劉瑞青 李醒亞 曹會存 李 輝 曹廣劭 劉建文 吳方明 劉玉巖 劉 健 陳利娟

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TTF-1和SPA表達對早期肺腺癌術后復發(fā)預測及預后的判斷價值

劉瑞青 李醒亞 曹會存 李 輝 曹廣劭 劉建文 吳方明 劉玉巖 劉 健 陳利娟

目的 研究術后肺腺癌患者組織中TTF-1和SPA的蛋白表達對其復發(fā)的預測價值及預后的影響。方法

收集行手術切除的Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌患者112例，采用免疫組化方法檢測組織中TTF-1以及SPA的表達。結果 68例患者出現(xiàn)復發(fā)，TTF-1陽性和陰性表達患者中位DFS分別為41個月和9個月(P=0.013)，中位OS分別為65.0和23.0個月(P=0.037)，SPA陽性與陰性表達患者中位DFS分別為59.0個月和15.0個月 (P=0.018)，中位OS分別為68.0個月和35.0個月(P=0.058)。結論 早期肺腺癌術后組織中TTF-1和SPA的表達是其復發(fā)的有效預測指標，TTF-1陽性表達預后更好。

肺腺癌；甲狀腺轉錄因子；表面活性蛋白A；無疾病進展生存期；生存期

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1048～1051)

甲狀腺轉錄因子(thyroid transcription factor-1,TTF-1)屬于核轉錄因子NKx-2家族成員，在甲狀腺、肺和前腦的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[1]，目前組織中TTF-1的表達多用于鑒別原發(fā)性與轉移性肺癌，以及肺腺癌與肺鱗癌。多項研究證明TTF-1的陽性表達是非小細胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)的有利的預后因子[2-3]。表面活性物質A(surfactant protein-A,SPA)由磷脂和蛋白質組成的復合物，具有降低肺泡表面張力的作用[4]，其基因缺失與肺癌預后相關[5],我們前期研究顯示組織中TTF-1的表達能預測EGFR突變[6]，肺腺癌亞型與TTF-1的表達以及EGFR突變密切相關[7]。

NSCLC的發(fā)病率和死亡率逐年升高，盡管手術切除能有效提高早期肺癌患者的生存率，但術后復發(fā)仍是延長生存期的一大障礙。2012年我們對該批數據進行術后2年的隨訪，復發(fā)人數不到一半，無法計算中位DFS以及OS，目前距離手術近6年時間，再次進行隨訪，旨在討論組織中TTF-1、SPA的表達對肺腺癌術后復發(fā)的預測價值和預后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2010年1月到2011年12月在河南省腫瘤醫(yī)院行手術切除治療的肺腺癌患者117例，其中5例不符合入選標準。其中男性61例，女性51例，中位年齡58(38～78)歲，非吸煙65例，吸煙47例，所有患者均按UICC(2009)第七版分期標準，其中Ⅰ期53例，Ⅱ期27例，Ⅲ期32例，腫塊最大直徑中位值為4 cm(2～10 cm)，接受輔助治療64例，未接受輔助治療48例，輔助治療包括全身化療、局部放療以及生物治療等,復發(fā)后接受TKI靶向藥物治療20例。排除標準：①患者取標本前進行化療或者放療等抗腫瘤治療，②術后短時間內因為非腫瘤因素死亡，③術后病理分期為Ⅳ期患者，④術后病理證實為非腺癌。

1.1.1 蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(scorpions amplificiation refractory mutation system,scorpions ARMS)即時熒光PCR檢測組織中EGFR狀態(tài)的方法及判讀標準 石蠟組織切取4 μm 厚度的切片5張，提取DNA，檢測DNA的濃度和純度，然后擴增(引物由廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司合成)，可檢測19(Del E746-A750和Del E746-A750)和21(L858R)外顯子3個位點突變。PCR反應條件:95 ℃ 5 min,1個循環(huán)；95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，15個循環(huán);93 ℃ 25 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 20 s,26個循環(huán)；采用美國Stratagene 公司的Mx3000P 實時熒光定量PCR 儀收集信號。每次反應都設置陽性及陰性對照，反應結束后即時PCR儀自動以擴增曲線的形式輸出結果。

1.1.2 免疫組化檢測組織中TTF-1和SPA表達的方法以及判讀標準 石蠟包埋組織塊進行4 μm連續(xù)切片，脫蠟，高壓修復抗原(40 s)，自然冷卻，滴加1∶100稀釋的鼠抗人TTF-1單克隆抗體(8G7G3/1)或1∶75的鼠抗人SPA單克隆抗體(PE-10)，4 ℃過夜。室溫下恢復40 min，滴加即用型二抗(Kit-5020,MaxVision TM試劑盒(鼠/兔)，DAB(DAB-0031)顯色，經PBS液清洗后，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，晾干，封片，在顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，陽性對照采用福州邁新公司提供的陽性組化切片。一抗、二抗和DAB試劑均購于福州邁新公司。TTF-1和SPA的陽性判讀詳見參考文獻[10]。

