陳方挺 傅旭春 蔣芳萍 白海波 蔡田恬

·實驗研究·

豨薟草對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療作用

陳方挺1傅旭春2蔣芳萍3白海波3蔡田恬4

目的觀察豨薟草對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療作用。方法SD大鼠50只，隨機分成空白對照組、模型組、秋水仙堿組、豨薟草水提組和豨薟草醇提組，每組10只。采用大鼠后肢右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射尿酸鈉法建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，各組分別于造模前2h、造模后6、22h給予相應(yīng)的藥物。觀察各組大鼠的足趾體積、致炎關(guān)節(jié)組織腔內(nèi)白介素10（IL-10）含量變化。結(jié)果

造模后24h模型組大鼠足趾體積為（0.3620±0.1273）mL，較空白對照組（0.0615±0.0520）mL顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組、豨薟草醇提組大鼠足趾體積均有明顯縮小[（0.1638± 0.0534）mL、（0.1796±0.0943）mL比（0.3620±0.1273）mL，P均＜0.01]；秋水仙堿組、豨薟草醇提組大鼠后肢踝關(guān)節(jié)腫脹程度也較模型組有明顯改善[（1.69±0.27）mm、（1.72±0.59）mm比（2.37±0.37）mm，P均＜0.01]，血清IL-10則明顯升高[（240.64±53.95）pg/mL、（215.65±70.35）pg/mL比（139.35±62.78）pg/ mL，P＜0.01，P＜0.05]。結(jié)論豨薟草乙醇提取物對尿酸鈉誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有治療作用。

大鼠；急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；豨薟草提取物；秋水仙堿

豨薟草為菊科植物豨薟（Siegesbeckia orientalis L.）、腺梗豨薟（Siegesbeckia pubescens Makino）或毛梗豨薟（Siegebeckia glabrescens Makino）的干燥地上部分，收載于《中國藥典》2010版[1]，具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，清熱解毒之功效，用于風(fēng)濕痹痛，筋骨無力，腰膝酸軟，四肢麻痹，半身不遂，風(fēng)疹濕瘡等。據(jù)文獻報道，豨薟草能調(diào)整機體免疫功能，抑制局部組織炎癥介質(zhì)，減輕關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)，從而達到治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用[2-3]。豨薟草可緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疼痛，控制癥狀[4-5]。豨薟草亦可用于治療高尿酸血癥，能改善高尿酸血癥腎損害大鼠的腎功能，對高尿酸血癥腎臟病理損害有修復(fù)作用[6]。本研究采用在大鼠后肢右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射尿酸鈉的方法建立急性大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型[7]，觀察豨薟草乙醇提取物對尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用。報道如下。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量190～210g，購自浙江省動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2003-0001。試驗前，將動物置（23± 2）℃屏障級動物房中飼養(yǎng)1周，標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用水為純凈水。

1.2 藥品與試劑豨薟草藥材飲片，購自杭州中藥飲片廠（批號110103）；尿酸（批號037K0694）購自SIGMA-AIDRICH公司；生理鹽水（批號20092018），浙江莎普愛思制藥有限公司；大鼠白細胞介素10（IL-10）試劑盒（批號1387113）為武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)；乙醇（分析純，杭州化學(xué)試劑有限公司，批號20110118）。秋水仙堿片（批號110921），購自昆藥集團股份有限公司。

1.3 儀器YLS-7B足趾容積測量儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；Sunrise-basic光吸收酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；Allegra64R離心機，貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品；XW-80A漩渦混合器，上海醫(yī)大儀器廠；游標(biāo)卡尺，上海臺海工量具有限公司。JHS-080型精密恒溫恒濕箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

2 實驗方法

2.1 尿酸鈉溶液制備

2.1.1 尿酸鈉晶體制備取6mL的氫氧化鈉溶液（1mol/L）與1g尿酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，在無菌條件下加入經(jīng)高壓殺毒的蒸餾水194mL，煮沸，攪拌使得尿酸鈉完全溶解，自然冷卻后滴加鹽酸溶液（1mol/L）至pH值等于7，于4℃冰箱保存24h，棄上清，將沉淀用生理鹽水洗滌3次，濾紙吸干水分后再用無水乙醇洗滌沉淀物2次，置于干燥箱中，70℃環(huán)境下烘烤2h，將粉末研細后過孔徑250μm的金屬篩，裝瓶備用。

2.1.2 尿酸鈉乳液制備實驗前將尿酸鈉結(jié)晶置于180℃烤箱烘烤2h，用95%乙醇洗滌離心（3500r/min，10min）3次，室溫自然干燥，取500mg尿酸鈉結(jié)晶加9mL生理鹽水、1mL吐溫80加熱攪拌，配制成50g/L尿酸鈉溶液10mL。

