向 勤，羅 潔，吳金芋 ，肖朝新，李 顏，樊汶樵，楊 帆

(重慶文理學院林學與生命科學學院重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護與開發(fā)研究中心，重慶永川402168)

棘腹蛙I型干擾素基因的克隆與原核表達

向 勤，羅 潔，吳金芋 ，肖朝新，李 顏，樊汶樵，楊 帆

(重慶文理學院林學與生命科學學院重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護與開發(fā)研究中心，重慶永川402168)

干擾素(IFN)具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能，具備較好的臨床應(yīng)用前景。為了解棘腹蛙干擾素的基因信息，本試驗明確了棘腹蛙I型IFN基因ORF編碼長度為561 bp，編碼的蛋白質(zhì)含有1個信號肽和103aa的保守功能結(jié)構(gòu)域。遺傳進化分析顯示，棘腹蛙I型IFN進化相對保守；其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋構(gòu)成，細胞表面受體結(jié)合能力相對保守。將目的片段裝入原核表達載體pET32a并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)進行蛋白表達與純化，獲得了預(yù)期蛋白。本研究證實了棘腹蛙I型IFN屬于相對保守的典型I型干擾素；為后期深入挖掘棘腹蛙IFN的生物學功能、促進廣譜抗病毒生物制劑研發(fā)提供了參考。

棘腹蛙 ； 干擾素 ； 克隆，序列分析，表達

干擾素(IFN)具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能，在機體免疫應(yīng)答的過程中具有重要意義，也是首個成功應(yīng)用于臨床治療的基因工程產(chǎn)品[1-2]。根據(jù)其抗原活性的差異，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型；其中，Ⅰ型干擾素為先天免疫細胞分泌的IFN-α、IFN-β和IFN-ω，能夠識別位于同一類細胞膜的受體[3]；Ⅱ型干擾素僅有IFN-γ，可輔助T細胞釋放白細胞介素，若表達異常會導致自身免疫性疾病[4]；Ⅲ型干擾素信號轉(zhuǎn)導機制與Ⅰ型干擾素類似，但能夠調(diào)節(jié)NK細胞發(fā)揮最佳活性[5-6]。

棘腹蛙(Paaboulengeri)，隸屬于兩棲綱無尾目蛙科棘蛙屬，是我國特有的分布于西南地區(qū)的土著大型蛙類。本課題組前期對棘腹蛙皮膚轉(zhuǎn)錄組進行序列測定，首次獲得了其Ⅰ型干擾素的注釋信息；通過對棘腹蛙Ⅰ型干擾素基因(IFN-Pb)進行驗證、分析和原核表達，為進一步研究其生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑和耗材 2歲齡健康棘腹蛙，飼養(yǎng)于本實驗室兩棲動物流水養(yǎng)殖系統(tǒng)。TRIZol、DEPC，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；cDNA合成試劑盒、Taq酶、PCR純化試劑盒，購自Promega公司；凝膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；Trans2K DNA Marker、EcoRI和XhoI，購自TaKaRa公司。pET32a與BL21(DE3)為本實驗室保存，Ni NTA Beads 為常州天地人和有限公司生產(chǎn)(貨號：SA004010)；其余培養(yǎng)基及蛋白表達與純化相關(guān)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 特異引物的設(shè)計 IFN-Pb序列來自于本實驗室自測的棘腹蛙皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計基因特異性引物(上游引物序列為：5′-GAGCCCACAGAGCAGAACATCCCTT -3′；下游引物序列為：5′-CAGGCTCCTTCATCGCGTCCAATCA -3′)。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 序列驗證 小心摘取棘腹蛙皮膚組織，立即放入液氮中。隨后按試劑盒說明書抽提總RNA，并利用cDNA合成試劑盒說明書完成cDNA的制備。利用DNATaq酶進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠回收試劑盒進行回收。陽性產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.4 生物信息學分析 使用SMART，SignalP 3.0，BoxShade Server軟件分別進行功能結(jié)構(gòu)域、信號肽、同源比對。在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索IFN同源序列，利用ClustalX 1.83進行多重序列比對，隨后利用MEGA 5.0軟件對IFN家族基因進行鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，取1 000次重復檢驗以估算各分枝的置信值。

