。(3)未知分類樣品的紅外光譜與光譜庫Lib1的檢索分類中錯誤的10個樣品，在一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜與光譜庫Lib2的檢索和二階導(dǎo)數(shù)與光譜庫Lib3的檢索分類中均匹配正確。(4)未知分類樣品的紅外光譜與光譜庫Lib1的檢索分類中匹配正確的A12、D1和D5 樣品，D1在一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜與相應(yīng)光譜庫的檢索分類中均匹配錯誤；A12在基于一階導(dǎo)數(shù)光譜的檢索中匹配正確，在基于二階導(dǎo)數(shù)光譜的檢索中匹配錯誤，D5的情況則恰好和A12相反。

表2 基于不同類型光譜檢索鑒別中分類不正確的樣品

注：鑒別結(jié)果中，代表病害類型字母后的數(shù)字表示光譜檢索鑒別中的得分；斜體表示基于該類數(shù)據(jù)的檢索分類是正確的。

上述特點與導(dǎo)數(shù)光譜有利于在吸收光譜急劇變化區(qū)域中確定被掩蓋的弱吸收的存在和確定重疊峰處吸收帶的數(shù)目[10]，實現(xiàn)放大光譜差異的特征相吻合，從而一方面降低了未知分類樣品的導(dǎo)數(shù)光譜與光譜庫中譜圖的親密程度，也即降低了匹配得分，另一方面，使得在基于紅外光譜的檢索中匹配錯誤的部分樣品在放大了差異的導(dǎo)數(shù)光譜的檢索中匹配正確。此外，由于導(dǎo)數(shù)光譜在放大光譜差異的同時，也降低了光譜的信噪比，使得在基于紅外光譜的檢索中匹配正確的個別樣品在導(dǎo)數(shù)光譜的檢索中匹配錯誤?？傮w來看，基于3種類型的光譜進(jìn)行光譜檢索匹配來鑒別蘋果葉部病害都是可行的，且導(dǎo)數(shù)光譜更合適。

2.4 蘋果葉部病害的逐步判別分析鑒別

以樣品光譜差異較大的1 800～1 000 cm-1波數(shù)內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜數(shù)據(jù)作為判別變量，按步進(jìn)式方法，分別選用Wilks’lambda 、未解釋方差、Mahalanobis 距離、最小F值和Rao’s V 共5種挑選判別變量方式，依據(jù)Fisher線性準(zhǔn)則挑選函數(shù)系數(shù)，建立蘋果葉部病害類別的判別函數(shù)對樣品進(jìn)行判別。基于5種挑選判別變量方法建立的判別函數(shù)對樣品的鑒別分類結(jié)果見表3，同時為了驗證判別函數(shù)和模型的穩(wěn)定性，對不同挑選變量方法建立的判別函數(shù)均采用5折交叉法進(jìn)行驗證。

表3 不同挑選判別變量方法對蘋果葉部病害的鑒別結(jié)果

注：訓(xùn)練樣本情況中，每種情況的訓(xùn)練樣本總數(shù)均為36個，由每種病害樣品中隨機抽取9個樣本組成；5種樣本情況中，各樣品至少有1次作為訓(xùn)練樣本參與建模，至少有1次作為測試樣本進(jìn)行預(yù)測。

由表3可知，只有Mahalanobis 距離和最小F值2種挑選判別變量方法建立的判別函數(shù)在5種訓(xùn)練樣本情況下對訓(xùn)練樣本的回判正確率均為100.0%，其對測試樣本的預(yù)測正確率存在差異，前者為80.8%，后者為79.2%，平均總正確率分別為92.3%和91.7%，依次為5種方法中總正確率最高和次高。選擇Rao’s V 方法建立判別函數(shù)和模型時，預(yù)測正確率最低，為77.5%，平均總正確率也最低，為89.7%。

在同種挑選判別變量方法下，采用5折交叉驗證的不同訓(xùn)練樣本情況下對測試樣本的預(yù)測正確率差異的大小，反映了該方法所建立的判別模型的穩(wěn)定性[10]。5種訓(xùn)練樣本情況下，選擇最小F值方法時，對測試樣本的預(yù)測正確率差異最小，為8.3%，說明最小F值方法建立的判別模型相對最穩(wěn)定；選擇Mahalanobis 距離方法時，對測試樣本的預(yù)測正確率差異為12.5%，模型穩(wěn)定性僅次于最小F值方法建立的模型。綜合模型的穩(wěn)定性、模型對測試樣本預(yù)測的正確率和平均總正確率因素，基于樣品紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)的判別分析方法能鑒別蘋果葉部病害類型，其中Mahalanobis 距離逐步判別法診斷效果最好。

