徐 纓金曉飛蔣 旭

菝葜治療兩種不孕癥大鼠模型療效觀察及初步機(jī)制研究

徐 纓1金曉飛2蔣 旭2

目的研究菝葜治療排卵障礙型不孕癥和輸卵管炎性不孕癥大鼠模型的療效及其初步機(jī)制。方法Sprague Dawley大鼠70只，采用雄激素致排卵障礙型不孕癥大鼠模型，采用苯酚膠漿法致輸卵管炎性不孕癥大鼠模型，分別設(shè)立菝葜組、對(duì)照組、模型組和正常組。排卵障礙型不孕癥大鼠菝葜組和對(duì)照組分別灌胃菝葜提取物12g/（kg·d）、枸櫞酸克羅米芬4.5mg/（kg·d），模型組和正常組均灌胃蒸餾水12mg/（kg·d）。輸卵管炎性不孕癥大鼠除對(duì)照組灌胃婦科千金片3.0g/（kg·d），余三組同排卵障礙性不孕癥。對(duì)排卵障礙型不孕癥大鼠檢測(cè)體質(zhì)量差、子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)、血清雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）；對(duì)輸卵管炎性不孕癥大鼠進(jìn)行炎癥評(píng)分，檢測(cè)血清腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素-2（IL-2）。結(jié)果排卵障礙型不孕癥大鼠菝葜組體質(zhì)量差比對(duì)照組和模型組明顯減輕[（37.00±4.78）g比（44.37±2.26）g、（45.12±2.29）g，P<0.01]，卵巢指數(shù)比模型組偏高[（32.51±1.51）比（30.37±1.40），P<0.05]，子宮指數(shù)與模型組無差異（P>0.05），血清E2、LH、FSH濃度比正常組和對(duì)照組均低，但比模型組明顯偏高[E2：（619.75±25.40）pg/mL比（959.25± 15.14）pg/mL、（781.00±42.69）pg/mL、（572.37±3.15）pg/mL；LH：（5.10±0.19）mIU/mL比（5.27±0.12）mIU/mL、（6.10±0.19）mIU/mL、（4.32±0.15）mIU/mL；FSH：（0.98±0.16）mIU/mL比（1.37±0.04）mIU/mL、（1.31±0.04）mIU/mL、（0.66±0.07）mIU/mL；P<0.05或P<0.01]。輸卵管炎性不孕癥大鼠菝葜組炎癥評(píng)分比模型組明顯降低[（1.71±0.35）分比（3.28±0.77）分，P<0.01]，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），血清TNF-α和IL-2與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[TNF-α：（0.46±0.04）ng/mL比（1.13±0.22）ng/mL；IL-2：（1.70±0.01）ng/mL比（1.00±0.17）ng/mL；P<0.01]，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論菝葜對(duì)雄激素致排卵障礙型不孕癥大鼠模型的體質(zhì)量有較好的干預(yù)作用，對(duì)卵巢指數(shù)的增加有一定的幫助，對(duì)血清E2、LH、FSH有一定的良性調(diào)節(jié)；菝葜對(duì)輸卵管炎性不孕癥大鼠模型的炎癥評(píng)分有明顯改善，對(duì)血清TNF-α和IL-2具有很好的調(diào)節(jié)作用。

大鼠；不孕癥；菝葜；TNF-α；IL-2；生殖激素

菝葜為百合科植物菝葜（smilax china L.）的干燥根莖，《名醫(yī)別錄》中列菝葜為中品，味甘、微苦、澀，性平，歸肝、腎經(jīng)。具有利濕祛濁、祛風(fēng)除痹，解毒散瘀之功效[1-2]。菝葜廣泛用于治療婦科疾病，對(duì)婦科炎癥和不孕癥具有較好的功效。本實(shí)驗(yàn)擬通過菝葜治療無排卵型大鼠模型和輸卵管炎癥大鼠模型，研究菝葜治療兩種類型不孕癥的療效及其初步作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)健康雌性Sprague Dawley大鼠70只，22日齡，體質(zhì)量（180±20）克，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)，合格證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料（由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）及自由飲水，12h循環(huán)燈光。

