凌彩金，王秋霜，劉淑媚, 羅一帆

(1. 廣東省農業(yè)科學院茶葉研究所，廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣州 510640； 2. 華南師范大學化學與環(huán)境學院，廣州 510006)

英紅九號紅茶HPLC指紋圖譜的建立與分析

凌彩金1，王秋霜1，劉淑媚1, 羅一帆2*

(1. 廣東省農業(yè)科學院茶葉研究所，廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣州 510640； 2. 華南師范大學化學與環(huán)境學院，廣州 510006)

采用高效液相色譜法(HPLC)對大葉種紅茶英紅九號的春、夏、秋三季茶的相對保留時間、相對峰面積、共有峰進行了分析. 結果表明，HPLC色譜法具有良好的精密度，各樣品色譜峰的相對保留時間穩(wěn)定，可作為指紋圖譜的相對時間，確定了7個共有峰. 以各色譜峰的峰面積為因子，用相關系數(shù)、聚類分析等方法構建了數(shù)字化的英紅九號紅茶HPLC指紋圖譜. 該方法在區(qū)分不同季節(jié)生產的英紅九號紅茶以及分析英紅九號紅茶與其他品種紅茶的差異性等方面提供可能.

英紅九號； HPLC； 指紋圖譜； 相關系數(shù)； 聚類分析

以“感官審評”茶葉，不可避免地使結果出現(xiàn)偏差[1-3]. 目前，茶葉品質分析引入指紋圖譜技術是將茶葉樣品經過前處理后，利用色譜、光譜或質譜等檢測手段標示茶葉特征的譜圖技術[4]；在此基礎上運用相似度分析、聚類分析等處理技術分析圖譜，得到茶葉樣本的共性和特性，以及與其他茶葉的差異性[5]，從而對茶葉品質做出量化評價. 高效液相色譜法(HPLC)具有分離效能高、分析速度快、重現(xiàn)性好、適用范圍廣等優(yōu)點，對于揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、相對分子質量大的高分子化合物以及離子型化合物的分離尤為適用，非常適合構建茶葉指紋圖譜[6]. 目前，對茶葉指紋圖譜的研究主要利用高效液相色譜法[7-8]、氣質聯(lián)用法[9-10]等構建茶葉化學品質、香氣品質的指紋圖譜，通過該方法對不同等級茶葉品質及真實性進行鑒別[11-13].

英紅九號是1961年從云南大葉有性群體品種中單株分離、經30多年系統(tǒng)育種培育而成的無性系大葉紅茶品種[1]. 屬早芽喬木大葉種，樹姿直立，頂端優(yōu)勢強，產量高；制成的紅茶品質優(yōu)異，色澤烏黑紅潤，湯色紅艷明亮，香氣高銳，滋味濃醇. 本文應用HPLC技術對春、夏、秋三季英紅九號紅茶(產自英德坑口咀茶葉生產基地)進行測定，對所得HPLC色譜圖中的相對保留時間、相對峰面積、共有峰進行了分析；并以各色譜峰的峰面積為因子，用相關系數(shù)、聚類分析等方法構建數(shù)字化的英紅九號紅茶HPLC指紋圖譜，在區(qū)分英紅九號紅茶與其他品種紅茶、對不同季節(jié)英紅九號紅茶進行分類方面具有可行性.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

春、夏、秋三季英紅九號紅茶均由廣東省農業(yè)科學院茶葉研究所提供(共22個)，另有來自其他企業(yè)的7個紅茶(23-29號)作為對照樣品(表1).

表1 實驗樣品一覽表Table 1 List of samples

1.2 實驗試劑和儀器

乙腈、甲醇、乙酸為色譜純；標準品兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、沒食子兒茶素(GC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表沒食子兒茶素表沒食子酸酯(EGCG)、咖啡因(CAF)等均購于美國Sigma公司. 實驗所用水為超純水.

實驗儀器：高效液相色譜儀(安捷倫1200,美國安捷倫科技公司)；分析天平(AE200型,上海梅特勒-托利多儀器公司)；電熱恒溫水浴鍋(HWS-26型,上海一恒科技儀器有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 茶樣制備 稱取經粉碎過篩的樣品1.000 g(精確至0.001 g)，放入250 mL錐形瓶中，加入90 mL沸水，浸提45 min，每10 min振蕩1次. 浸提完畢后，趁熱過濾，待茶湯冷卻至室溫后加水定容至100 mL. 定容后的茶湯經0.45 μm水系濾膜過濾，備用. 1.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：用甲醇、乙腈、乙酸、水按不同比例配制；梯度洗脫40 min.