1.5 重組表達蛋白的分離及純化 將1.3中驗證后的重組質(zhì)粒進行亞克隆，引物分別加上EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點后獲得去除信號肽的ORF序列(上下游引物序列分別為：5′-CCGGAATTCCAAACTTGCAAATGGCTCCACCGAA-3′和5′-GGCGAGCTCTTAGTCATGTGACTTCTGTTTTCTC-3′)，酶切后裝入大腸桿菌表達載體pET32a。

陽性重組表達載體pET32a-IFN-Pb轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達感受態(tài)細胞BL21(DE3)。經(jīng)抗性篩選出轉(zhuǎn)化成功的菌株，在37 ℃下用終濃度為0.5mmol/L IPTG進行誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE 檢測蛋白表達情況。收集表達后的菌體進行超聲破碎，檢測蛋白的表達形式，最后根據(jù)蛋白的表達形式選擇相應(yīng)的方法通過鎳柱親和層析純化目的蛋白。

2 結(jié)果

2.1IFN-Pb基因的擴增 以棘腹蛙皮膚組織的cDNA為模板，利用RT-PCR方法擴增出了長約650 bp的目的片段(圖1)。測序結(jié)果如圖2顯示，IFN-Pb全長序列包含一個ORF為561 bp，共編碼186個氨基酸，其中，酸性氨基酸為48個，遠遠大于堿性氨基酸的數(shù)目(27個)，暗示該蛋白可能受到選擇壓力影響。

圖1 IFN-Pb基因擴增結(jié)果

M：Marker； IFN：陽性樣品； C：陰性對照

圖2 IFN-Pb的基因編碼序列及氨基酸序列

2.2IFN-Pb基因的序列相似性分析 對IFN-Pb同源序列構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果顯示(圖3)IFN-Pb與爪蟾單獨聚為一枝，與硬骨魚較為近緣，而與偶蹄類、食肉類、食蟲類、嚙齒類和靈長類動物親緣關(guān)系較遠。其中，與已發(fā)布的爪蟾的I型干擾素氨基酸序列同源性為65%，置信值為43%，親緣關(guān)系最近，進一步說明棘腹蛙IFN-Pb的遺傳進化相對穩(wěn)定而保守。

將帶有重組質(zhì)粒pET32a-IFN-Pb的BL21(DE3)在37 ℃、IPTG濃度為0.5 mmol/L時以可溶蛋白和包涵體形式均可表達(圖4A)。而后經(jīng)過Ni NTA Beads親合層析柱進行目的蛋白的純化。結(jié)果顯示(圖4B)，在濃度為20 mmol/L、60 mmol/L和300 mmol/L咪系統(tǒng)進化樹構(gòu)建所用的物種及GenBank登錄號：鼩鼱，XP_012787224.1；東北虎，ALJ03295.1；獵豹，XP_014923397.1；地松鼠，XP_005335983.1；維德爾海豹，XP_006745530.1；太平洋海象，XP_004405712.1；雪貂，XP_004761833.1；刺猬，XP_007533180.1；小耳大嬰猴，XP_003782904.1；克氏冕狐猴，XP_012520479.1；川金絲猴，XP_010371759.1；眼鏡猴，XP_008069815.1；馬，XP_005605088.1；驢，XP_014686764.1；家犬，AEI30864.1；南非爪蟾，AHN05532.1；熱帶爪蟾，CAO03087.1；虹鱒魚，ACJ03565.1；大西洋鮭, XP_014059915.1；嚙齒目動物包括：XP_001053250.1, XP_003750022.1, CAA25091.1, XP_578466.2, XP_008756430.1, XP 578467.1, XP_003750023.1. 分枝上的數(shù)字代表置信值唑均可將IFN-Pb重組蛋白洗脫出來，其中最佳咪唑洗脫濃度為300 mmol/L。

