戴偉娟 徐麗娟 王 旭 劉艷華 朱凡河

1.山東濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；2.山東省金鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院，山東 金鄉(xiāng) 272067

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穿心蓮內(nèi)酯對小鼠睪丸組織形態(tài)及NO、iNOS的影響

戴偉娟1徐麗娟2王 旭1劉艷華1朱凡河1

1.山東濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；2.山東省金鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院，山東 金鄉(xiāng) 272067

目的：觀察穿心蓮內(nèi)酯對小鼠睪丸組織形態(tài)及NO、iNOS的影響。方法：取體重25±3g昆明種雄性小鼠，隨機(jī)分為5組：生理鹽水組、穿心蓮內(nèi)酯低、中、高3個劑量組(66.7、200、600mg/kg)、雷公藤組(60mg/kg)，連續(xù)灌胃給藥60d。給藥結(jié)束后，處死小鼠，取睪丸，常規(guī)制備組織切片，觀察睪丸組織的形態(tài)學(xué)變化，并計數(shù)生精細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量。制備10%的組織勻漿，分別用硝酸還原酶法、化學(xué)比色法測定睪丸組織中NO濃度及iNOS活力。結(jié)果：與生理鹽水組相比，光鏡下可見穿心蓮內(nèi)酯三劑量組及雷公藤組，小鼠睪丸曲細(xì)精管發(fā)生不同程度的管壁變薄，生精細(xì)胞數(shù)量減少，排列疏松，不規(guī)則，成熟的精子較少。睪丸組織中iNOS活力降低，NO的含量減少。結(jié)論：長期服用穿心蓮內(nèi)酯產(chǎn)生的抗雄性生育作用與抑制iNOS活力，減少NO的生成有關(guān)。

穿心蓮內(nèi)酯；睪丸；NO；iNOS

穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide)又名穿心蓮乙素，是穿心蓮的主要有效成分之一，具有清熱解毒、涼血消腫的功效。藥理研究表明，穿心蓮內(nèi)酯具有解熱抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓、抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、保肝利膽等作用[1]。國外研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯有阻止精子生成、影響精子的活力與結(jié)構(gòu)的作用[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯體內(nèi)外給藥，對大鼠精子、胚胎及小鼠精子形成均有明顯影響，可使胚胎發(fā)育異常，精子數(shù)量和存活率降低[3]。為進(jìn)一步探討穿心蓮內(nèi)酯對睪丸組織的毒性作用及可能機(jī)制，實驗在前期工作的基礎(chǔ)上，觀察了睪丸組織的形態(tài)學(xué)改變，檢測了小鼠睪丸組織中NO和iNOS的變化，為闡明穿心蓮內(nèi)酯的生殖毒性機(jī)理提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體重(25±3)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(魯)20130001。1.2 藥品 穿心蓮內(nèi)酯片(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z370200500，山東方健制藥有限公司，標(biāo)示量0.105g)；雷公藤多甙片(批準(zhǔn)文號：Z31020415，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，標(biāo)示量10mg)；將穿心蓮內(nèi)酯片和雷公藤多甙片研碎，用生理鹽水分別配制成穿心蓮內(nèi)酯6.67mg/mL、20mg/mL、60mg/mL，雷公藤6mg/mL。1.3 試劑 總蛋白定量測試盒(批號：20120426)、一氧化氮測試盒(批號：20120428)、一氧化氮合酶測試盒(批號：20120429)均由南京建成生物有限公司提供。

1.4 儀器 T10 basic IKA勻漿機(jī)(北京萌壯科技有限公司)；DK-600S型三用恒溫水箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；LDZ5-2低速自動平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；UV754N紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 實驗方法 隨機(jī)將小鼠分為5組:生理鹽水組、穿心蓮內(nèi)酯低(66.7mg/kg) 、中(200mg/kg)、高(600mg/kg)劑量組、雷公藤組(60mg/kg)，每只小鼠按0.1mL/10g灌胃給藥連續(xù)60d。7d稱重一次，調(diào)整劑量。給藥結(jié)束2d后，處死小鼠，取一側(cè)睪丸，4%甲醛固定，常規(guī)制備組織切片，HE染色，觀察睪丸組織曲細(xì)精管的形態(tài)學(xué)變化，并計數(shù)每只小鼠10個曲細(xì)精管的生精細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量。取另一側(cè)睪丸，制備10%的組織勻漿，用硝酸還原酶法測定睪丸組織中NO濃度，化學(xué)比色法測定睪丸組織中iNOS活力。檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作要求，