1.2 隨訪

通過門診、電話或信函進行隨訪，隨訪內容包括患者病情、復發(fā)時間以及轉移部位，末次隨訪時間為2016年5月20日。1例患者失訪，按隨訪截止日期死亡分析。無病生存期(disease-free survival，DFS)是指手術日至術后第一次隨訪出現(xiàn)復發(fā)證據的生存時間。生存期(overall survival，OS)指從手術日開始至因任何原因導致死亡的時間。

1.3 統(tǒng)計分析

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，各因素與復發(fā)的關系采用χ2檢驗；Kaplan-Meier曲線(Log-rank法)比較各因素對DFS對OS的影響，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 術后隨訪以及復發(fā)情況

中位隨訪時間為44.0個月，1年、3年和5年無疾病進展生存率分別為59.0%、46.0%和35.0%，中位DFS為34.9個月，1年、3年和5年累計生存率分別為77.0%。57.0%43.0%，中位OS為57.7個月。112例早期術后肺腺癌患者中有68(60.7%)例復發(fā)，局部復發(fā)23例，遠處復發(fā)45例，包括骨轉移17例，腦轉移15例，6例出現(xiàn)腎上腺轉移，8例肝轉移，2例胃轉移，12例為兩處以上轉移。

TTF-1陽性表達患者復發(fā)率為57.7%(56/97)，明顯低于陰性表達患者[80.0% (12/15)]；SPA陽性患者復發(fā)率為54.9%(39/71)，低于陰性表達患者[70.7%(29/41)]；淋巴結陰性患者復發(fā)率為47.8%(33/69)，明顯低于淋巴結轉移陽性患者[81.4%(35/43)]，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者復發(fā)率分別為47.2%(25/53)、55.6%(15/27)和87.6%(28/32)。

2.2 術后肺腺癌組織中TTF-1表達對DFS和OS的影響

112例早期肺腺癌患者中TTF-1陽性表達為97例(86.6%)，其中TTF-1陽性表達和陰性表達的Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌患者術后中位DFS分別為：41.0個月和9.0個月(P=0.013，圖1)。中位OS分別為65.0和23.0個月(P=0.037，圖1)；TTF-1陰性表達的I期(IA和IB期共53例)肺腺癌患者術后中位DFS和OS分別為9.0和66個月，陽性表達者中位DFS和OS未出來(P=0.067和P=2.33)，見圖2。

2.3 術后肺腺癌組織中SPA表達對DFS的影響

112例肺腺癌患者中SPA陽性表達共71例，占63.4%(71/112)。其中SPA陽性表達與陰性表達Ⅰ～Ⅲ期肺腺患者平均DFS分別為59.0個月和15.0個月 (P=0.018，圖3)，中位OS分別為68.0和35.0個月(P=0.058)。

圖1 早期肺腺癌DFS和OS的K-M曲線圖

圖2 Ⅰ期肺腺癌DFS的K-M曲線圖

圖3 Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌DFS K-M曲線圖

2.4 其他指標對DFS和OS的影響

Ⅰ期患者53例，其中ⅠA期17例，ⅠB期36例，Ⅱ期27例，其中ⅡA期19例，ⅡB期8例，Ⅲ期32例，ⅢA期28例，ⅢB期4例。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期中位DFS分別為69.0、23.0和13.0個月(P=0.000，圖4)，Ⅰ期中位OS未出來，Ⅱ和Ⅲ期中位OS分別為58.0和24.0個月(P=0.000，圖4)。有無淋巴結轉移的中位DFS分別為67.0和13.0個月,無淋巴結轉移者中位OS未出來，有淋巴結轉移中位OS為24個月。此外還對年齡、性別、吸煙史以及腫瘤直徑對DFS和OS的影響進行分析，見表1。

表1 肺腺癌臨床特征及各項指標對DFS和OS的影響

圖4 Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌DFS和OS K-M曲線圖

3 討論

該批數據顯示TTF-1在早期(Ⅰ～Ⅲ期)肺腺癌中表達率為86.6%，組織中TTF-1陽性表達患者較陰性表達患者復發(fā)率低，DFS和OS更長。我們將該批數據53例Ⅰ期單獨拿出來研究，發(fā)現(xiàn)TTF-1陽性表達在ⅠA和ⅠB中對復發(fā)的影響較預后的影響大。以往研究顯示組織中TTF-1陽性表達的NSCLC患者生存期或無疾病進展期更長[2-3]。關于TTF-1的表達與NSCLC的生存期的關系的機制尚不十分清楚，基礎研究顯示TTF-1的轉錄靶向因子肌球蛋白結合蛋白(myosin binding protein H，MYBHP)能抑制ROCK1(physical interaction with Rho kinase 1)并且負向調節(jié)肌動球蛋白的結構，減少單個細胞的游動，增加集體細胞的遷移，最終導致減少細胞的侵襲力和轉移[8]。中國有學者研究發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌中TTF-1的表達能抑制Ki-67的表達并且誘導凋亡。臨床研究顯示早期NSCLC患者中TTF-1陽性表達是1個獨立預后因子[9]。并且我們前期研究發(fā)現(xiàn)組織中TTF-1的表達能預測EGFR突變狀態(tài)[6]，是否EGFR突變情況也影響復發(fā)和預后有待進一步研究。也有文獻顯示亞裔人群TTF-1的表達率高于西方人群的表達，這與亞裔人群EGFR突變率高相吻合。從基礎到臨床均顯示組織中TTF-1陽性表達是NSCLC有利預后因子。我們對一批早期肺腺癌患者進行隨訪發(fā)現(xiàn)，TTF-1陽性表達的確有更好的預后，而且有更好的DFS，但同時發(fā)現(xiàn)，陰性表達復發(fā)率更高，從而提示組織中TTF-1陰性表達預測復發(fā)。