1.2 主要試劑與藥品菝葜，杭州華東醫(yī)藥參茸分公司；生理鹽水，無錫市晶科化學(xué)工業(yè)有限公司；75%醫(yī)用酒精、碘伏，杭州歐拓普生物技術(shù)有限公司；注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司；縫合線，杭州華威醫(yī)療用品有限公司；甲醇、異丙醇，無錫市晶科化學(xué)工業(yè)有限公司；20%苯酚糊劑，用1% CMC-Na作溶劑，自行配制，使用時(shí)搖勻；白細(xì)胞介素-2（IL-2）放射免疫分析藥盒，北京科美東雅生物技術(shù)有限公司；碘[123]腫瘤壞死因子（TNF-α）放射免疫分析藥盒，北京科美東雅生物技術(shù)有限公司；血清雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）放射免疫分析試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所；枸椽酸克羅米芬片（50mg/片），塞浦路斯高特制藥有限公司；丙酸睪丸酮注射液（lmL∶25mg），上海通用藥業(yè)有限公司；中性茶油（500g/瓶），浙江田雨山藥用油有限公司；婦科千金片，3.4g生藥/片，湖南株洲千金藥業(yè)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；恒溫手術(shù)臺(tái)，Harvard公司；ACSD型電子計(jì)價(jià)秤，浙江永康市整雅衡量一廠；AB135-S電子天平，法國(guó)METTLE TOLEDO公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；M4酶標(biāo)儀，MD公司；電泳-轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-1G型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；DDL-5低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；SN-695B型智能放免測(cè)量?jī)x，上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡，OLYMPUS8122214，日本。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠模型的制備雄激素致排卵障礙型不孕癥大鼠模型的制作參照魏美娟等實(shí)驗(yàn)方法[3]。選擇22日齡SD雌性大鼠幼鼠，于頸背部皮下注射丙酸睪丸酮1.25mg/只（0.05mL/只），正常組在相同部位皮下注射等量中性茶油0.05mL。至70日齡陰道開口之后，每日取陰道脫落細(xì)胞涂片，鏡下觀察，連續(xù)觀察10天（1個(gè)性周期為5天），涂片出現(xiàn)持續(xù)性無核角化細(xì)胞，提示無性周期變化，造模成功。

輸卵管炎性不孕癥大鼠模型采用“苯酚膠漿法”[4]。將大鼠麻醉、固定、局部脫毛消毒后，在腹正中行0.8～1cm長(zhǎng)的縱向切口，暴露并固定子宮，用4號(hào)針頭在“Y”型子宮分叉處左側(cè)進(jìn)針，向卵巢方向緩慢注入20%苯酚膠漿0.1mL，正常組（假手術(shù)組）注射同等劑量的生理鹽水，出針時(shí)按壓針孔以防滲漏；注畢，分層關(guān)腹，于縫合傷口上涂抹2%碘酊并撒適量青霉素－鈉（PG-Na）粉末以防感染。造模15天后隨機(jī)抽取其中3只解剖，大體觀察見子宮組織與盆腔其它組織有粘連，宮腔部分狹窄、子宮壁充血；取子宮組織做病理切片，光鏡下觀察見子宮內(nèi)膜上皮及腺上皮細(xì)胞增生，大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，尚可見少量中性粒細(xì)胞，證明造模成功[5-6]。

2.2 分組及給藥排卵障礙型不孕癥大鼠模型隨機(jī)分為3組，每組8只：菝葜組采用菝葜提取物12g/（kg·d）灌胃，對(duì)照組采用枸櫞酸克羅米芬4.5mg/（kg· d）灌胃，模型組給予蒸餾水12mg/（kg·d）灌胃；正常組8只，灌胃同模型組。輸卵管炎性不孕癥大鼠模型隨機(jī)分為3組，每組8只：菝葜組采用菝葜提取物12g/（kg·d）灌胃治療，對(duì)照組采用婦科千金片3.0g/（kg·d）灌胃治療，模型組給予蒸餾水12mg/（kg·d）灌胃；正常組（假手術(shù)組）8只，灌胃同模型組。自80日齡起開始每日灌胃給藥。菝葜70%乙醇提取物按照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道制備[7-8]，臨床給藥以60kg/人為標(biāo)準(zhǔn)，按照（體表面積-劑量）換算法（大鼠用量=成人日服用量×0.018×5）計(jì)算大鼠給藥劑量。菝葜提取物用蒸餾水配成濃度為4g/mL的混懸液。婦科千金片懸液，配藥濃度10%。每天同一時(shí)間灌胃，均連續(xù)灌胃4周后檢測(cè)指標(biāo)。

2.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)排卵障礙型不孕癥大鼠模型：（1）在給藥第4周起每日上午定時(shí)用消毒棉簽取大鼠陰道脫落細(xì)胞做涂片，連續(xù)一個(gè)性周期，顯微鏡下觀察大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片，觀察大鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期變化的例數(shù)，對(duì)排卵率的影響。（2）最后一次灌胃后24h稱重，所得體質(zhì)量值減去治療前體質(zhì)量值即為體質(zhì)量差。（3）稱重后，用戊巴比妥鈉(濃度為3%)腹腔注射麻醉大鼠，用5mL一次性注射器抽取腹主靜脈血4mL，置事先預(yù)備的塑料試管中，4℃存放4h后，3000rpm、4℃離心15min，取上清液，分裝置4℃保存?zhèn)溆?。放射免疫法測(cè)定大鼠血清雌二醇、促黃體生成素、卵泡刺激素濃度。（4）取大鼠子宮和卵巢稱重后，計(jì)算每只大鼠的子宮指數(shù)（mg/100g）及卵巢指數(shù)（mg/100g）。

