白 軍，李博文，劉淑紅

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.上海海利生物技術(shù)股份有限公司，上海 201403；3.楊凌金海生物技術(shù)有限公司，陜西楊凌 712100)

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金絲桃苷對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群及血清細(xì)胞因子的影響

白 軍1，李博文2，劉淑紅3

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.上海海利生物技術(shù)股份有限公司，上海 201403；3.楊凌金海生物技術(shù)有限公司，陜西楊凌 712100)

觀察金絲桃苷對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的作用,將Balb/c小鼠隨機(jī)分成5組，空白對(duì)照組(在第1、3、5天腹腔注射生理鹽水)、免疫抑制組(在第1、3、5天腹腔注射環(huán)磷酰胺)、給藥組(在第1、3、5天腹腔注射環(huán)磷酰胺，第1～7天每天以150/300 mg/kg金絲桃苷水溶液灌胃)和陽性對(duì)照組(在第1、3、5天腹腔注射環(huán)磷酰胺，第1～7天每天以0.2 mg/kg黃芪多糖水溶液灌胃)。用ELISA法測定小鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8以及細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α的水平。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，免疫抑制組的CD3、CD4、CD8水平以及血清細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，IL-4、IL-6及IL-10水平顯著升高(P<0.05)。給予金絲桃苷后第8天，與免疫抑制組相比，CD3、CD4、CD8水平以及血清細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α水平極顯著升高(P<0.01)，IL-4、IL-6、IL-10水平極顯著降低(P<0.01)。金絲桃苷能通過提高免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的CD3、CD4、CD8水平以及細(xì)胞因子IFN-γ及TNF-α水平，降低IL-4、IL-6、IL-10水平，來拮抗環(huán)磷酰胺所致的免疫機(jī)能抑制，提高機(jī)體免疫功能。

金絲桃苷；免疫抑制；T淋巴細(xì)胞亞群；血清細(xì)胞因子

金絲桃苷(hyperoside)又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，是一種黃酮醇苷類化合物，廣泛存在于多種植物體內(nèi)，如薔薇科、金絲桃科、桔梗科、唇形科等植物的果實(shí)與全草中。該化合物具有多種功能，不僅可以保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，還具有解痙鎮(zhèn)痛及降血脂作用[1-3]。

目前，對(duì)金絲桃苷的報(bào)道僅限于提取、分離及藥理活性等方面，關(guān)于其對(duì)免疫系統(tǒng)的作用報(bào)道很少。

本試驗(yàn)將金絲桃苷給予免疫力低下的小鼠，通過測定小鼠體內(nèi)血清中的CD3、CD4、CD8、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α水平，來探討金絲桃苷對(duì)免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞亞群及血清細(xì)胞因子的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷能通過提高免疫抑制小鼠血清中的CD3、CD4、CD8、IFN-γ、TNF-α水平，降低IL-4、IL-6、IL-10水平，來拮抗環(huán)磷酰胺所致的免疫機(jī)能抑制，改善機(jī)體免疫功能。本研究將有助于在分子水平闡明免疫調(diào)節(jié)的機(jī)理，具有重要的理論和實(shí)用意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c小鼠，8周齡，體重18 g～22 g，雌雄各半，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 藥物 金絲桃苷提取于貫葉連翹，純度約為95.5%；環(huán)磷酰胺購自上海華聯(lián)制藥有限公司；黃芪多糖購自成都市騰飛動(dòng)物藥業(yè)有限公司，臨用前將金絲桃苷和黃芪多糖溶解于滅菌水，配制成相應(yīng)濃度的溶液。

1.1.3 試劑 小鼠CD3、CD4、CD8、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α ELISA試劑盒，均購自金百生物股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 將Balb/c小鼠隨機(jī)分成5組，每組12只。Ⅰ組為空白對(duì)照組，在第1、3、5天腹腔注射1 mL生理鹽水。Ⅱ組為免疫抑制(模型)組，在第1、3、5天腹腔注射1 mL環(huán)磷酰胺。Ⅲ組為低劑量藥物組，在第1、3、5天腹腔注射1 mL環(huán)磷酰胺，第1～7天每天以150 mg/kg金絲桃苷水溶液灌胃。Ⅳ組為高劑量藥物組，在第1、3、5天腹腔注射1 mL的環(huán)磷酰胺，第1～7天每天以300 mg/kg金絲桃苷水溶液灌胃。Ⅴ組為陽性對(duì)照組，在第1、3、5天腹腔注射1 mL的環(huán)磷酰胺，再于第1天～第7天每天以0.2 mg/kg黃芪多糖水溶液灌胃。給藥后第8天對(duì)所有小鼠進(jìn)行眼靜脈采血，分離血清后置-20℃冰箱保存待用。

1.2.2 ELISA檢測 血清中的T淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8以及細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α的測定嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SAS9.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異顯著性，P<0.01為差異極顯著性為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 金絲桃苷對(duì)免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響