2.2 豨薟草水提物制備取豨薟草藥材飲片5kg，加入10倍量水浸潤2h，煎煮提取3次（每次提取時間依次為2.5h、1h和1h），合并提取液濃縮后加輔料噴霧干燥得噴霧粉，備用。試驗時用蒸餾水配制成所需濃度30mg/mL應(yīng)用。

2.3 豨薟草乙醇提取物制備取豨薟草飲片5kg，加入8倍量70%乙醇浸潤2h，回流提取3次（每次提取時間依次為2.5h、1h和1h），合并提取液回收乙醇后加輔料噴霧干燥得噴霧粉，備用。試驗時用蒸餾水配制成所需濃度30mg/mL應(yīng)用。

2.4 大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型[7]的建立將50只雄性大鼠隨機分成空白對照組、模型組、秋水仙堿組、豨薟草水提組和豨薟草醇提組，每組10只。各組于造模前2h開始第一次給藥，豨薟草醇提組給藥濃度為30mg/mL，劑量為10mL/kg，空白對照組和模型組給予等劑量蒸餾水，秋水仙堿給藥濃度為0.135mg/mL，劑量為10mL/kg。2h后將模型組、秋水仙堿組、豨薟草醇提、水提組大鼠右踝關(guān)節(jié)適度彎曲，消毒酒精局部消毒，將1mL注射器的針頭通過兩骨突之間插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，進針方向約為45°，踝關(guān)節(jié)腔中注入50g/L的尿酸鈉乳液約60μL，進行伸曲、旋轉(zhuǎn)運動1min。空白對照組大鼠關(guān)節(jié)腔注射10%吐溫80 60μL（以注射用生理鹽水配制）。造模后6h、22h各組均再次給予相應(yīng)藥物。造模后24h觀察各項指標(biāo)變化。

2.5 觀察指標(biāo)（1）關(guān)節(jié)腫脹情況：觀察大鼠造模前后精神狀況、右踝關(guān)節(jié)同一部位的腫脹情況、顏色、皮溫及活動情況。（2）實驗前后大鼠足趾體積和直徑的變化：大鼠足趾體積測量：用油性記號筆標(biāo)記所有大鼠右踝關(guān)節(jié)同一部位，利用足趾測量儀分別測量各組大鼠造模前及造模后24h時間點時標(biāo)記處的體積，計算造模后24h足趾腫脹度。腫脹度=造模后大鼠右后足的足趾體積-造模前大鼠右后足的足趾體積；大鼠關(guān)節(jié)部位直徑測量：以游標(biāo)卡尺測得造模后大鼠右踝關(guān)節(jié)注射尿酸鈉部位厚度減去造模前厚度，所得差值作為考察腫脹的另一指標(biāo)。（3）炎癥因子：摘除大鼠眼球取血，血液離心10min（6000轉(zhuǎn)/ min），取上清液，采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測IL-10含量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠關(guān)節(jié)腫脹情況造模后大鼠表現(xiàn)出明顯的煩躁不安，右踝關(guān)節(jié)出出現(xiàn)明顯紅、腫、熱，且伴有一定的功能障礙，活動能力下降，運動受限，與造模前相比，關(guān)節(jié)體積有所增加。而空白對照組大鼠未表現(xiàn)出明顯的煩躁情緒，右踝關(guān)節(jié)處也未出現(xiàn)明顯的紅、腫、熱現(xiàn)象，活動不受影響，關(guān)節(jié)體積也未出現(xiàn)明顯增加。

3.2 各組大鼠24h足趾體積比較實驗前各組大鼠足趾體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而造模后各組大鼠關(guān)節(jié)均出現(xiàn)不同程度的腫脹，其中模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹最為明顯。造模后24h模型組大鼠足趾體積較對照組顯著增加（P＜0.01），秋水仙堿組、豨薟醇提組大鼠足趾體積與模型組比較，均有不同程度縮?。≒＜0.01），豨薟草醇提組比水提組縮小更明顯（P＜0.01），醇提組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度與秋水仙堿組相似（P＞0.05）。見表1。

表1 各組急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠實驗前后足趾體積比較（mL，x±s）

3.3 各組大鼠24h腫脹關(guān)節(jié)直徑比較實驗前各組大鼠右踝關(guān)節(jié)直徑比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），造模24h后大鼠右踝關(guān)節(jié)直徑以模型組腫脹最嚴(yán)重，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，豨薟醇提組、秋水仙堿組大鼠右踝關(guān)節(jié)直徑均有明顯縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