輸卵管炎性不孕癥大鼠模型：（1）肉眼觀察左側(cè)大鼠子宮的大體形態(tài)變化，并與右側(cè)子宮進(jìn)行對(duì)比，具體觀察以下幾個(gè)方面：子宮與周圍組織的粘連、子宮壁充血、宮腔狹窄、宮腔積液、炎性包塊、對(duì)右側(cè)子宮的影響。將6個(gè)項(xiàng)目的情況由輕到重評(píng)分為0、1、2、3分，統(tǒng)計(jì)炎癥積分并進(jìn)行比較[9]。（2）放射免疫法測(cè)定大鼠血清TNF-α和IL-2濃度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件，服從近似正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用一維方差分析（F檢驗(yàn)），方差齊性時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)；均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中由于苯酚膠漿法造模后死亡2只，術(shù)后隨機(jī)抽取3只大鼠處死用于判斷造模是否成功。正常飼養(yǎng)至80日齡后，連續(xù)灌胃4周，治療結(jié)束后每組各取8只大鼠進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

3.1 菝葜對(duì)雄激素致排卵障礙型不孕癥大鼠模型的影響治療結(jié)束后，各組與正常組相比，體質(zhì)量均有明顯增加（P<0.01）；菝葜組比對(duì)照組和模型組明顯減輕（P<0.01）。對(duì)照組子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)較模型組明顯增加（P<0.01），菝葜組卵巢指數(shù)比模型組偏高（P<0.05）；各組與正常組相比，兩項(xiàng)指數(shù)均明顯降低（P<0.01）。與模型組相比，各組血清雌二醇、促黃體生成素、卵泡刺激素濃度均有明顯升高（P<0.01），與正常組比較均明顯降低（P<0.05，P<0.01），菝葜組三項(xiàng)指標(biāo)均低于對(duì)照組（P<0.01），見表1。

表1 各組排卵障礙型不孕癥大鼠體質(zhì)量差、子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)及生殖激素比較

表1 各組排卵障礙型不孕癥大鼠體質(zhì)量差、子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)及生殖激素比較

注：與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與正常組比較，＃P<0.05，＃＃P<0.01；與菝葜組比較，*P<0.05，**P<0.01；E2：雌二醇，LH：黃體生成素，F(xiàn)SH：卵泡刺激素

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3.2 菝葜對(duì)輸卵管炎性不孕癥大鼠模型的影響治療后，菝葜組和對(duì)照組炎癥評(píng)分均比模型組明顯降低（P<0.01），對(duì)照組與菝葜組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組TNF-α與模型組相比均明顯降低（P<0.01），菝葜組、對(duì)照組、正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)（P>0.05）。各組IL-2比模型組明顯偏高，與正常組相比均明顯偏低（P<0.01），菝葜組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 各組輸卵管炎性不孕癥大鼠炎癥指標(biāo)比較

表2 各組輸卵管炎性不孕癥大鼠炎癥指標(biāo)比較

注：與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與正常組比較，＃P<0.05，＃＃P< 0.01；TNF-α：腫瘤壞死因子；IL-2：白細(xì)胞介素-2

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4 討論

排卵障礙和輸卵管炎癥是導(dǎo)致不孕癥的最常見病因，兩者常兼具[10]。菝葜為民間常用中藥，能祛風(fēng)濕、利小便、消腫毒，可治關(guān)節(jié)痛、水腫、疔瘡等，還對(duì)婦科附件炎、附件炎性包塊等有較好療效，民間將菝葜單味藥用于治療不孕癥，收效較好[11-12]。菝葜的有效成分可以降低大鼠子宮的腫脹率，調(diào)節(jié)大鼠子宮組織中的TNF-α和IL-4等炎癥因子的表達(dá)[13-14]。目前，對(duì)于中藥治療無排卵性不孕癥的研究中，關(guān)注較多的是補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)中藥或方劑，尚未見菝葜治療無排卵性不孕的研究報(bào)道[15]。

