李 冰 杜義斌

(云南省中醫(yī)醫(yī)院， 昆明 650021)

骨疏顆粒對(duì)去勢(shì)雌性大鼠骨關(guān)節(jié)炎的影響觀察

李 冰 杜義斌

(云南省中醫(yī)醫(yī)院， 昆明 650021)

觀察骨疏顆粒對(duì)去勢(shì)雌性大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的性激素、炎性因子影響，以及骨疏顆粒治療去勢(shì)后雌性大鼠骨關(guān)節(jié)炎的療效．將60只SD大鼠隨機(jī)分為4組：模型組、正常對(duì)照組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組．采用卵巢摘除聯(lián)合過度運(yùn)動(dòng)制作骨關(guān)節(jié)炎模型，觀察大鼠性激素、炎性因子改變．結(jié)果表明，與模型組比較，骨疏顆粒組及雌激素組均可以改善去勢(shì)雌性大鼠性激素、炎性因子水平(P<0.01或P<0.05)，二者之間無顯著差異(P>0.05)．骨疏顆粒能治療和延緩去勢(shì)雌性大鼠骨關(guān)節(jié)炎病變，與戊酸雌二醇無顯著性差異．

骨關(guān)節(jié)炎； 骨疏顆粒； IL-1； IL-6； TNF-α； 實(shí)驗(yàn)研究

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis， OA)是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，多見于中老年人，且女性多于男性，特別是絕經(jīng)后婦女[1].中醫(yī)認(rèn)為腎為先天之本，脾胃為后天之本，氣血生化之源，骨性關(guān)節(jié)炎的病機(jī)為腎氣虛衰，脾失健運(yùn)，脈絡(luò)瘀阻．中醫(yī)治療骨性關(guān)節(jié)炎的主要方法就是補(bǔ)腎健脾活血，本實(shí)驗(yàn)研究觀察補(bǔ)腎健脾活血方骨疏顆粒對(duì)去勢(shì)雌性大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的影響．

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

選擇8月齡SD雌性未孕大鼠60只，體重在250±50 g之間．由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滇)2011-0004．在昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室室溫18～22℃．隨機(jī)分為4個(gè)組，分別為戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組、正常對(duì)照組、模型組．

1.2 藥品、試劑與儀器

1)藥品．骨疏顆粒由狗脊、淫羊藿、炙黃芪、骨碎補(bǔ)、白術(shù)、熟地、三七、杜仲、陳皮、獨(dú)活等組成，生藥由云南中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供，并配制成顆粒劑．骨疏顆粒每袋重15 g(生藥)，用蒸餾水按8.6 g/kg配制成2.5 mL藥液灌胃．戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，1 mg*21片/盒，批號(hào)：095C)按0.1 mg/kg用蒸餾水配成2.5 mL溶液．本實(shí)驗(yàn)骨疏顆粒的用量為人正常用量的10倍．確定此用量是基于預(yù)實(shí)驗(yàn)中去勢(shì)雌性大鼠骨關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)變化的治療劑量．

2)試劑．雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕酮(P)、催乳激素(PRL)、卵泡生成激素(FSH)、黃體生成激素(LH)放射免疫試劑盒，由天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司提供．生化指標(biāo)試劑盒為武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司生產(chǎn)：IL-1，IL-6，TNF．使用ELISA法檢測(cè)．

3)儀器．石蠟切片機(jī)(德國比CIA公司生產(chǎn))，石蠟切片機(jī)刀片(德國ELICA公司產(chǎn)品)，組織貼片機(jī)(YT-6B湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所)，包埋機(jī)(SHANDON)電熱恒溫T燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，普通光鏡(尼康NIKONE200日本)放大倍數(shù)(×20)．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1)造模方法．8月齡SD雌性大鼠60只，以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，以最末肋骨所對(duì)應(yīng)之椎體為中點(diǎn)做背部正中縱行切口，向兩側(cè)牽拉切口，分別于脊柱兩側(cè)切開肌層，顯露兩側(cè)腎臟，于其下找到卵巢并切除，止血后縫合切口．卵巢送病理切片確定切除完整．正常對(duì)照組大鼠步驟同前，切除卵巢旁部分脂肪，不切除卵巢．考慮動(dòng)物可能有死亡，各組多備2只大鼠，確保實(shí)驗(yàn)分組均為15只，術(shù)后3 d內(nèi)每日給予80萬單位青霉素肌注預(yù)防感染，分籠飼養(yǎng)，在(24±2)℃、通風(fēng)良好、濕度60%～70%的實(shí)驗(yàn)條件下標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料喂養(yǎng)，自由攝水．切口愈合后將動(dòng)物置于電動(dòng)滾輪上，驅(qū)使動(dòng)物行走，10 min/次，2次/d．

