吳 航，令小峰

1.青海省中醫(yī)院(西寧810000)，2. 西寧市食品藥品監(jiān)督管理局(西寧810008)

·實(shí)驗(yàn)研究·

不同白毛夏枯草提取物抗肝癌機(jī)制分析

吳 航1，令小峰2

1.青海省中醫(yī)院(西寧810000)，2. 西寧市食品藥品監(jiān)督管理局(西寧810008)

目的：以白毛夏枯草水提取物、乙酸乙酯提取物為例探究不同提取物的抗肝癌機(jī)制。方法：將白毛夏枯草的水提取物(STW)、乙酸乙酯提取物(ZTW)分別作用于肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721。運(yùn)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)不同濃度的STW、ZTW對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721增生的抑制作用，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的STW、ZTW誘導(dǎo)肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡的凋亡率，運(yùn)用一步法熒光RT-PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)經(jīng)不同濃度的STW、ZTW處理后HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中Bax mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果:STW、ZTW對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞均有顯著的抑制增生和誘導(dǎo)其凋亡的作用，同時(shí)能夠抑制肝癌血管增殖。STW、ZTW的抑制機(jī)制呈一定的濃度依賴性，其中以乙酸乙酯提取物ZTW抑制性最強(qiáng)。結(jié)論:白毛夏枯草水提取物、乙酸乙酯提取物均通過抑制肝癌細(xì)胞增生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制肝癌血管增殖，加速肝癌細(xì)胞分化等機(jī)制來抗肝癌。

白毛夏枯草最早載于《本草綱目拾遺》，為雙子葉唇形科草屬植物，有性味苦寒、歸肺肝經(jīng)，專清肝火之效[1]。目前白毛夏枯草及其提取物被廣泛運(yùn)用于現(xiàn)代藥理學(xué)和臨床研究中，近年來國(guó)內(nèi)外相關(guān)專家又提出白毛夏枯草在抗肝癌方面有著顯著地效果[2-3]。本研究旨在探究不同白毛夏枯草提取物對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721增殖的抑制作用，推測(cè)其抗肝癌機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 材 料 白毛夏枯草水提取物和乙酸乙酯提取物、肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721、小牛血清、MTT粉劑、5-FU、青霉素、鏈霉素、PCR試劑盒(以上實(shí)驗(yàn)材料均由本院實(shí)驗(yàn)室采購)。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:將白毛夏枯草在完全干燥狀態(tài)下用水和乙酸乙酯萃取，將萃取出的水提取物(STW)、乙酸乙酯提取物(ZTW)分別置于4℃恒溫箱保存?zhèn)溆?；將肝癌?xì)胞株HepG2和SMMC-7721置于含10 %小牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞備用；根據(jù)萃取試劑的不同將提取物分為STW組和ZTW組，并設(shè)置空白組作為對(duì)照，STW組和ZTW組均設(shè)置4 mg/ml、1 mg/ml、0.25 mg/ml三種濃度。

2.2 用MTT法檢測(cè)STW、ZTW對(duì)肝癌細(xì)胞抑制效果:將肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞植入培養(yǎng)板，培養(yǎng)完畢后加入不同濃度的STW、ZTW，隨后加入10 μl規(guī)格為5 g/L的MTT繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后，加入DMSO溶解，震蕩10 min后用酶聯(lián)免疫儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，并計(jì)算抑制率。

2.3 運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)STW、ZTW對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡率的影響:將濃度為300 μg/ml的STW和ZTW給予對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中，空白組加入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.4 運(yùn)用熒光RT-PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)經(jīng)STW、ZTW處理后HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中Bax mRNA的表達(dá)情況。將兩種肝癌細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)1d，加入濃度為4 mg/ml的STW、ZTW，直至孔中終濃度為2(μg·ml)。停留適當(dāng)時(shí)間(0.5、1、3、6、12 h)后，用PCR試劑盒提取總RNA，并通過合成、擴(kuò)增得到所需的mRNA。

結(jié) 果

1 不同濃度STW對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞增生的抑制作用 STW能顯著抑制肝癌細(xì)胞的增生，并有一定的濃度依賴性。與空白組相比，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度 STW對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用((mg/ml))

2 不同濃度ZTW對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞增生的抑制作用 ZTW同樣能有效抑制肝癌細(xì)胞的增生，呈一定的濃度依賴性。與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度 ZTW對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用(mg/ml)

3 流式細(xì)胞儀對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 濃度為300 μg/ml的STW和ZTW對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞凋亡具有影響，有明顯的誘導(dǎo)作用，與空白組對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