3 結(jié)果

3.1 對小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響 光學(xué)顯微鏡下(HE 低倍鏡10×)觀察發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組小鼠睪丸曲細(xì)精管形態(tài)正常，管壁完整較厚，各級生精細(xì)胞層次清晰，排列緊密，規(guī)則有序，胞體充盈，有些可看到成熟的精子，且腔內(nèi)未見脫落細(xì)胞；不同劑量的穿心蓮內(nèi)酯組及雷公藤組，小鼠睪丸曲細(xì)精管發(fā)生不同程度形態(tài)變化，管壁變薄，管腔變大，各級生精細(xì)胞排列紊亂，層次不清，數(shù)量少而稀松，很難看到成熟的精子。生精細(xì)胞層數(shù)，各給藥組與生理鹽水組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。生精細(xì)胞總數(shù)，與生理鹽水組比較，穿心蓮內(nèi)酯中劑量、高劑量及雷公藤組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而與雷公藤組相比，低劑量和中劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，高劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見圖1、表1及表2。

表1 穿心蓮內(nèi)酯對小鼠生精細(xì)胞層數(shù)的影響±s)

注：與NS組相比，*P<0.05。

表2 穿心蓮內(nèi)酯對小鼠生精細(xì)胞數(shù)的影響±s)

注：與NS組相比，*P<0.05；與雷公藤組比，#P<0.05。

3.2 對小鼠睪丸組織中NO濃度的影響 與生理鹽水組相比，穿心蓮內(nèi)酯各組及雷公藤組小鼠睪丸組織中NO含量均降低，低、高劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。其中穿心蓮內(nèi)酯高劑量組降低最為明顯，而中劑量組雖低于生理鹽水組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。穿心蓮內(nèi)酯各劑量組與雷公藤組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 穿心蓮內(nèi)酯對小鼠睪丸組織中NO濃度的影響±s)

注：與NS組相比，*P<0.05。

3.3 對小鼠睪丸組織中iNOS活力的影響 與生理鹽水組相比，雷公藤組睪丸組織內(nèi)iNOS活力明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；穿心蓮內(nèi)酯各劑量組睪丸組織中iNOS活力也有所降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。與雷公藤組相比，穿心蓮內(nèi)酯各組iNOS降低程度均低于雷公藤給藥組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

注：與NS組相比，*P<0.05。

4 討論

睪丸是雄性生殖系統(tǒng)的重要器官，其功能是分泌雄性激素及產(chǎn)生精子，它易受溫度、化學(xué)物質(zhì)及藥物的影響，使精子的產(chǎn)生發(fā)生障礙。本研究用穿心蓮內(nèi)酯連續(xù)給小鼠灌胃60d，取睪丸切片HE染色后，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組曲細(xì)精管形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，生精細(xì)胞的層數(shù)和數(shù)量較多，排列規(guī)則緊密，管腔內(nèi)可見有精子的形成，而穿心蓮內(nèi)酯3個劑量組，可看到小鼠睪丸曲細(xì)精管生精上皮變薄、管腔有不同程度的增大，生精細(xì)胞排列松散而不規(guī)則，層數(shù)及總數(shù)量減少，很少有成熟的精子，各給藥組生精細(xì)胞層數(shù)與生理鹽水組相比,其差異性有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各級生精細(xì)胞總數(shù)與生理鹽水組相比，除低劑量組外，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。雷公藤所導(dǎo)致的睪丸組織形態(tài)學(xué)改變與穿心蓮內(nèi)酯組基本一致，但各級生精細(xì)胞數(shù)量減少較為明顯，與穿心蓮內(nèi)酯3個劑量組相比，僅高劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，其余兩組均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯的抗雄性生育作用部位是在睪丸，干擾了睪丸曲細(xì)精管的生精過程等功能。當(dāng)劑量較低時對小鼠生精細(xì)胞的影響不如60mg/kg的雷公藤多甙，達(dá)到一定用量時也能產(chǎn)生與雷公藤多甙相同的抗雄性生育效應(yīng)。