2)給藥方法．在大鼠接受造模處理12周后，開始進(jìn)行藥物的灌胃．空白對(duì)照組和模型組大鼠各自灌服2.5 mL生理鹽水．戊酸雌二醇組和骨疏顆粒組大鼠稱重，灌服配置藥液2.5 mL，分別于第4周、第8周、第16周結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)處死5只大鼠取血及關(guān)節(jié)液標(biāo)本．

3)觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法．于用藥后第4、第8、第16周3個(gè)時(shí)相點(diǎn)測(cè)定關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6及TNF-α含量及血清性激素水平(ELISA法)．觀察大鼠左膝關(guān)節(jié)病理切片變化．

2 結(jié) 果

造模的60只雌性大鼠，傷口均愈合良好，無感染、出血、潰瘍等情況．造模后第2～3 d，大鼠進(jìn)食、飲水均較術(shù)前減少，大便稀軟；造模12周后存活的大鼠未見明顯異常，灌胃期間模型組大鼠精神略顯差，體毛干枯不齊，其余各組表現(xiàn)不明顯．

2.1 各組大鼠血清性激素水平的比較

與正常對(duì)照組比較，模型組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組E2水平有明顯降低(P<0.01)，表明造模成功．組間比較，戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組與模型組比較E2水平有明顯升高(P<0.01)，但未達(dá)到正常水平．戊酸雌二醇組與骨疏顆粒組之間無明顯差異(P>0.05)．與正常對(duì)照組比較，戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組T水平降低(P<0.05)．戊酸雌二醇組與骨疏顆粒組無明顯差異(P>0.05)．與正常對(duì)照組比較，戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組P，PRL水平降低(P<0.05，P<0.01)，骨疏顆粒組較戊酸雌二醇組降低(P<0.05)，與模型組無明顯差異(P>0.05)．LH，F(xiàn)SH水平4組之間無明顯差異(P>0.05)(見表1)．

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液IL-1β水平的第4、8、16周比較

第4周戊酸雌二醇組與骨疏顆粒組無明顯差異(P>0.05)，模型組較戊酸雌二醇組與骨疏顆粒組升高(P<0.05)，與正常對(duì)照組無明顯差異．在第8、16周僅雌二醇組低于正常對(duì)照組(P<0.05)；骨疏顆粒組與戊酸雌二醇組之間無明顯差異(P>0.05)(見表2).2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液IL-6水平的第4、8、16周比較

第4周骨疏顆粒組明顯低于其他三組(P<0.05)，在第8、16周雌二醇組低于骨疏顆粒組(P<0.05)，均未達(dá)到正常對(duì)照組水平(見表3).

2.4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液TNF-α水平的第4周、8周、16周比較

骨疏顆粒組明顯低于其他三組(P<0.05)(見表4).

表1 各組第16周大鼠血清性激素水平比較

注：各組平均數(shù)間，凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母的即為差異不顯著，凡具不同標(biāo)記字母的即為差異顯著．

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液IL-1β水平的第4周、8周、16周比較

注：各組平均數(shù)間，凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母的即為差異不顯著，凡具不同標(biāo)記字母的即為差異顯著．

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液IL-6水平的第4周、8周、16周比較

注：各組平均數(shù)間，凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母的即為差異不顯著，凡具不同標(biāo)記字母的即為差異顯著．

表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液TNF-α水平的第4周、8周、16周比較

注：各組平均數(shù)間，凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母的即為差異不顯著，凡具不同標(biāo)記字母的即為差異顯著．

2.5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理改變

如圖1所示，骨疏顆粒組的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有明顯的成團(tuán)聚集趨勢(shì)，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨．正常對(duì)照組關(guān)節(jié)滑膜上皮細(xì)胞明顯增生，細(xì)胞漿增多，無炎癥．戊酸雌二醇組關(guān)節(jié)滑膜上皮細(xì)胞增生，粘膜層有少量脂肪，無炎癥．骨疏顆粒組關(guān)節(jié)滑膜上皮細(xì)胞呈明顯增生，無炎癥．對(duì)照組關(guān)節(jié)滑膜上皮細(xì)胞呈單層，粘膜層有多量脂肪，無炎癥．

圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理改變(×20，HE)

2.6 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜及軟骨病理改變

如圖2所示，正常對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有成團(tuán)聚集趨勢(shì)，細(xì)胞肥大，胞核增大，使關(guān)節(jié)面不平滑．戊酸雌二醇組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有成團(tuán)聚集趨勢(shì)，細(xì)胞肥大，胞核增大，使關(guān)節(jié)面不平滑．骨疏組節(jié)軟骨細(xì)胞有成團(tuán)聚集趨勢(shì)，細(xì)胞肥大，胞漿增多，胞核增大，使關(guān)節(jié)面不平滑．對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有成束聚集，軟骨中有鈣鹽沉積灶．