圖3 棘腹蛙IFN同源序列的系統(tǒng)進化分析

3 結(jié)論

動物領(lǐng)域的新型干擾素研究起步相對較晚，開展兩棲類動物干擾素研究對于動物傳染病防控和臨床醫(yī)學研究都有一定的促進作用。前期對棘腹蛙的遺傳特性研究發(fā)現(xiàn)，棘腹蛙種群屬于一個單系分支[7-8]，在進化過程中相對獨立[9-10]；其機體免疫系統(tǒng)針對傳染性疾病的應(yīng)答機制并無報道。本試驗以棘腹蛙的cDNA為模板，獲得了IFN-Pb的全基因序列，其氨基酸序列以酸性氨基酸占主導地位，可能嚴格遵循自然選擇規(guī)則。與已知兩棲類動物進行多重序列比對結(jié)果顯示，與已知兩棲模式動物相比，該基因在N端存在較多的氨基酸位點突變，C端則明顯簡縮，但該蛋白含有1個信號肽和103aa的保守功能結(jié)構(gòu)域，暗示該基因的功能相對保守。遺傳進化分析進一步說明，棘腹蛙IFN-Pb與爪蟾單獨聚為一枝，與硬骨魚相對近緣，進化地位相對保守。而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，IFN-Pb與人的干擾素α相似度為31%，主要由α螺旋構(gòu)成，說明該蛋白盡管與人的同源蛋白存在較大分化；但是，其細胞表面受體結(jié)合能力相對保守。

原核表達結(jié)果顯示，IFN-Pb在大腸桿菌中使用pET32a作為載體進行原核表達時，目的蛋白可以以包涵體沉淀和可溶上清兩種形式，可溶上清使用Ni-NTA beads進行純化，目的蛋白在300 mmol/L咪唑下洗脫得到了高純度的蛋白，這為進一步對IFN的生物活性研究提供了扎實的基礎(chǔ)。

圖4 棘腹蛙IFN重組蛋白質(zhì)表達及純化的SDS-PAGE分析

注：箭頭所示為IFN原核表達重組蛋白

綜上所述，棘腹蛙IFN-Pb的結(jié)構(gòu)和功能相對保守，僅N-和C-端序列存在一定分化，原核表達可獲得預(yù)期蛋白。深入挖掘棘腹蛙的干擾素的生物學功能，將對我們了解該類細胞因子是如何介導的高等動物的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，以及生產(chǎn)廣譜抗病毒生物制劑奠定前期基礎(chǔ)。

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Clone and expression of typeⅠinterferon fromPaaboulengeri

XIANG Qin, LUO Jie, WU Jin-yu,XIAO Chao-xin,LI Yan,FAN Wen-qiao,YANG Fan

(College of Forestry & Life Science Chongqing University of Art & Science Chongqing Chongqing Research Centers of Conservation and Development on Rare & Endangered Aquatic Resources, Chongqing 402168, China)

Interferons have the functions of anti-virus, anti-tumor and immune regulation. For better understanding of the interferon encoding genes, we have studied the full length sequence of typeⅠinterferon fromPaaboulengeriby RT-PCR. The results showed that,IFN-Pb, was 649bp long, encoding 186 aa protein and containing a signal peptide and a conserved interferon functional domain, especially consisting of an alpha helix composition and a cell surface receptor binding domain. Besides, phylogenic analysis illustrated that it had a closer relationship withXenopus, and was clustered into aquatic branches. TheIFN-Pbwas inserted into prokaryotic expression vector pET32a(+) by restriction enzyme digestion and then the plasmids was transformed inE.coliBL21(DE3). The protein was induced with IPTG and the fusion protein was purified successfully with Ni-sepahrose.

Paaboulengeri; Interferon ; Cloning ; Sequence analysis ; Expression

YANG Fan

2016-08-10

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510642064)；重慶市科技計劃重點專項(cstc2015jcyjBX0013)；重慶市科技計劃項目 (cstc2014jcyjA80042)；重慶文理學院人才引進項目(R2013LS13, R2014LX07)

向勤(1993-)，女，本科生，就讀于生物科學專業(yè)，E-mail: 846857730@qq.com

楊帆，E-mail: yfan4103@163.com

S947

A

0529-6005(2017)04-0023-04