小鼠注射環(huán)磷酰胺后，免疫抑制模型組T淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值與空白對(duì)照組相比較，顯著降低(P<0.05)，說明免疫抑制小鼠造模成功。給予免疫抑制小鼠高低劑量金絲桃苷治療后，小鼠血清中CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值較免疫抑制模型組均有極顯著升高(P<0.01)，表明小鼠免疫功能得以提高，表明在對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的影響方面，金絲桃苷的治療效果優(yōu)于黃芪多糖(表1)。

2.2 金絲桃苷對(duì)免疫抑制小鼠血清細(xì)胞因子的影響

小鼠注射環(huán)磷酰胺后，與空白對(duì)照組相比較，免疫抑制模型組小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10水平顯著升高(P<0.05)，IFN-γ和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，說明免疫抑制小鼠造模成功。給予免疫抑制小鼠高低兩個(gè)劑量金絲桃苷治療后，小鼠血清中IL-4、IL-6和IL-10水平較免疫抑制模型組均有極顯著降低(P<0.01)，三者水平甚至比空白對(duì)照組還低。相比之下，高低劑量的金絲桃苷治療后小鼠血清中IFN-γ和TNF-α水平較免疫抑制模型組均有極顯著升高(P<0.01)。同樣地，金絲桃苷對(duì)FN-γ和TNF-α水平的提高均也存在劑量依賴關(guān)系(表2)。

表1 小鼠血清CD3、CD4、CD8測定結(jié)果(n=12)

注：a表示與空白對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)，A表示與空白對(duì)照組有極顯著差異(P<0.01)；b表示與免疫抑制組有顯著差異(P<0.05)，B表示與免疫抑制組有極顯著差異(P<0.01)。

Note：a stands for significant difference with normal control at 0.05 level,A stands for significant difference with normal control at 0.01 level; b stands for significant difference with normal control at 0.05 level,B stands for significant difference with normal control at 0.01 level.

表2 小鼠血清IL-4、 IL-6、 IL-10、IFN-γ及TNF-α的測定結(jié)果(n=12)

注：a表示與空白對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)，A表示與空白對(duì)照組有極顯著差異(P<0.01)；b表示與免疫抑制組有顯著差異(P<0.05)，B表示與免疫抑制組有極顯著差異(P<0.01)。

Note：a stands for significant difference with normal control at 0.05 level,A stands for significant difference with normal control at 0.01 level; b stands for significant difference with normal control at 0.05 level,B stands for significant difference with normal control at 0.01 level.

3 討論

3.1 金絲桃苷對(duì)免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4及CD8的影響

小鼠注射環(huán)磷酰胺后，血清中CD3、CD4、CD8的水平顯著降低。給予金絲桃苷進(jìn)行治療后，免疫抑制小鼠血清中CD3、CD4、CD8水平極顯著升高。CD3是T細(xì)胞表面的表面標(biāo)志[4]，CD3水平升高意味著成熟T細(xì)胞數(shù)量在增加。CD4是輔助T淋巴細(xì)胞(Th)和效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志，Th通過釋放各種細(xì)胞因子來輔助B淋巴細(xì)胞和效應(yīng)T淋巴細(xì)胞活化，上調(diào)機(jī)體的免疫功能[5]，CD4水平升高也預(yù)示著機(jī)體免疫功能的增強(qiáng)。CD8是細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)和抑制性T細(xì)胞(Ts)的表面標(biāo)志。Ts是通過釋放抑制因子來抑制B淋巴細(xì)胞和效應(yīng)T淋巴細(xì)胞活化，來下調(diào)機(jī)體的免疫功能[6]。理論上，CD8水平應(yīng)該降低，但在本研究中CD8水平反而升高，與理論有矛盾之處，其原因亟待進(jìn)一步研究。CD4與CD8二者相互制約，相互誘導(dǎo)，形成機(jī)體的T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)[7]，二者的比值反應(yīng)了機(jī)體免疫水平的高低，也是機(jī)體疾病嚴(yán)重程度及愈后狀況的重要指標(biāo)之一[8]。若二者比值降低說明機(jī)體處于免疫紊亂狀態(tài)；相反，若二者比值升高，說明機(jī)體免疫功能增強(qiáng)。在本研究中，小鼠處于免疫功能低下時(shí)(免疫抑制)，CD4/CD8二者的比值降低，給予金絲桃苷治療后，CD4/CD8二者的比值升高，表明機(jī)體從免疫損傷中恢復(fù)，免疫功能增強(qiáng)，這與理論相符。