1.3.3 方法精密度 在相同的色譜條件下，同一茶樣連續(xù)進樣5次進行測定，得到茶樣的HPLC色譜圖和各色譜峰的峰面積. 計算所有特征峰的相對保留時間的RSDa(%)和相對峰面積的RSDS(%)[5]. 以29個茶樣各自的CAF峰為參照峰，按照下面2個式子計算各茶樣色譜峰的相對保留時間和相對峰面積：

α=tr/ti，

(1)

式中，α為相對保留時間值，tr為待測峰的絕對保留時間(min)，ti為CAF的絕對保留時間(min)；

S=Sr/Si，

(2)

式中，S為相對峰面積，Sr為待測峰的峰面積，Si為CAF峰的峰面積.

2 結果與分析

2.1 紅茶樣品的HPLC色譜圖

29個紅茶樣品的HPLC色譜(圖1)分析表明，各色譜峰的分離度較好，保留時間穩(wěn)定，峰的重現(xiàn)性良好.

圖1 紅茶樣品的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of black tea samples

茶樣各特征峰的RSDα均小于2.0%，RSDS均小于5.0%，表明所采用的HPLC方法具有良好的精密度，符合檢測方法對精密度的要求，能用于茶樣HPLC指紋圖譜的建立[5].

2.2 相對保留時間

29個茶樣的色譜峰較密集，所以在色譜圖中選擇1個色譜峰作為參考峰，該峰為所有樣品所共有，且位于色譜圖較中心位置、時間相對穩(wěn)定和具有較高的強度，將其作為基準求出所有色譜峰的相對保留時間[14]. 29個茶樣的色譜峰相對保留時間α按出峰順序排列.

2.3 HPLC方法的精密度

取1號茶樣在相同的色譜條件下連續(xù)進樣5次進行測定，得到HPLC色譜圖(圖2). 10 min前出現(xiàn)的色譜峰分別屬于GC(1)、C(2)，10～15 min出現(xiàn)的主要色譜峰屬于CAF(3)；15～20 min出現(xiàn)的色譜峰屬于EGCG(4)、EC(5)；25 min出現(xiàn)的主要色譜峰屬于GCG(6)；30 min出現(xiàn)的主要色譜峰屬于ECG(7).

圖2 樣品1的HPLC色譜圖Figure 2 HPLC chromatogram of sample 1

根據(jù)以往經驗[14]選擇位于色譜圖較中心位置且具有較高強度的咖啡堿(CAF)色譜峰為參照峰，以參照峰的保留時間和峰面積為基準，由式1和式2分別計算所有特征峰的相對保留時間的RSDα和相對峰面積的RSDS(表2).

表2 HPLC方法的精密度Table 2 Precision analysis of the HPLC method %

注：*CAF；峰號1～7所對應的色譜峰見圖2中的標示.

29個茶樣的色譜峰相對保留時間按出峰順序排列(表3). 29個樣品的色譜峰累計有20個；通過計算可知，1～20號色譜峰的相對保留時間在0.38～2.67 min；其RSDα值在0.04%～2.72%之間，表明各樣品色譜峰的相對保留時間穩(wěn)定，可以作為指紋圖譜的相對時間[4]. 研究還發(fā)現(xiàn)，春茶19～22號樣品的2、3、4、6和14號峰集體缺失，說明本研究范圍內這批春茶樣品品質具有一定的共性特征.

2.4 相對峰面積

1號茶樣選擇峰面積Sr為9 387.837的色譜峰(即CAF峰)為參考峰，它的相對峰面積S為1.000，該樣品中第17號峰的峰面積Sr為183.207，其相對峰面積S為183.207/9 387.837=0.020.

表3 紅茶樣品色譜峰的相對保留時間Table 3 Relative peak retention times of black tea samples min

注：“—”表示未檢測到相應的色譜峰.