4 STW、ZTW對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中Bax mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)顯示，白毛夏枯草提取物STW、ZTW均能促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721中Bax mRNA的表達(dá)，其中乙酸乙酯提取物ZTW對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中Bax mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用更為明顯，同時(shí)呈現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性，見表4。

表3 流式細(xì)胞儀對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡率檢測(cè)(%)

表4 不同時(shí)間下STW、ZTW對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中Bax mRNA表達(dá)的影響

討 論

白毛夏枯草主要分布于我國(guó)秦嶺以南各省份[4]，《本草綱目拾遺》記載：“葉梗同夏枯草，唯葉上有白毛，性寒、味苦、專清肝火”[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，白毛夏枯草的功效多樣，例如抑菌、抗過敏、抗病毒以及增強(qiáng)免疫系統(tǒng)；其提取物可以止咳祛痰，降血壓、保肝利膽等等。在臨床應(yīng)用中，含白毛夏枯草的復(fù)方藥劑能夠治療慢性骨髓炎、抗肝炎、治療高血壓和慢性支氣管炎等。近年來，國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者對(duì)白毛夏枯草在癌癥領(lǐng)域研究報(bào)道逐漸增多[8-10]。本院通過實(shí)驗(yàn)探究白毛夏枯草的水提取物(STW)、乙酸乙酯提取物(ZTW)、對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721的抑制作用和機(jī)制。相關(guān)研究顯示，白毛夏枯草提取物可通過抑制肝癌細(xì)胞血小板衍生生長(zhǎng)因子的表達(dá)來起到抗肝癌的作用[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)不同濃度STW、ZTW對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721的抑制增生作用，均取得了比較滿意的效果。研究結(jié)果表明：不同白毛夏枯草提取物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721均有較強(qiáng)的抑制作用，并且濃度越高，肝癌細(xì)胞分化越快，對(duì)肝癌細(xì)胞增生的抑制作用越明顯，說明白毛夏枯草提取物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制有一定的濃度依賴性。研究顯示，白毛夏枯草提取物可通過增加肝癌細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[12-13]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用流式細(xì)胞儀對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721凋亡率進(jìn)行檢測(cè)，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)濃度為300μg/ml的白毛夏枯草提取物STW、ZTW對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)其凋亡的作用，細(xì)胞凋亡率都在9%以上，與付曉瑞[14]研究結(jié)果相似。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)STW、ZTW均能促進(jìn)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中的Bax mRNA的表達(dá)，并且時(shí)間越長(zhǎng)，Bax mRNA表達(dá)增加的越多。提示HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中的Bax mRNA的表達(dá)具有一定時(shí)間依賴性，STW、ZTW對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用可能與Bax相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)，與張娜[15]研究結(jié)果類似。西醫(yī)治療癌癥不可避免的存在著各種副作用，而傳統(tǒng)的中醫(yī)藥憑借著合理的價(jià)格和無任何毒副作用，已經(jīng)受到越來越多的專業(yè)人士的重視。中藥白毛夏枯草提取物可以通過抑制肝癌細(xì)胞增生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制肝癌血管增殖，加速肝癌細(xì)胞分化等機(jī)制來抗肝癌。

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(收稿：2017-01-10)

Analysis of mechanism of anti-hepatoma different ajugadecumbens extractive

Wu Hang，Ling Xiaofeng.

Qinghai Hospital of TCM(Xining 810000)

Objective：To mechanism of anti-hepatoma ajugadecumbens water extractive and ethyl acetate extract as an example to explore the different extracts. Methods：The water extract of Herba Ajugae (STW), ethyl acetate extract (ZTW) respectively in HepG2 and SMMC-7721 in hepatocellular carcinoma cell lines. Using four methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the inhibitory effect of different concentration of STW, ZTW and SMMC-7721 on HepG2 cell proliferation, apoptosis and apoptosis of hepatoma SMMC-7721 cells induced by HepG2 under different concentrations of STW and ZTW were detected by flow cytometry, using one-step fluorescent RT-PCR (Real-time PCR) expression technique for the detection of the different concentrations of STW, ZTW and HepG2 after treatment of SMMC-7721 cells in Bax mRNA. Results ：STW and ZTW could significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 and SMMC-7721 cells, and inhibit the proliferation of hepatoma cells. The inhibitory mechanism of STW and ZTW was concentration dependent, and the inhibitory effect of ZTW was the strongest. Conclusion：Herba Ajugae water extract and ethyl acetate extract by inhibiting proliferation of hepatoma cells, induce cell apoptosis, inhibit vascular proliferation, accelerate cell differentiation mechanisms against liver cancer.

Ajugadecumbens Extractive Mechanism of anti-hepatoma

白毛夏枯草 提取物 抗肝癌機(jī)制

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.06.059