3 結(jié)論與討論

本研究利用FTIR技術(shù)測試了4種蘋果葉部病害共60份樣品的紅外光譜，通過Omnic 8.5 軟件計算了各樣品紅外光譜的一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜，建立了分別由各類樣品的平均紅外光譜、一階導(dǎo)數(shù)光譜、二階導(dǎo)數(shù)光譜組成的光譜庫。對各樣品的紅外光譜、一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜分別與相應(yīng)光譜庫進(jìn)行絕對微分差算法檢索，基于一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜檢索的分類正確率均為96.7%，高于基于紅外光譜的檢索分類正確率，表明基于導(dǎo)數(shù)光譜的蘋果葉部病害鑒別診斷效果較佳。以樣品光譜差異較大的1 800～1 000 cm-1波數(shù)內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜數(shù)據(jù)為判別變量，依據(jù)Fisher準(zhǔn)則挑選函數(shù)系數(shù)，比較了基于5種判別變量挑選方法所建立的判別函數(shù)的鑒別效果和模型的穩(wěn)定性，綜合考慮模型的穩(wěn)定性、模型對測試樣本預(yù)測的正確率和平均總正確率等因素，Mahalanobis 距離逐步判別法建立的模型診斷效果最好， 平均總正確率達(dá) 92.3%。以上結(jié)果表明，F(xiàn)TIR技術(shù)結(jié)合光譜檢索或FTIR技術(shù)結(jié)合逐步判別分析，可為蘋果葉部病害診斷提供一種快捷、易行的方法。

光譜檢索法和逐步判別分析法都是有監(jiān)督的模糊識別統(tǒng)計方法，需要根據(jù)已知樣本的分類情況，按照某種挑選指標(biāo)的方法對未知分類的樣本信息進(jìn)行逐一檢驗，以實現(xiàn)分類鑒別。因此，無論使用光譜檢索法還是逐步判別分析法進(jìn)行分類鑒別，都必須掌握大批按某種特征分類的樣本。蘋果病葉的傅里葉變換紅外光譜既包含病害信息，也包含品種、產(chǎn)地等信息，這些信息隱藏在樣品光譜中并相互交織。因此，基于病害葉片的光譜進(jìn)行病害類型鑒別分析時，若要建立好的模型，采集的樣本量必須足夠大，同種病害樣品覆蓋的品種和產(chǎn)地要多，且用以建立判別函數(shù)的訓(xùn)練樣本應(yīng)包含試驗樣本涉及的所有品種和產(chǎn)地。

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Identification of Apple Leaf Disease Type Based on Fourier Transform Infrared Spectroscopy

YANG Chunyan1,CHEN Ying1,LIU Fei1*,HU Qiong2

(1.Department of Physics,Yuxi Normal University,Yuxi 653100,China; 2.Department of Bioengineering,Yunnan Vocational and Technical College of Agriculture,Kunming 650212,China)

Fourier transform infrared(FTIR)spectroscopy combined with spectra retrieval and stepwise discrimination analysis was used to identify the disease type of apple.The infrared spectra of 60 samples from 4 diseases(powdery mildew,mosaic disease,anthrax blight and early deciduous disease) were collected and the first-derivative spectra and second-derivative spectra for all samples were calculated by the software Omnic 8.5,and three spectra libraries were constructed,separately.The absolute differential difference search using the infrared spectra,first-derivative spectra and second-derivative spectra was carried out,respectively.Results showed correct rate of 96.7% for the first-derivative spectra and second-derivative spectra,and 83.3% for the infrared spectra.The second-derivative spectra in the range of 1 800—1 000 cm-1were used to build models by stepwise discrimination analysis.The discrimination effectiveness was compared for the five ways to choose discrimination variance,and results showed that the model based on Mahalanobis distance method was better for the identification of apple disease type.The correct rate of returned classification reached 100.0%,the predication accuracy was 80.8%,and the total correct rate was 92.3%.The results indicate that as a time-saving and convenient method,the FTIR spectroscopy combined with spectra retrieval or stepwise discrimination analysis is feasible to distinguish the diseases of apple.

diseases of apple; identification; Fourier transform infrared spectroscopy; spectra retrieval; stepwise discrimination analysis

2016-12-19

云南省教育廳基金項目(2013Y480)；玉溪師范學(xué)院青年教師資助計劃項目

楊春艷(1979-)，女，云南大理人，副教授，碩士，主要從事激光紅外光譜研究。E-mail：ychyky@163.com

*通訊作者：劉 飛(1974-)，男，云南玉溪人，副教授，碩士，主要從事激光紅外光譜研究。 E-mail：yxtclf@163.com

S436.611.1;O657.33

A

1004-3268(2017)06-0156-05