圖2 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理改變(×20，HE)

3 討 論

在OA的多種致病因素中，比較重要的是炎性細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α．炎性因子可導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性反應(yīng)，消耗和破壞軟骨，使骨質(zhì)裸露，引起關(guān)節(jié)失去正常結(jié)構(gòu)及功能[2]．其中IL-1β不僅促進(jìn)透明軟骨型膠原的降解，還促進(jìn)纖維軟骨型膠原的增生，是直接介導(dǎo)軟骨破壞的細(xì)胞因子之一[3]．IL-6主要通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)和滑膜炎癥的加重，軟骨基質(zhì)缺失[4]．TNF-α能使軟骨蛋白多糖降解和合成減少，致關(guān)節(jié)軟骨損害及骨質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)強(qiáng)直[5]．王樂平等[6]認(rèn)為與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病相關(guān)的炎性因子如白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF-α)是引起軟骨分解的主要機(jī)制．

絕經(jīng)期婦女雌激素水平明顯降低，相關(guān)炎癥因子明顯增高，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率升高[1]，雌激素替代療法可以降低炎癥因子水平，降低絕經(jīng)后婦女骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率，改善關(guān)節(jié)炎癥狀[7-8]，但雌激素的副作用使其應(yīng)用受到了限制．骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)辨證屬于“痹癥”的范疇，其病機(jī)主要為婦女絕經(jīng)后腎精不足，脾失健運(yùn)，脈絡(luò)瘀阻．故而絕經(jīng)期婦女骨關(guān)節(jié)炎應(yīng)以補(bǔ)腎健脾、活血化瘀為治法．骨疏顆粒是云南省中醫(yī)醫(yī)老年科院治療絕經(jīng)期婦女的骨關(guān)節(jié)炎驗(yàn)方，主要由狗脊、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、炙黃芪、白術(shù)、熟地、三七、杜仲、陳皮、獨(dú)活等藥物組成的．驗(yàn)方中君藥為狗脊、淫羊藿有益氣力，強(qiáng)志，堅(jiān)筋骨，元陽振作之功；骨碎補(bǔ)、杜仲、熟地為臣藥，補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨，助狗脊、淫羊藿以增強(qiáng)補(bǔ)腎之功；黃芪、白術(shù)、陳皮為佐藥，健脾以養(yǎng)后天并兼有祛痰除濕之功；羌活、獨(dú)活為使藥，養(yǎng)血生精活血，通絡(luò)定痛．在臨床上，骨疏顆粒治療婦女絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松有良好的療效[9-11]，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨疏顆?？缮呷?shì)雌性大鼠雌激素的水平[11]．

本實(shí)驗(yàn)切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢16周后，戊酸雌二醇組和骨疏顆粒組的E2水平接近正常，戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組T、P水平明顯降低．戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組、正常對(duì)照組PRL、LH水平相似．FSH在4組之間無明顯差異．戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組、正常對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組(P<0.05)，骨疏顆粒組大鼠膝關(guān)節(jié)液TNF-α水平明顯低于其他三組．

骨疏顆粒通過升高雌激素水平，降低炎性因子水平，減輕去勢(shì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)，與戊酸雌二醇相比，骨疏顆粒對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用更佳．本實(shí)驗(yàn)另外一個(gè)發(fā)現(xiàn)，骨疏顆粒并未提高睪酮的水平，骨疏顆粒含有狗脊、淫羊藿、骨碎補(bǔ)，在多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究中均提示淫羊藿、狗脊、骨碎補(bǔ)含有黃酮類化合物[12-14]，對(duì)雄性大鼠有升高雄激素的作用[15]，對(duì)骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎具有良好的治療作用，但是本實(shí)驗(yàn)雌性大鼠的睪酮水平降低，提示骨疏顆粒并非通過影響去勢(shì)雌性大鼠體內(nèi)雄激素水平來治療骨關(guān)節(jié)炎．

[1] 呂厚山，孫鐵錚，劉忠厚．骨關(guān)節(jié)炎的診治與研究進(jìn)展[J]．中國骨質(zhì)疏松雜志，2004，10(1)：7-22．

[2] 燕 軍，節(jié)曉光，孟 江．苗藥榮筋湯治療兔KOAIL-1β、TNF-α水平觀測(cè)[J]．中國中醫(yī)骨傷科雜志，2009，17(7)：5-6．

[3] Pelletier J P， DiBattista J A， Roughley P， et al． Cytokines and inflame mation in cartilage degradation[J]． Rheum Dis Clin North Am， 1993， 19 ：545-568．

[4] 張永亮，宓軼群，剛嘉鴻，等．細(xì)胞因子與針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎：實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用[J]．中國組織工程研究，2014，18(24):3906-3911．