29個茶樣的色譜峰相對峰面積按出峰順序排列如表4所示. 29個茶樣1～20號色譜峰的相對峰面積的RSDS值在5.35%～64.72%之間，表明各樣品色譜峰的相對峰面積相差較大，即各茶樣組成成分差異較大. 各樣品的色譜峰面積的變化規(guī)律與相對保留時間相同，春茶樣品的部分色譜峰集體消失；大部分秋茶樣品的5號及6號色譜峰缺失，說明不同季節(jié)樣品的內含物質具有一定的相似性.

表4 紅茶樣品的色譜峰相對峰面積Table 4 Relative peak areas of the black tea samples (a.u.)

注：“—”表示未檢測到相應的色譜峰.

2.5 共有峰的確定

不同季節(jié)英紅九號紅茶樣品的共有峰(100%共有)有7個，分別是1、8、10、11、13、15、18號色譜峰，其對應的α值分別為0.381、0.776、1.000、1.132、1.315、1.439、2.317. 這7個色譜峰為英紅九號紅茶的基本組成成分，可作為鑒別英紅九號紅茶的必要條件之一. 另外，2、7、9、20號色譜峰的共有率大于80%，其他色譜峰則比較零散.

3 HPLC指紋圖譜的構建與分析

29個茶樣HPLC色譜圖的色譜峰的相對保留時間穩(wěn)定，但相對峰面積相差較大. 因此，嘗試以色譜峰的峰面積為因子，用相關系數(shù)、聚類分析等方法建立數(shù)字化的英紅九號紅茶HPLC指紋圖譜，并對圖譜進行分析，探討其將英紅九號紅茶與其他品種紅茶進行區(qū)分以及對不同季節(jié)英紅九號紅茶進行歸類的可行性.

3.1 相似度指紋圖譜的構建與分析

為了構建相似度指紋圖譜，以29個茶樣1～20號色譜峰的峰面積為因子，并以1號茶樣為模板，用Excel 2003的數(shù)據(jù)處理功能，計算其他28個茶樣(2～29號)與1號的相關系數(shù)，以判斷不同季節(jié)英紅九號紅茶以及英紅九號紅茶與其他品種紅茶的相似度. 結果見表5.

表5 相關系數(shù)計算結果Table 5 Results of correlation coefficient

從表5看到，其他28個茶樣與1號茶樣的相關系數(shù)在0.995 6～1.000之間. 2號、3號的相關系數(shù)均為0.999 2，與1號的相似度很高，均為英紅九號夏茶. 而8號的相關系數(shù)最小(0.995 6)，說明8號與1號的相似度最低，因為二者分別是英紅九號秋茶和夏茶. 所有英紅九號秋茶(1～18)的相關系數(shù)(平均值0.997 7)較小，與1號的相似度不高，表明夏、秋兩季英紅九號紅茶各成分的含量存在較大差異；英紅九號春茶(19～22)與1號的相似度不高，說明春、夏兩季英紅九號紅茶各成分的含量存在差異. 另外，28和29號樣品的相關系數(shù)較小，與1號的相似度不高，屬于凌云白毫紅茶，說明英紅九號紅茶與其他品種紅茶存在較大差異. 由此看來，茶樣HPLC色譜圖中各色譜峰的峰面積可以作為不同季節(jié)、不同品種紅茶相似度評價的依據(jù). 以29個茶樣1～20號色譜峰的峰面積為因子的相似度分析在一定程度上能將英紅九號紅茶與其他品種紅茶以及不同季節(jié)的英紅九號紅茶區(qū)分出來.

3.2 聚類指紋圖譜的構建與分析

在相似度分析的基礎上，以茶樣HPLC色譜峰的峰面積為變量，用SPSS19.0軟件中的系統(tǒng)聚類分析(歐氏距離結合類間平均鏈鎖法)對29個茶樣進行聚類，以構建聚類指紋圖譜[15]，具體如下：

(1)用標準差標準化方法，對20項指標的原始數(shù)據(jù)進行處理；

(2)采用歐氏距離測度29個區(qū)域單元之間的距離；

(3)選用組平均法，計算類間距離，依據(jù)不同的聚類標準(距離)，對各樣本進行聚類，并作出聚類譜系圖(圖3).