3.2 金絲桃苷對(duì)免疫抑制小鼠IL-4、IL-6及IL-10的影響

小鼠注射環(huán)磷酰胺后，血清中IL-4、IL-6、IL-10水平顯著升高。給予金絲桃苷進(jìn)行治療后，IL-4、IL-6、IL-10水平極顯著降低。IL-4，IL-6，IL-10均由Th2細(xì)胞分泌，主要介導(dǎo)機(jī)體的體液免疫反應(yīng)[9]。IL-4主要作用是增加機(jī)體體液免疫應(yīng)答，抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。本研究中，經(jīng)金絲桃苷治療后，IL-4水平顯著降低，可能是由于機(jī)體內(nèi)的Th1應(yīng)答強(qiáng)于Th2應(yīng)答，導(dǎo)致Th2應(yīng)答被抑制，從而使其分泌IL-4的能力降低。IL-6是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的一種關(guān)鍵成分，在炎癥性疾病中大多都會(huì)增高[10]。本研究中，環(huán)磷酰胺的注射導(dǎo)致小鼠機(jī)體內(nèi)的IL-6水平顯著升高，表明機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，經(jīng)金絲桃苷治療后，IL-6水平之所以顯著降低，也可能是由于Th2應(yīng)答受到抑制，分泌IL-6的量減少所致。IL-10是公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子。本研究中，環(huán)磷酰胺的注射導(dǎo)致小鼠機(jī)體內(nèi)的IL-10水平顯著升高，發(fā)揮其負(fù)性調(diào)節(jié)作用，使得機(jī)體免疫功能下降。經(jīng)金絲桃苷治療后，免疫抑制小鼠體內(nèi)的IL-10水平顯著降低，這可能與IL-4、IL-6水平降低的原因相同，都是由于抑制了Th2應(yīng)答。上述研究結(jié)果與理論一致，Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞存在交互負(fù)反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)機(jī)體Th2應(yīng)答被抑制時(shí)，產(chǎn)生的IL-4、IL-6及IL-10的量減少。

3.3 金絲桃苷對(duì)免疫抑制小鼠IFN-γ及TNF-α的影響

小鼠注射環(huán)磷酰胺后，血清中IFN-γ和TNF-α水平顯著降低。給予金絲桃苷進(jìn)行治療后， IFN-γ和TNF-α水平極顯著升高。IFN-γ被稱為Ⅱ型干擾素，能通過抑制T細(xì)胞及B細(xì)胞的功能起到免疫調(diào)節(jié)作用。腫瘤壞死因子(TNF)是由抗原激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能激活誘導(dǎo)T、B細(xì)胞分化。TNF-α是一種自分泌型的激活因子，也是IL-1、IL-8、GM-CSF等細(xì)胞因子旁分泌的誘導(dǎo)因子。本研究中，給小鼠注射環(huán)磷酰胺后，小鼠機(jī)體內(nèi)的TNF-α水平顯著降低，當(dāng)給予金絲桃苷藥物治療后，TNF-α水平顯著升高，提示，金絲桃苷能夠通過提高免疫抑制小鼠機(jī)體的TNF-α水平來提高機(jī)體免疫功能。

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Effects of Hyperoside on T Cell Subset and Serum Cytokines in Mice

BAI Jun1,LI Bo-wen2,LIU Shu-hong3
(1.YanglingVocationalandTechnicalCollege,Yangling,Shaanxi，712100,China; 2.ShanghaiHileBio-technologyCo,Ltd.,Shanghai,201403,China; 3.YanglingJinhaiBio-technologyCo,Ltd.,Yangling,Shaanxi，712100,China)

To investigate the effects of hyperoside on the immune system of mice,the Balb/c mice were randomly divided into 5 groups:blank control group (intraperitoneal injection of saline on days 1,3 and 5),immunosuppressed group (intraperitoneal injection of cyclophosphamide on days 1,3 and 5),drug group (intraperitoneal injection of cyclophosphamide on days 1,3 and 5; gavage administration of 150/300 mg/kg hyperoside on days 1-7),positive control group (intraperitoneal injection of cyclophosphamide on days 1,3 and 5,gavage administration of 0.2 mg/kg astragalus polysaccharide on days 1-7).Then the levels of T cell subset (CD3,CD4,CD8) and five serum cytokines (IL-4，IL-6，IL-10，IFN-γ，TNF-α) were measured by ELISA.The expressions of CD3,CD4,CD8,IFN-γ,and TNF-α decreased significantly and the levels of IL-4,IL-6 and IL-10 increased significantly compared with blank control group.After treatment with hyperoside,the levels of CD3,CD4,CD8,IFN-γ and TNF-α increased very significantly,while the levels of IL-4,IL-6,and IL-10 reduced very significantly compared with the immunosuppressed group.Hyperoside can improve the immune function by increasing the levels of CD3,CD4,CD8,IFN-γ and TNF-α,and decreasing the levels of IL-4,IL-6 and IL-10 in immunosuppressed mice.

hyperoside; immunosuppression; T cell subset; serum cytokine

2016-11-03

白 軍(1981-)，男，河南駐馬店人，講師，碩士研究生，主要從事養(yǎng)豬及豬病防治教學(xué)及科研工作。

S852.4

A

1007-5038(2017)06-0048-04