張曉燦，李楊，羅丹丹，陶愛恩，段寶忠

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

基于指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)的多基原秦艽藥材化學(xué)品質(zhì)比較研究

張曉燦，李楊，羅丹丹，陶愛恩，段寶忠*

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

目的：比較秦艽藥材3種基原藥材秦艽、小秦艽和粗莖秦艽的化學(xué)品質(zhì)差異，為多基原秦艽藥材品質(zhì)評價(jià)提供參考。方法：采用高效液相色譜法，建立3種藥材的HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對其品質(zhì)進(jìn)行比較。結(jié)果：3種藥材的化學(xué)指紋圖譜種間相似度有一定差異，與秦艽藥材共有模式圖譜相比，秦艽種內(nèi)相似度均大于0.990；小秦艽與其種間相似度為0.864和0.823；粗莖秦艽在0.643～0.912之間。聚類分析和主成分分析將17批秦艽藥材分成秦艽、小秦艽和粗莖秦艽3類。結(jié)論：秦艽、小秦艽、粗莖秦艽3種藥材化學(xué)成分存在一定差異，但主要成分峰形特征相似；化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可用于不同品種秦艽的基原識別。

多基原；秦艽；指紋圖譜；化學(xué)計(jì)量學(xué)；品質(zhì)差異

中藥是多種化學(xué)成分組成的復(fù)雜的集合體，對于中藥的質(zhì)量控制一直是一個(gè)難點(diǎn)，多基原藥材使得中藥質(zhì)量控制更加復(fù)雜化〔1〕。秦艽是重要的傳統(tǒng)常用中藥〔2〕，為典型的多基原藥材，其法定來源有龍膽科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花秦艽G.straminea Maxim.、粗莖秦艽G.crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽G.dahurica Fisch.4種基原的干燥根〔3〕。由于中藥的藥效取決于其所含的化學(xué)物質(zhì)，多基原藥材間的化學(xué)成分可能有差別或完全不同，從而導(dǎo)致藥理作用和臨床療效也不盡一致〔4〕。近年來，眾多學(xué)者對秦艽類藥材的藥材品質(zhì)和指紋圖譜進(jìn)行了大量的研究〔5-8〕，但未見對藥典秦艽藥材不同基原的指紋圖譜進(jìn)行比較的相關(guān)研究。鑒于此，本研究采用高效液相色譜法，建立了秦艽藥典3種基原藥材秦艽、粗莖秦艽和小秦艽HPLC指紋圖譜，利用中藥色譜指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，分析比較了秦艽3種基原藥材的質(zhì)量差異，以期為多基原秦艽藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑Agilent 1200高效液相色譜儀（Agilent Technologies，USA），包括：G1322A在線脫氣機(jī)、G1311A四元梯度泵、G1329A進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1314B VWD檢測器和ChemStation色譜工作站。AgilentZorbax SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-5200DB），AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。色譜級甲醇（Fisher Scientific，F(xiàn)airlawn New Jersey），水為超純水，其他試劑均為分析純。

17批秦艽、小秦艽和粗莖秦艽藥材收集于2012年4月至2016年1月，藥材經(jīng)段寶忠副教授鑒定，標(biāo)本存放于大理大學(xué)中藥標(biāo)本館。見表1。

表1 樣品信息表

1.2 色譜條件、供試品溶液制備按參考文獻(xiàn)〔8〕進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析指紋圖譜數(shù)據(jù)使用中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2.0版）軟件計(jì)算各批樣品的相似度；使用SPSS 17.0軟件對矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行聚類分析；使用The Unscrambler X 10.4分析軟件，進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液，按“1.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰峰面積，RSD＜0.86%，保留時(shí)間RSD＜0.32%，表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品6份，按“1.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測定。各色譜峰峰面積RSD＜0.97%，表明方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份供試品溶液，分別在0、4、8、12、18、24、48 h進(jìn)行測定，各色譜峰峰面積RSD＜1.27%，表明各供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 指紋圖譜相似度采用中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2.0版），生成10批秦艽藥材共有模式色譜圖，見圖1。將17批藥材導(dǎo)入軟件與秦艽共有模式色譜圖比較，計(jì)算相似度。結(jié)果顯示，10批秦艽藥材與秦艽共有模式圖譜比較，相似度均大于0.990；兩批小秦艽藥材與秦艽共有模式圖譜比較，相似度為0.864和0.823；5批粗莖秦艽藥材與共有模式圖譜比較，相似度在0.643～0.912之間，見表2。

圖1 10批秦艽藥材的HPLC指紋色譜圖譜

表2 與秦艽共有模式圖譜比較相似度結(jié)果

2.3 樣品聚類分析（HCA）將17批樣品共有色譜峰的峰面積與藥材稱樣量相比，對單位質(zhì)量藥材峰面積進(jìn)行量化，得17×10階的數(shù)據(jù)矩陣，使用Ward’s方法和歐氏距離進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見圖2。從圖2可看出，3種秦艽藥材分別被單獨(dú)分為3類，見圖2中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，其中Ⅰ類包括10批秦艽樣品，S10和S11號樣品經(jīng)過多次聚類后與其他8批秦艽樣品聚為一類；Ⅱ類包括5批粗莖秦艽樣品；Ⅲ類包括兩批小秦艽樣品。