圖3 29個茶葉樣品的系統(tǒng)聚類譜系圖Figure 3 Hierarchical cluster tree of the 29 tea samples

在不同的聚類標準(距離)下，聚類結果不同(圖3)，當距離為0時，每個樣品為單獨的一類；隨著距離標準逐漸放大，29個區(qū)域單位被依次聚類. 當距離為15時，29個區(qū)域被聚為6類，其中英九春茶22、云南滇紅23、24、25、26號樣品聚為一類；英九春季紅茶19、20、21及27號、凌云白毫28、29號聚為一類；英九夏季紅茶1號單獨為一類；英九夏茶2、3號、英九秋茶5、6、11號聚成一類；英九早秋季紅茶4、7、8、9、10、12、13號為一類；英九晚秋季紅茶14、15、16、17、18號樣品聚為一類. 本研究結果表明，英九的春、夏、秋三季紅茶各成分的含量存在較大差異；而同是英紅九號秋茶，其組成成分的含量也存在差異，根據(jù)不同生產時間在同一距離下被聚為三類. 當距離為5時，能準確地區(qū)分英紅九號紅茶與其他品種紅茶. 由此看來，茶樣HPLC色譜圖中各色譜峰的峰面積可作為不同季節(jié)、不同品種紅茶聚類的依據(jù).

4 結論

采用HPLC方法對春、夏、秋三季英紅九號紅茶及其他對照品種紅茶進行測定. 結果表明，所采用的HPLC色譜法具有良好的精密度和準確性. 紅茶樣品1～20號色譜峰的相對保留時間在0.38～2.67 min；其RSD值為0.04%～2.72%，表明各樣品色譜峰的相對保留時間穩(wěn)定，可以作為指紋圖譜的相對時間確定，而各樣品色譜峰的相對峰面積則相差較大，表明各茶樣組成成分的含量差異較大.

不同季節(jié)生產的22個英紅九號紅茶樣品的共有峰(100%共有)有7個，分別是1、8、10、11、13、15、18號色譜峰，其對應的α值分別為0.381、0.776、1.000、1.132、1.315、1.439、2.317. 這7個色譜峰為英紅九號紅茶的基本組成成分，可作為鑒別英紅九號紅茶的必要條件之一. 英紅九號春茶樣品的5個共有峰缺失，說明春茶樣品品質具有一定的共性特征，以此可以作為開展不同季節(jié)英紅九號紅茶品質研究的契機，探討季節(jié)和生態(tài)環(huán)境對茶葉某些品質成分的影響.

通過相似度分析發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)、不同品種紅茶的相似度較低，以29個茶樣1～20號色譜峰的峰面積為因子，一定程度上能將英紅九號紅茶與其他品種紅茶以及不同季節(jié)的英紅九號紅茶區(qū)分出來.

對紅茶樣品的HPLC指紋圖譜結果進行聚類分析. 結果發(fā)現(xiàn)，當距離為15時，聚類指紋圖譜基本上可將春、夏、秋三季英紅九號紅茶進行歸類；當距離為5時，能將英紅九號紅茶與其他品種紅茶區(qū)分開，這從量化角度為審評英紅九號紅茶的品質、區(qū)分茶葉產地、季節(jié)、品種等因素產生的差異奠定了基礎，也為市場上英紅九號紅茶的真?zhèn)舞b別提供了參考.

[1] 石堯清. 紅茶新品種——五嶺紅、英紅九號[J]. 廣東農業(yè)科學,1991(1):17.

[2] 寧井銘,張正竹,方世輝,等. 指紋圖譜技術及其在茶葉品質控制中的應用[J]. 中國茶葉加工,2009(3):39-41. NING J M,ZHANG Z Z,FANG S H,et al. Finger print graphic technology and the application in tea quality control [J]. China Tea Processing,2009(3):39-41.

[3] 金惠淑. 茶葉品質化學和儀器鑒定研究[D]. 杭州:浙江大學,2007.

[4] 劉繼平. 指紋圖譜質控技術對實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的作用和意義[J]. 陜西中醫(yī)學院學報,2006,29(3):61-62.

[5] 高俊. 黃山毛峰茶指紋圖譜的初步研究[D]. 合肥:安徽農業(yè)大學,2008.

[6] 郝志龍,金心怡,江麗萍,等. 化學指紋圖譜在茶葉品質鑒定與控制上的應用[J]. 亞熱帶農業(yè)研究,2009,5(1):60-63.