3.4 各組大鼠血清IL-10水平比較造模后24h模型組、各給藥組大鼠血清IL-10低于空白對照組（P＜0.01），以模型組為最低，顯示造模成功；與模型組比較，各給藥組IL-10水平都有所上升，秋水仙堿組最顯著（P＜0.01），豨薟草醇提組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），秋水仙堿組與豨薟草醇提組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 各組急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠實驗前后右踝關(guān)節(jié)直徑比較（mm，x±s）

表3 各組急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中的IL-10水平比較（x±s）

4 討論

文獻[4]報道，豨薟草外敷可用于治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。本研究結(jié)果表明，豨薟草提取物對尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型具有一定的抗炎作用，且以醇提組作用顯著。張磊等[8]研究顯示，利用奇壬醇提取率作為評價標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)豨薟草乙醇提取線性好，回收率高。除此以外，豨薟草乙醇提取物急性毒性遠小于水提取物，使用更安全[9]。

研究指出，豨薟草可以降低踝關(guān)節(jié)組織中組胺和白細胞介素IL-lβ、IL-8、腫瘤壞死因子（TNF-α）含量；能有效抑制踝關(guān)節(jié)滑膜細胞血干細胞黏附因子-1（VCAM-1）、環(huán)氧合酶（COX-2）、轉(zhuǎn)錄因子NF-KB表達等[5]。Park等[10]報道，豨薟酸可能通過抑制誘生型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA和蛋白的表達抑制一氧化氮（NO）的產(chǎn)生，并且抑制蛋白從而起到抗炎作用。而在針對抗炎作用機制的研究中，目前研究比較廣泛的抗炎性白細胞介素類細胞因子主要有白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-4（IL-4）等，其中IL-10是一種強有力的抗炎性細胞因子，又稱細胞因子合成抑制因子，主要由Th2、Th0、單核-巨噬細胞、成纖維細胞等在各種免疫活化狀態(tài)下產(chǎn)生，IL-10的含量增加與抗炎活性提高有關(guān)。本研究結(jié)果提示豨薟草乙醇提取物抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用的機制可能與抗炎因子IL-10含量增加有關(guān)。

［1］中華人民共和國藥典2010版一部［S］.中國醫(yī)藥科技出版社，2010：345-345.

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（收稿：2016-12-28修回：2017-01-24）

Effects of Herba Siegesbeckiae on Acute Gouty Arthritis Rat Model

CHEN Fangting1,FU Xuchun2,JIANG Fangping3,BAI Haibo3,CAI Tiantian4.
1 Department of Pharmacy,Yongkang Orthopedics Hospital,Jinhua(321300), China;2 Institute of Materia Medica,Zhejiang University City College,Hangzhou(310015),China;3 Hangzhou Huadong Medicine Group Pharmaceutical Research Institute Co.Ltd.,Hangzhou(310012),China;4 Department of Pharmacy,Zhejiang Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of herba siegesbeckiae on acute gouty arthritis in rats.Methods Fifty SD rats were randomly divided into five groups（n=10）:control group,model group,colchicin group,the water extract of herba siegesbeckiar group,and the ethanol extract of herba siegesbeckiar group.Except for control group, the model of acute gouty arthritis was established by injecting sodium urate into the right ankle joint of the rats＇hindlimb in other four groups.The corresponding drugs were administered 2 hours before molding and 6 and 22 hours after molding.After 24 hours after molding,the toe volume of rats was measured and the level of interleukin-10（IL-10）in inflammatory joint tissue was determined.ResultsThe toe volume of rats in model group was bigger than that of control group（0.3620±0.1273mL vs 0.0615±0.0520mL,P＜0.05）.After drug intervention,the toe volume in colchicin group,the water extract of herba siegesbeckiar group,and the ethanol extract of herba siegesbeckiar group was significantly reduced（0.1628±0.0534mL,0.1796±0.0943mL,0.3620±0.1273mL,P＜0.05）;the swelling degree of the ankle joint of rats＇hindlimb in colchicin group and the ethanol extract of herba siegesbeckiar group was significantly attenuated and the serum IL-10 was significantly increased compared with those in model group（1.69±0.27mm,1.72±0.59mm vs 2.37±0.37mm,all P＜0.01;240.64±53.95pg/mL,215.65±70.35pg/mL vs 139.35±62.78pg/mL,P＜0.01 or P＜0.05）.ConclusionEthanol extract of herba siegesbeckiae has a therapeutic effect on acute gouty arthritis induced by sodium urate.

rats;acute gouty arthritis;extract of herba siegesbeckiae;colchicin

1浙江省永康市骨科醫(yī)院藥劑科（金華321300）；2浙江大學(xué)城市學(xué)院藥物研究所（杭州310015）；3杭州華東醫(yī)藥集團新藥研究院有限公司（杭州310012）；4浙江省中醫(yī)院藥劑科（杭州310006）

傅旭春，E-mail:fuxc@zucc.edu.cn