本試驗(yàn)采用雄激素致不孕大鼠（androgen－induced sterile rats,ASR）作為無排卵性不孕癥的動(dòng)物模型，是目前比較明確的動(dòng)物模型類型[16]。對(duì)于輸卵管炎性不孕癥的模型采用“苯酚膠漿法”，是比較成熟的慢性盆腔炎大鼠造模方法，該模型造成的組織增生、炎性粘連、局部狹窄、積液、慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，與人類慢性盆腔炎表現(xiàn)出的病理變化極為相似[17]。本試驗(yàn)對(duì)單味藥菝葜提取物治療兩種類型的不孕癥同時(shí)進(jìn)行研究，旨在探索菝葜治療不孕癥的初步機(jī)理，在目前已知該藥具有抗炎止痛功效的基礎(chǔ)上，觀察其對(duì)下丘腦－垂體－卵巢性腺軸的調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果提示，菝葜對(duì)雄激素致無排卵大鼠模型的體質(zhì)量有較好的干預(yù)作用，對(duì)增加大鼠模型的卵巢指數(shù)有一定的幫助，對(duì)E2、LH、FSH三項(xiàng)生殖激素有一定的良性調(diào)節(jié)，優(yōu)于模型組，但療效不如對(duì)照組。菝葜對(duì)輸卵管炎性不孕癥大鼠模型的炎癥評(píng)分有明顯改善，對(duì)TNF-α和IL-2兩項(xiàng)炎癥因子都具有良性調(diào)節(jié)作用。以上實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，菝葜提取物對(duì)苯酚膠漿導(dǎo)致的大鼠輸卵管慢性炎癥有比較明確的療效，對(duì)雄激素致無排卵大鼠模型的體質(zhì)量和生殖激素有一定的干預(yù)作用?；谝陨系难芯拷Y(jié)果，對(duì)于輸卵管炎性不孕癥或炎性不孕癥合并有排卵障礙的患者，菝葜可以作為主要的用藥，對(duì)于排卵功能障礙合并體質(zhì)量超重的不孕癥，菝葜亦可作為輔助用藥。

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（收稿：2016-11-10修回：2016-12-09）

Effects of Chinaroot Greenbrier on Two Kinds of Infertility Rat Models and the Preliminary Mechanism

XU Ying1,JIN Xiaofei2,JIANG Xu2.1 Department of Internal Chinese Medicine,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 The Third Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University Hangzhou(310005),China

ObjectiveTo study the effects of Chinaroot greenbrier on infertility rats with ovulation obstacleorchronic pelvic inflammatory disease（CPID）and to probe the preliminary mechanism.MethodsExperiment one applied the androgen-anovulatory rat model,experiment two used the CPID rat model caused by phenol mucilage. Each experiment was divided into four groups:treatment group,control group,model group and normal group. Treatment group and control group in experiment one were intragastrically given the extract from Chinaroot greenbrier of 12g/（kg·d）and serophene of 4.5mg/（kg·d）,model group and normal group were given distilled water 12mg/（kg·d）.In experiment two,control group was given Fukeqianjinpian of 3.0g/（kg·d）,the rest groups were administered the same drugs as in experiment one.Experiment one tested the weight changes,the indexes of uterus and ovarian,serum estradiol（E2）,luteinizing hormone（LH）and follicle-stimulating hormone（FSH）;Experiment twoevaluated the inflammatory score of CPID,serum tumor necrosis factor（TNF-α）and interleukin-2（IL-2）.ResultsExperiment one:in treatment group,the weight of rats was significantly reduced than that incontrol group and in model group（37.00±4.78g vs 44.37±2.26g,45.12±2.29g,P<0.01）,the ovarian index was higher than that of model group（32.51±1.51 vs 30.37±1.40,P<0.05）,the uterus index had no difference compared to the model group（P> 0.05）,the concentration of serum E2，LH and FSH were lower than that ofnormal group and control group but higher than that of model group（E2：619.75±25.40pg/mL vs 959.25±15.14pg/mL,781.00±42.69pg/mL,572.37±3.15pg/ mL;LH:5.10±0.19mIU/mL vs 5.27±0.12mIU/mL,6.10±0.19mIU/mL,4.32±0.15mIU/mL;FSH:0.98±0.16mIU/mL vs 1.37±0.04mIU/mL,1.31±0.04mIU/mL,0.66±0.07mIU/mL;P<0.05 or P<0.01）.Experiment two:the inflammation score of treatment group was significantly decreased than that of model group（1.71±0.35 vs 3.28±0.7,P<0.01）,but had no significant difference compared with that of control group（P>0.05）;the concentration of serum TNF-α was significantly lower and IL-2 washigher that those of model group（TNF-α:0.46±0.04ng/mL vs 1.13±0.22ng/mL;IL-2: 1.70±0.01ng/mL vs 1.00±0.17ng/mL;P<0.01）,but had no significant difference compared with that of control group（P>0.05）.ConclusionFor the androgen anovulatory rats model,chinaroot greenbrier has positive effects for weight changes,ovarian index,and adjustment of the serum E2,FSH,and LH.For the CPID model rats,chinaroot greenbrier can improve the inflammatory score,and have positive regulatory effect on the serum TNF-α and IL-2.

rats;infertility;Chinaroot greenbrier;TNF-α;IL-2;reproductive hormone

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014ZB058）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科（杭州310005）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（杭州310053）

徐纓，Email：xy_qy@126.com