HAO Z L,JIN X Y,JIANG L P,et al. Application of chemical fingerprint in tea quality identification and control [J]. Subtropical Agriculture Research,2009,5(1):60-63.

[7] 寧井銘,張正竹,谷勛剛,等. 基于高效液相色譜的普洱曬青毛茶指紋圖譜識別方法[J]. 農業(yè)工程學報,2010,26(3):243-248.

NING J M,ZHANG Z Z,GU X G,et al. Fingerprint identification method of Pu’er raw tea based on high performance liquid chromatography profiles [J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering,2010,26(3):243-248.

[8] 何曉葉,李建科,趙偉,等. 化學指紋圖譜技術在茶葉質量控制中的應用[J]. 食品科學技術學報,2015,33(1):49-54.

HE X Y，LI J K，ZHAO W，et al．Application of chemical fingerprint technique in quality control of tea [J]． Journal of Food Science and Technology，2015，33(1):49-54．

[9] 林杰. 茶葉香氣的圖譜分析及在茶葉品質真實性鑒定中的應用[D]. 杭州：浙江大學，2012.

[10]歐陽石光. 茶葉香氣指紋圖譜及特征識別的初步研究[D]. 泰安：山東農業(yè)大學，2011.

[11]劉臣,唐長波,張雷,等. 蘇州洞庭碧螺春茶指紋圖譜及不同等級茶葉品質比較[J]. 江蘇農業(yè)科學,2012,40(12):330-333.

[12]鄒瑤,王紹梅,李建華. 化學指紋圖譜在茶葉中的應用[J]. 福建茶葉,2012(3):2-5.

[13] 范杰文,羅一帆,凌彩金. 茶葉指紋圖譜研究進展[J]. 廣東農業(yè)科學,2013,40(14):228-231.

FAN J W,LUO Y F,LING C J. Research progress of tea finger print [J]. Guangdong Agricultural Sciences,2013,40(14):228-231.

[14] 羅一帆,郭振飛,許旋,等. 廣東嶺頭單樅茶高效液相色譜指紋圖譜的研究[J]. 食品科學,2005,26(4):206-209. LUO Y F,GUO Z F,XU X， et al. Studies on high performance liquid chromatographic finger print of Lingtoudancong Oolong Tea [J]. Food Science,2005,26(4):206-209.

[15] 王建程. 浙江和福建綠茶中微量元素的聚類分析研究[J]. 中國測試,2007,33(3):126-130.

WANG J C. Study on the cluster analysis of elements in green tea from Zhejiang and Fujian by flame atomic absorption spectrometry [J]. China Measurement Technology,2007,33(3):126-130.

【中文責編：譚春林 英文審校：李海航】

Establishment and Analysis of HPLC Fingerprints for Yingde Black Tea NO.9

LING Caijin1, WANG Qiushuang1, LIU Shumei1, LUO Yifan2*

(1. Tea Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tea Plant Resources Innovation &Utilization, Guangzhou 510640, China; 2. School of Chemistry and Environment, South China Normal University, Guangzhou 510006, China)

High performance liquid chromatography (HPLC) was used to measure black tea samples produced from the large-leaf tea cultivar of Yingde black tea NO.9 in spring, summer and autumn. Their HPLC fingerprints including common peaks, their relative retention times and areas were analyzed. The results showed that HPLC method had good precision, the relative retention times of chromatographic peaks were stable, which could be used to make fingerprints. Seven common peaks were determined in all samples. Using the peak area of each chromatographic peak as a factor, digitized HPLC fingerprint of the Yingde black tea NO.9 was established by the correlation coefficient and cluster analysis method. This method is feasible in discriminating the Yingde black tea NO.9 produced in different seasons and the difference between Yingde black tea NO.9 and other black tea varieties.

Yingde black tea NO.9; HPLC; fingerprint; correlation coefficient; cluster analysis

2015-10-19 《華南師范大學學報(自然科學版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

廣東省科技計劃項目(2015B090906027，2015A030401065)；英德市科技計劃項目(英經信字[2014]65號)

O657.7+2

A

1000-5463(2017)03-0037-07

*通訊作者:羅一帆，教授，Email:luoyf2004@126.com.