一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是一種具有廣泛生物學(xué)活性的氣體信使分子，由NOS催化 L -精氨酸生成，參與體內(nèi)多種生理或病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，NO、NOS也存在于哺乳動物的雄性生殖系統(tǒng)內(nèi)，對睪丸的微循環(huán)、睪酮的分泌、精子的發(fā)生、成熟及活動等起著雙向調(diào)節(jié)作用，生理范圍內(nèi)NO有助于男性生殖系統(tǒng)的發(fā)育及功能的發(fā)揮，這主要取決于睪丸組織中的NO濃度和NOS的活性。iNOS是誘導(dǎo)型NOS，通常是在受到刺激時才可表達(dá)。但研究發(fā)現(xiàn)，iNOS在正常睪丸中如間質(zhì)細(xì)胞、生精小管內(nèi)的支持細(xì)胞、不成熟精子頭部和管周類肌細(xì)胞均有表達(dá)，提示它可能參與了正常支持細(xì)胞和精子發(fā)生過程的調(diào)節(jié)[4-7]。本研究結(jié)果表明，在正常小鼠睪丸組織中檢測到iNOS的存在，其活力為(2.21±1.24)U/mg·prot，穿心蓮內(nèi)酯連續(xù)給藥60d，各劑量組均可使睪丸組織中iNOS活性受到抑制，最低到(1.11±0.48)U/mg·prot，減少了近一半。NO的含量亦明顯減少，由正常小鼠的(4.20±2.23)μmol/L最低降到(2.28±1.27)μmol/L，從結(jié)果看沒有明顯的劑量依賴性，低劑量與高劑量作用明顯，與生理鹽水組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。中劑量與生理鹽水組相比，NO雖有所降低但無統(tǒng)計學(xué)差異其原因可能是多方面的，有待進(jìn)一步的研究探討。結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯可通過抑制這些部位的iNOS活性，導(dǎo)致NO的生成減少，這與徐芳芳、劉俊等體內(nèi)外給穿心蓮內(nèi)酯抑制iNOS表達(dá)和NO產(chǎn)生的結(jié)果相一致，但它是否對另外兩型NOS有影響仍需做進(jìn)一步的研究[8-9]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可使精子的數(shù)量減少，發(fā)育畸形、活動能力減弱等[2-3]，可推測其機(jī)制與穿心蓮內(nèi)酯抑制iNOS活性，減少了ON的生成，其含量低于正常生理水平，使NO介導(dǎo)的正常生理狀態(tài)下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到限制，干擾了睪丸組織的正常發(fā)育，睪酮的分泌等，使精子數(shù)量、成熟度等受到抑制，這種機(jī)制與新型植物生長調(diào)節(jié)劑增產(chǎn)菊胺酯、氯化鎘、醋酸鉛及二硫化碳的生殖毒性機(jī)理基本一致[10-12]。另外，實驗發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯連續(xù)給小鼠60d，血中睪酮的水平明顯降低。

雷公藤具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，臨床用于自身免疫性疾病，也是新型雄性抗生育藥，研究顯示，大劑量雷公藤片用藥第 3、4周末NO S陽性睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量略有減少，染色變淡[11]，可下調(diào)eNOS的表達(dá)[13]。實驗發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙片能降低睪丸組織中iNOS活性，減少NO的含量，與生理鹽水組比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但與穿心蓮內(nèi)酯組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，為進(jìn)一步研究雷公藤對雄性生殖系統(tǒng)的毒性機(jī)制提供了新思路。

綜上，穿心蓮內(nèi)酯具有抗雄性生育作用，提示對生育期的男性盡量不要使用含有穿心蓮內(nèi)酯的制劑，也可考慮將其作為一種男性避孕藥開發(fā)使用。

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The Effect of Andrographolide on Testicular Tissue Morphology and NO，iNOS in Mice

DAI Weijuan1XU Lijuan2WANG Xu1LIU Yanhua1ZHUFanhe

1.Department of Pharmacology,Jining Medical University,Jining 272067,China 2. People's Hospital of Jinxiang County, Jinxiang 272200,China

Objective To observe the effect of histological changes and iNOS,NO in mice testes submitted to Andrographolide. Methods Male Kunming mice of weight 25±3g were randomly divided into 5 groups：saline group, Andrographolide low dose group, middle dose group ,high dose group and Tripterygium wilfordii group. Drugs were given by gavage once a day for 60 days. After getting testicles out of mouse killed, tissue slices and homogenate were made for observing morphologic changes of testicular tissue,and count the layer number and the quantity of sperm cells. Measuring respectively changes of iNOS,NO by nitrate reduction enzymatic and chemical colorimetric method.Results In three dose groups of Andrographolide and Tripterygium wilfordii, compared with normal saline group, mice testicular seminiferous tubule wall become thinning, and lumen become bigger in different degrees, the decrease in the number of sperm cells (loosely arranged and irregular) were observed. The number of mature sperms decreased and iNOS activity decreased, NO concentration reduced. Conclusion If Andrographolide is taken for long term, the mechanism of Andrographolide resistance to male reproductive function is related to inhibition of iNOS vitality and reduction of the generation of NO.

Andrographolide；Testes；NO；iNOS

山東省計劃生育委員會資助(2010-)。

戴偉娟 (1960-)，女，漢族，碩士，教授，研究方向為心腦血管藥理學(xué)。E-mail:weijuan-d@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)11-0052-04

2017-04-04 編輯：程鵬飛)