曹 翠，宋瑞清

(1.渭南師范學(xué)院 絲綢之路藝術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714099；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱150040)

【現(xiàn)代應(yīng)用技術(shù)研究】

1株藍(lán)變真菌的拮抗菌株的篩選

曹 翠1，宋瑞清2

(1.渭南師范學(xué)院 絲綢之路藝術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714099；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱150040)

采用平板對峙法和相對抑菌效果來判別真菌拮抗能力的大小，篩選出對藍(lán)變菌株抑制效果顯著的菌株，試驗結(jié)果表明：所選的10種拮抗菌(6種慢速生長菌和4種快速生長菌)對藍(lán)變真菌(Ophiostomapenicillatum)都有不同程度的抑菌作用，拮抗效果最佳的菌株有Fusariumtricinctum、Gibberellamoniliformis和Hypocrealixii，相對抑制率分別為34.7、6.77和0.36(60 h)，所篩選出的拮抗菌株都具有潛在的生物防治開發(fā)前景。

藍(lán)變真菌；拮抗作用；篩選

根據(jù)生態(tài)學(xué)理論，森林病蟲害流行是生物間一種不平衡的現(xiàn)象。[1]林木病害生物防治的原理就是建立一種新的能抑制病害流行的生物間動態(tài)平衡關(guān)系，通過生物間相互制約達(dá)到防治植物病害的目的。拮抗作用的研究是拮抗菌篩選和生防技術(shù)開發(fā)的基礎(chǔ)。本試驗以6個慢速生長真菌和4個快速生長真菌作為拮抗菌，以1個藍(lán)變真菌作為拮抗對象，采用平板對峙培養(yǎng)法篩選對藍(lán)變真菌拮抗效果顯著的拮抗菌，為病害的生物防治提供功能性菌株。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

藍(lán)變菌株和拮抗菌株均由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院實驗室提供，其中：藍(lán)變菌株：C3-Ophiostomapenicillatum;拮抗菌株：共10個(見表1)。

1.2 試驗方法

實驗采用平板對峙培養(yǎng)法。平板對峙培養(yǎng)能較好地反映同一生境內(nèi)不同真菌間的相互關(guān)系。[2]不同菌種的生長速度不同，當(dāng)生長緩慢的菌株和迅速生長的菌株同時置于一個培養(yǎng)皿內(nèi)對峙培養(yǎng)，生長快的菌株往往會完全抑制生長慢的菌株的生長，因此Shaw TM[3]建議生長緩慢的菌株先于生長快速的菌株接入培養(yǎng)皿，使二者能在培養(yǎng)皿中心直徑處相遇，從而為生長緩慢的菌株提供足夠的時間在培養(yǎng)基上定殖。

在直徑90 mm 的PDA 平板培養(yǎng)基上，相距45 mm分別接入半徑0.5 cm 的培養(yǎng)6 d、近乎同質(zhì)等量的拮抗菌與病原菌菌落，對照則將病原菌菌株單獨(dú)培養(yǎng)。將10個拮抗菌株按照培養(yǎng)基上生長速度快慢分為兩類，4個快速生長菌株和6個慢速生長菌株(見表1)。與快速生長菌株對峙培養(yǎng)前先接種藍(lán)變菌株，3 d后再接入快速生長菌株；慢速生長菌株和藍(lán)變菌株同時接種。每處理設(shè)3個重復(fù)，置于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h測量菌落的相對生長半徑(共4個半徑)。當(dāng)兩菌落相接觸相交后，觀察并記錄拮抗菌株對C3的抑制、包圍以及C3對拮抗菌株包圍、侵占的反作用。拮抗結(jié)果計算時，采用兩菌落相向半徑進(jìn)行拮抗生長測定。

表1 拮抗菌株信息表

被抑制率是拮抗菌和病原菌各自被對方的抑制率，相對抑制效果是拮抗菌在抑制病原菌時本身也被抑制損耗，自身被抑制一個單位即l%時所產(chǎn)生的抑菌效果。[4]由于同一生境下真菌群落內(nèi)各個成員之間的作用必然是相互的，相對抑制效果更能體現(xiàn)拮抗菌的真實作用。被抑制率與相對抑菌效果的計算如下[5]：