[5] Oegema Trhr， Lewis J L， Thompson R C Jr． Role of Acute Main Development of Osteoarthritis[J]． Agents Actions， 1993， 40(3/4)：220．

[6] 王平樂，董秋梅．中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎機(jī)制研究進(jìn)展[J]．貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31(6)：73-76．

[7] 郭欣宇，馬 英，曾 艷，等．絕經(jīng)期骨性關(guān)節(jié)炎患者血漿性激素和細(xì)胞因子水平及其與膝關(guān)節(jié)功能的相關(guān)性[J]．中國全科醫(yī)學(xué)，11(5B)：852-854．

[8] 高 峰，杜 寧．雌激素受體與骨性關(guān)節(jié)炎[J]．醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(1):33-35．

[9] 劉慧萍，陳明輝，李 玲，等．補(bǔ)腎活血方含藥血清對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞ActA/Smads信號(hào)通路的影響[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2016，27(12):2857-2861．

[9] 杜義斌，徐翔峰，彭江云．骨疏顆粒治療老年女性骨質(zhì)疏松癥30例療效觀察[J]．云南中醫(yī)中藥雜志，2006，27(5)：15．

[10] 杜義斌，吳 洋，段艷蕊，等．骨疏顆粒治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥臨床觀察[J]．新中醫(yī)，2013，45(8)：18-21．

[11] 李 冰，杜義斌，李黔云，等．骨疏顆粒對(duì)去卵巢雌性大鼠骨質(zhì)疏松的影響[J]．云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37(4)：9-12．

[12] 蔣 俊，崔 莉，孫 娥，等．基于淫羊藿黃酮類化合物的體內(nèi)代謝闡述其抗骨質(zhì)疏松藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[J]．中草藥，2014，45(5)：721-729．

[13] 楊慧潔，吳 琦，楊世海．金毛狗脊化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(15)：230-234．

[14] 劉玲玲，曲 瑋，梁敬鈺．骨碎補(bǔ)化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]．海峽藥學(xué)，2012，24(1)：4-9．

[15] 鄭 娟，徐思凡，劉慶山．植物藥黃酮類成分對(duì)睪丸功能的影響[J]．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11(3)：39-41．

[責(zé)任編輯 周文凱]

水利與環(huán)境學(xué)院魚類過壩技術(shù)博士生國際學(xué)術(shù)交流會(huì)在我校舉行

2017年4月21日，南安普頓大學(xué)博士生、三峽大學(xué)水利與環(huán)境學(xué)院來華留學(xué)博士生在我校水利與環(huán)境學(xué)院水電樓學(xué)術(shù)報(bào)告廳舉辦了水利與環(huán)境學(xué)院魚類過壩技術(shù)博士生國際學(xué)術(shù)交流會(huì)。就魚類過壩相關(guān)技術(shù)、水環(huán)境與水資源保護(hù)等相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行學(xué)術(shù)研討，包括過魚設(shè)施簡(jiǎn)介及設(shè)計(jì)水力學(xué)要求、魚類游泳與魚道設(shè)計(jì)、過魚設(shè)施效果監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)、河道修復(fù)與環(huán)境保護(hù)、水資源利用與保護(hù)等相關(guān)內(nèi)容。

(轉(zhuǎn)載自三峽大學(xué)校園網(wǎng))

Experimental Study of Effects of Gushu Granules on Osteoarthritis of Ovariectomized Osteoporotic Model Rats

Li Bing Du Yibin

(Yunnan Provincial College of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650021，China)

Objective To investigate the effect of Gushu granules on osteoarthritis ovariectomized osteoporotic model rats. In order to provide experimental basis for clinical application of Gushu granules and further study. 60 SD rats were randomly divided into 4 groups i.e. model group, normal control group, estrogen group and group of Gushu granules. The osteoporosis model was induced by ovariectomy and overexercise. the change of sex hormone and inflammatory factor in rads were observed after the rats were treated with Gushu granules and estradiol valerate. The experimental results show Gushu granules and estradiol valerate could increase the level of sex hormone and reduce inflammatory factor of osteoarthritis model rats(P<0.01 orP<0.05). Significant difference is compared with model group (P<0.05). There is no significant difference between the two(P>0.05). It is concluded that the Gushu granules could treatment and delay osteoarthritis. There is no significant difference with estradiol valerate.

osteoarthritis; Gushu granules; IL-1; IL-6; TNF-α; experimental study

2017-03-21

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(課題號(hào)：2014Z124)；云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(課題號(hào)：2014NS334)

李 冰(1974-)，女，主治醫(yī)師，主要從事老年病的中醫(yī)藥防治研究．E-mail：dybys@126.com

10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2017.03.024

R285.5

A

1672-948X(2017)03-0108-05