圖2 樣品聚類分析圖

2.4 樣品主成分分析（PCA）對單位質(zhì)量3種秦艽藥材峰面積進(jìn)行量化處理后，使用The Unscrambler X 10.4分析軟件，對17批樣品共有指紋圖譜信息進(jìn)行主成分分析。以第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的得分為橫縱坐標(biāo)，繪制得分散點(diǎn)圖，見圖3。結(jié)果顯示3種秦艽藥材得到了很好的歸類，17批樣本間內(nèi)在的相互關(guān)系可進(jìn)一步較好地體現(xiàn)出來，樣品被分為3類，即秦艽類（Ⅰ類）、粗莖秦艽類（Ⅱ類）和小秦艽類（Ⅲ類）。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，結(jié)合圖3可以實(shí)現(xiàn)3種秦艽藥材的鑒別。

圖3 17批樣品主成分分析圖

3 討論

本研究采用HPLC指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法研究了秦艽的3種基原植物藥材的化學(xué)指紋特征差異。17批樣品與秦艽共有模式圖譜比較，10批秦艽樣品相似度均大于0.990，秦艽藥材種內(nèi)質(zhì)量均一，穩(wěn)定性較好；兩批小秦艽藥材與秦艽比較相似度小于0.865，表明秦艽與小秦艽藥材化學(xué)指紋差異較大，吳靳榮等研究發(fā)現(xiàn)小秦艽中各組分的含量明顯低于其他種正品秦艽〔9〕，結(jié)合本研究中的相似度計(jì)算結(jié)果，表明秦艽與小秦艽化學(xué)指紋差異較大；5批粗莖秦艽樣品中，與秦艽相比，S3和S7號樣品的相似度分別為0.765，0.643，其余3批樣品相似度在0.900～0.912之間，表明粗莖秦艽與秦艽相比指紋圖譜有一定差異。聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）結(jié)果將17批樣品分為了秦艽、粗莖秦艽和小秦艽3類。羅焜等對秦艽幾種基原植物的ITS2序列的研究表明，幾種藥材的堿基存在明顯差異〔10〕。本研究結(jié)果表明秦艽、小秦艽、粗莖秦艽3種藥材的化學(xué)指紋存在差異。

中藥材品種的多基原性由來已久，唐·《新修本草》注“藍(lán)實(shí)有三種”；《本草拾遺》云“三棱總有三四種”；《圖經(jīng)本草》《證類本草》中一物數(shù)圖者甚多，柴胡有五圖、黃精有十圖；《中華人民共和國藥典》2015年版收載的中藥材及飲片，多基原藥材品種有153種之多。多基原中藥品種的質(zhì)量差異直接關(guān)系到臨床用藥的有效性和安全性〔11〕。上述秦艽的3種基原植物成分差異明顯，必然影響其臨床療效，但目前3種秦艽藥材在臨床使用中劑量和用途相同，目前有關(guān)其藥效的差異尚不明確，其科學(xué)性有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。采用現(xiàn)代學(xué)科新技術(shù)對中藥多基原藥材進(jìn)行系統(tǒng)的研究，構(gòu)建符合多基原藥材特點(diǎn)的質(zhì)量評價(jià)模式，對保證中藥產(chǎn)品的安全有效、質(zhì)量可控，使國際社會理解和接受中醫(yī)藥具有十分重要的意義。

〔1〕楊豐慶，李紹平.基于莪術(shù)研究探討多基原中藥指紋圖譜的建立〔C〕∕∕武漢：中國藥學(xué)雜志島津杯第八屆全國藥物分析優(yōu)秀論文評選交流會論文集.2007：117-123.

〔2〕王琳，聶艷瓊，孫娜，等.秦艽的化學(xué)成分、分子生藥學(xué)和藥理學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，（18）：9629-9630.

〔3〕國家藥典委員會.中華人民共和國藥典〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

〔4〕王陳.基于二維液相色譜技術(shù)的元胡活性成分篩選及其藥效和毒性機(jī)制的蛋白組學(xué)研究〔D〕.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2010.

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Species Differentiation and Quality Assessmentof Gentiana by High-performance Liquid Chromatographic Fingerprintand Chemometrics Analysis

Zhang Xiaocan,Li Yang,Luo Dandan,Tao Aien,Duan Baozhong*
（College ofPharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To compare the chemical quality among three species of Gentiana.Methods:HPLC fingerprints of the three kinds of Gentiana have been established and analyzed with chemometric methods including similarity evaluation,hierarchical cluster analysis and principalcomponentanalysis.Results:There is significant difference among the three species of Gentiana expressed by the fingerprint patterns.The result of chemometric analysis indicated that 17 samples were classified into three categories.Conclusion:HPLC fingerprintcombined with chemometrics analysis is an effective method for the discrimination ofdifferentgroups of herbalmedicines.

Multiple sources;Gentianae macrophyllae Radix;HPLC fingerprint;chemometric methods;quality difference

R282

A

2096-2266（2017）06-0037-04

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.06.009

（責(zé)任編輯李楊）

云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2014Z135）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2016FD073）；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才資助項(xiàng)目（2015HB058）；云南省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012CG019；2014RE016）

2017-01-10

2017-03-21

張曉燦，碩士研究生，主要從事中藥資源與鑒定研究.

*通信作者：段寶忠，副教授.