被抑制率=(單獨(dú)培養(yǎng)菌落半徑 - 菌落趨向半徑)/ 單獨(dú)培養(yǎng)菌落半徑×100 %，

相對抑菌效果=病原菌被抑制率/拮抗菌被抑制率。

2 結(jié)果與分析

6種慢速生長菌與C3對峙培養(yǎng)的結(jié)果分析如下(見表2和圖1至圖6)：

(1)在C20與C3的對峙培養(yǎng)中，24～48 h，兩菌株相互之間均有促生作用(被抑制率為負(fù)值)；72 h后相互之間才產(chǎn)生抑制作用，隨時間的增加，各自的被抑制率逐漸增大，144 h達(dá)到最大。相對抑制效果在96 h最高，為34.7。

(2)在C25與C3的對峙培養(yǎng)中，72 h之前C25對C3的生長有顯著的促進(jìn)作用，96 h后才產(chǎn)生抑制作用，144 h抑制作用達(dá)到最大，被抑制率均隨時間的增加而增大，C25對C3的拮抗作用隨時間的增加而增高；而在整個對峙培養(yǎng)過程中，C3對C25的生長一直處于抑制狀態(tài)，隨時間的延長，作用一直在增大，144 h達(dá)到最大。其相對抑制效果在96 h后超過1，144 h最高，為1.40。

(3)在C31與C3的對峙培養(yǎng)中，48 h之前C31一直促進(jìn)C3 生長，72 h后才有抑制作用，C3被抑制率隨時間的增加而增大，144 h達(dá)到最大。C3對C31的生長一直處于抑制狀態(tài)，144 h達(dá)到最高。相對抑制效果在120 h達(dá)到最高，為2.48。

(4)在C35與C3的對峙培養(yǎng)中，48 h之前雙方生長處于相互促進(jìn)中，72 h后雙方生長處于相互抑制狀態(tài)，各自的被抑制率均在144 h達(dá)最高，而相對抑制效果在96 h最大，為1.91。

(5)在C57與C3的對峙培養(yǎng)中，72 h之前C3的生長一直處于被 C57促進(jìn)狀態(tài)，96 h處于被抑制狀態(tài)；120 h之前C57的生長基本處于不顯著的被促進(jìn)狀態(tài)，之后才逐漸被抑制。C57對C3的相對抑制效果144 h達(dá)到最高，接近4。

(6)在C77與C3的對峙培養(yǎng)中，C3 被抑制率隨時間的增加而增大，144 h達(dá)最高；72 h之前C77生長處于被促進(jìn)狀態(tài)，96 h后生長被抑制。C77對C3的相對抑制效果144 h達(dá)到最高，為6.77。

在6種慢速生長菌與C3的對峙培養(yǎng)過程中，拮抗菌與C3整體上基本均有相互抑制作用，抑制率的大小差異很大，病原菌的被抑制率在-31.65%～65.88%之間，拮抗菌的被抑制率在18.37%～71.96%之間。從表2中可以看出，隨著時間的推移，C3的被抑制情況整體呈上升趨勢，其中對C3 抑制效果相對明顯的有C20、C77，其相對抑制效果分別為34.7、6.77，且都是在144 h達(dá)到最高值。在初期接入，有的拮抗菌和C3均有相互促進(jìn)生長的趨勢，所以被抑制率呈現(xiàn)負(fù)值；隨著時間的推移，大部分在72 h后開始相互抑制(C25、C57是在96 h開始相互抑制)。

在快速生長菌C63、C61、C78和C75與C3的對峙培養(yǎng)中(見表3和圖7至圖10)，可能由于C3先接入培養(yǎng)基培養(yǎng)，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的營養(yǎng)和空間優(yōu)勢，使快速生長菌的被抑制率大于C3。4個快速生長菌株與菌株C3之間均產(chǎn)生明顯的抑菌帶并呈包圍狀態(tài)，說明在短時間內(nèi)產(chǎn)生了抗生素。在整個對峙培養(yǎng)過程中，相對抑制效果均小于1，均在60 h達(dá)最高，分別為0.29、0.29、0.35和0.36。

圖1 C3與C20對峙

圖2 C3與C25對峙

圖3 C3與C31對峙

圖4 C3與C35對峙

圖5 C3與C57對峙

圖6 C3與C77對峙

圖7 C3與C63對峙

圖8 C3與C61對峙

圖9 C3與C78對峙

圖10 C3與C75對峙

C63、C61、C78分別在36 h與C3菌落接觸，接觸后即呈現(xiàn)對峙之勢，兩菌落停止生長，且出現(xiàn)明顯的抑菌帶；C75在36 h與C3接觸之后，C75菌落繼續(xù)生長侵入C3的菌落而使C3菌落減小，也出現(xiàn)明顯的抑菌帶。相對慢速生長菌而言，快速生長菌在短時間內(nèi)(36 h)對C3產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，且相對抑制效果分別為0.29、0.29、0.35和0.36。綜上，表明C75對C3有顯著的抑制效果，其他3個菌株有較好的抑制作用。因此，對C3相對抑制效果相對好的菌株為C20(34.70)、C77(6.77)和快速生長菌C75(60 h達(dá)0.36)。