SPA是肺呼吸上皮細胞分泌的1種糖蛋白，調節(jié)肺表面活性物質功能的正常發(fā)揮，在維持肺功能發(fā)揮重要作用，該批數據中顯示SPA在肺腺癌中表達率為63.4%，陽性表達患者DFS優(yōu)于陰性患者。我們前期研究也提示SPA陽性表達預測EGFR突變，但沒有TTF-1與EGFR突變關系密切。有文獻報道，肺腺癌中SPA基因缺失與吸煙史以及腫瘤進展密切相關，是肺癌不良的預后因子[5]?？赡芤驗镾PA的表達對肺功能的影響較大，它參與局部炎癥和免疫反應，異常改變將導致許多肺部疾病，如果SPA缺乏，可能會影響肺腺癌患者的肺功能，進而出現(xiàn)SPA陰性表達的術后Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌患者DFS較差。

目前臨床上TTF-1作為病理中區(qū)分肺原發(fā)性和轉移癌、肺腺癌與肺鱗癌1個常用的免疫組化指標，根據以往文獻以及我們本次研究均提示TTF-1的表達預測復發(fā)，影響預后，我們能否將TTF-1陰性作為1種亞型特殊對待，或把TTF-1陰性表達作為1個高危因素，即使期別較早，也給與干預，如輔助化療，減少復發(fā)發(fā)生，提高生存期。但我們這批數據中17例ⅠA期患者TTF-1均為陽性表達，可能主要影響ⅠB期的復發(fā)情況。也許樣本量太少的緣故，這也是本研究的缺點。此外該研究還有缺點，我們分析組織中TTF-1和SPA的表達，與基因擴增相比，可能敏感度比較低。

除了組織中TTF-1和SPA與DFS和OS的關系，我們也分析了性別、年齡、吸煙史、淋巴結轉移狀態(tài)、腫塊大小以及TNM分期對復發(fā)以及預后的影響，發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移狀態(tài)、腫塊大小以及TNM分期對以上兩者影響差異顯著，再次證實了分期預測復發(fā)和判斷預后的地位。

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[5] Jiang F,Caraway NP,Nebiyou Bekele B,et al.Surfactant Protein A Gene Deletion and Prognostics for Patients with Stage Ⅰ Non-Small Cell Lung Cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2005，11(15):5417-5424.

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[8] Hosono Y,Yamaguchi T,Mizutani E,et al.MYBPH,a transcriptional target of TTF-1,inhibits ROCK1,and reduces cell motility and metastasis〔J〕.EMBO J，2011,31(2):481-493.

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(編輯：吳小紅)

The Predictive Value of the Expressions of TTF-1 and SPA Protein on the Recurrence and Prognosis of Lung Adenocarinoma after Surgery

LIURuiqing,LIXingya,CAOHuicun,etal.TheAffiliatedPeople'sHospitalofZhengzhouUniversity/HenanPeople'sHospital,Zhengzhou,450000

Objective To study the predictive value of the expressions of TTF-1 and SPA protein on the recurrence and prognosis of lung adenocarinoma after surgery.Methods 112 cases of stage Ⅰ～Ⅲ lung adenocarcinoma were selected.The expressions of TTF-1 and SPA protein in tissues were detected by immunohistochemical detection.Results 68 cases had recurrence,median DFS of patients with positive and negative expression of TTF-1 were respectively 41 months and 9 months (P=0.013),the median OS were 65.0 months and 23.0 months respectively (P=0.037),median DFS of patients with positive and negative expression of SPA were respectively 59.0 months and 15.0 months (P=0.018),the median and OS were respectively 68.0 and 35.0 months (P=0.058).Conclusion The expression of TTF-1 and SPA in postoperative lung adenocarcinoma are effective predictors of recurrence.The patients with positive expression of TTF-1 have better prognosis.

Lung adenocarinoma;TTF-1;SPA;DFS;OS

國家自然科學基金(編號：21504082)

450000 鄭州大學附屬人民醫(yī)院，河南省人民醫(yī)院(劉瑞青，曹會存，李 輝，曹廣劭，劉建文，吳方明，劉玉巖，劉 健)；450000 鄭州大學第一附屬醫(yī)院(李醒亞)；450000 河南省腫瘤醫(yī)院(陳利娟)

劉 健

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.002

R734.2

A

1001-5930(2017)07-1048-04

2016-08-19

2017-04-20)