表2 慢速生長菌株與菌株C3對峙培養(yǎng)結(jié)果

3 結(jié)語

通過離體的平板對峙培養(yǎng)法，利用被抑制率和相對抑制率兩個指標(biāo)共同衡量10個拮抗菌株對藍(lán)變菌株的拮抗效果，結(jié)果表明：篩選出對C3抑制效果最佳的菌株為C20、C77和快速生長菌C75，尤其C77對C3的抑制更強(qiáng)，在96 h時C3生長很慢,幾乎不再生長。由于藍(lán)變菌株先接入培養(yǎng)基培養(yǎng)，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的營養(yǎng)和空間優(yōu)勢，而使快速生長菌的被抑制率顯著大于藍(lán)變菌株的，相應(yīng)的相對抑制效果也較小，但是在短時間內(nèi)快速生長菌菌絲迅速生長與C3的菌落有菌絲交叉和包圍現(xiàn)象，且產(chǎn)生明顯的抑菌帶，從而對藍(lán)變菌株產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，說明在短時間內(nèi)產(chǎn)生了抗生素；慢速生長菌與C3同時接入培養(yǎng)基培養(yǎng)，生長速度差別不大，故慢速生長菌與C3的拮抗效果表現(xiàn)為拮抗菌菌落與C3菌落形成明顯的抑制帶；由于接入時間不同而使快、慢生長菌的相對抑制效果不同。結(jié)合其相對抑制效果的大小篩選出的最佳抑制菌株均具備作為生物防治資源的潛力。

表3 快速生長菌株與菌株C3對峙培養(yǎng)結(jié)果

[1] 胡容平.四川幾種重要藥用植物病害調(diào)查與川芎根腐病(Fusarium solani)防治初探[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2008.

[2] Murphy E A，Mitchell D.Interactions between Tricholomopsis rutilans and ectomycorrhizal fungi in Paired culture and in association with seedlings of lodgepole pine and Sitka-spruce[J].Forest Pathology，2001,31：331-344.

[3] Shaw T M，Dighton J，Sanders F E.Interactions between ectomycorrhizal and saprotrophic fungi on agar and in association with seedlings of lodgepole pine(Pinus contorta)[J].Mycological Research，1995,99:159-165.

[4] 黃永青.紅松樹棲真菌群落分析[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文,1993.

[5] 宋瑞清,周秀華.Trichodermo spp.對樟子松枯梢病病原菌的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004,32(4):29-30.

【責(zé)任編輯 馬小俠】

Screen to Antagonistic Strains of 1 Sapstain Fungi

CAO Cui1，SONG Rui-qing2

(1.Art School of Silk Road，Weinan Normal University，Weinan 714099，China; 2.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China)

We adopt the methods of tablet standoff and relative bacteriostatic effect to distinguish the ability of antagonisting，and Fungi with obvious and significant effects on Sapstain Fungi were screened.The results demonstrate that 10 antagonistic fungi have different control degree on Ophiostoma penicillatum，and that Strains Fusarium tricinctum，Gibberella moniliformis and Hypocrea lixii have significant inhibition effects on strain C3 growth-the relative antagonistic effects are 34.7，6.77 and 0.36 (60 hours after antagonistic culture)，respectively.Strains which are screened out have a potential prospect of biological preservation.

Sapstain Fungi; antagonism; screening

S476

A

1009-5128(2017)08-0057-05

2016-12-20

陜西省教育廳自然科學(xué)研究計劃項目：秦東地區(qū)濕地景觀格局演變特征及動力機(jī)制研究(16JK1274)；渭南師范學(xué)院科研計劃項目：陜西黃河濕地生物多樣性的研究及可持續(xù)開發(fā)(15YKP001)

曹翠(1985—)，女，山西朔州人，渭南師范學(xué)院絲綢之路藝術(shù)學(xué)院講師，農(nóng)學(xué)碩士，主要從事園林植物配置、植物病蟲害及防治研究。