顧曉紅

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104）

HPLC考察頭孢克洛顆粒的有關物質(zhì)

顧曉紅

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104）

目的：建立頭孢克洛顆粒中頭孢克洛有關物質(zhì)檢查的方法。方法：采用高效液相色譜法（HPLC），C18色譜柱；以pH 4.0的0.78%磷酸二氫鈉為流動相A，pH 4.0的0.78%磷酸二氫鈉-乙腈（55∶45）為流動相B；檢測波長220 nm；流速1.0 mL/min；線性梯度洗脫。結(jié)果：該方法穩(wěn)定性RSD為0.44%，平均回收率99.1%，相對標準偏差（RSD）為0.52%，8個廠家的8批樣品測定結(jié)果均滿足要求。結(jié)論：該方法專屬性好，靈敏度高，可作為測定頭孢克洛顆粒有關物質(zhì)的方法。

高效液相色譜法；頭孢克洛顆粒；有關物質(zhì)

頭孢克洛是第二代口服廣譜頭孢菌素，臨床用于治療敏感菌所致的呼吸道、泌尿道和皮膚、軟組織感染及中耳炎等[1]。頭孢克洛顆粒在《中華人民共和國藥典》（2015年版）未收載有關物質(zhì)檢查項，主要考慮顆粒的輔料成分比較復雜，對檢查結(jié)果可能會有干擾，但考慮到其在儲存和生產(chǎn)過程中易產(chǎn)生雜質(zhì)，影響安全性和有效性[2]，因此對頭孢克洛顆粒進行有關物質(zhì)考察是有必要的。本次考察主要參照頭孢克洛原料及干混懸劑有關物質(zhì)的測定方法[3-5]，以下是本次考察說明：①《中華人民共和國藥典》（2015年版）二部和《歐洲藥典》（EP9.0）及《美國藥典國家處方集》（USP39-NF34）中頭孢克洛有關物質(zhì)測定方法均采用線性梯度洗脫，前兩者方法相同，均以主要雜質(zhì)對照δ-3異構體考察系統(tǒng)適用性，與后者方法有所差別，《中華人民共和國藥典》（2015年版）二部要求頭孢克洛在23 min左右出峰，USP39-NF34則要求23～29 min，實際出峰時間更接近《中華人民共和國藥典》的規(guī)定，在USP39-NF34規(guī)定范圍內(nèi)；②《中華人民共和國藥典》（2015年版）二部有關物質(zhì)測定方法為自身對照法，本次考察為便于計算采用頭孢克洛對照品的主成分對照外標法；③本次考察擬定的限度參考了《中華人民共和國藥典》（2015年版）二部頭孢克洛干混懸劑有關物質(zhì)檢查的限度。

1 儀器與試劑

采用島津LC-20AD高效液相色譜儀；Mettler XS105電子分析天平；頭孢克洛對照品（含量95.3%，批號：130481-201205）；頭孢克洛δ-3異構體對照品（批號：130494-201204，購自中檢院）；頭孢克洛顆粒：8個企業(yè)（A-H）各選擇一批樣品；輔料：羧甲基淀粉鈉、聚乙烯吡咯烷酮K30、蔗糖、乳化桔子香精，由某企業(yè)提供。乙腈為色譜純；磷酸二氫鈉為分析純。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A為0.78%磷酸二氫鈉（用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0），流動相B為0.78%磷酸二氫鈉（pH 4.0）-乙腈（55∶45），檢測波長220 nm，流速1.0 mL/min，進樣體積20 μL，線性梯度洗脫。見表1。

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液配制

溶劑為0.27%磷酸二氫鈉溶液（pH 2.5）。

2.2.1 對照品溶液 取頭孢克洛對照品25 mg，置50 mL量瓶中，用溶劑溶解制成500 μg/mL的溶液。

取頭孢克洛δ-3-異構體對照品25 mg，置25 mL量瓶中，用溶劑溶解制成1000 μg/mL的溶液。

精密移取上述兩種對照品溶液各5 mL，置100 mL量瓶中，用溶劑制成分別約含25 μg/mL和50 μg/mL的混合溶液。

2.2.2 供試品及自身對照溶液 取樣品適量（約相當于頭孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取1 mL，至100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 空白輔料溶液 取顆?？瞻纵o料適量（相當于頭孢克洛50 mg的顆粒輔料)，置10 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

3 結(jié)果與討論

3.1 專屬性實驗

3.1.1 系統(tǒng)適應性實驗 空白輔料、混合對照和供試品溶液的HPLC色譜圖見圖1。頭孢克洛保留時間24.6 min，頭孢克洛與頭孢克洛δ-3-異構體峰分離度9.7，頭孢克洛峰拖尾因子0.98，理論板數(shù)按頭孢克洛峰計算為89695。已獲得的輔料峰不干擾主峰，同時與雜質(zhì)峰完全分離， 各雜質(zhì)峰與主峰完全分離，本方法系統(tǒng)適應性符合檢測要求。

圖1 空白輔料、混合對照、供試品溶液HPLC圖

3.1.2 破壞實驗 ①酸破壞產(chǎn)物的制備：取A企業(yè)樣品適量（約相當于頭孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸適量浸潤，靜置1 h，用1 mol/L氫氧化鈉中和后加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。②堿破壞產(chǎn)物的制備：取A企業(yè)樣品適量（約相當于頭孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，用1 mol/L氫氧化鈉適量浸潤，立即用1 mol/L鹽酸溶液中和后加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。③氧化破壞產(chǎn)物的制備：取A企業(yè)樣品適量（約相當于頭孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，用30%過氧化氫適量浸潤，靜置1 h，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。④光破壞產(chǎn)物的制備：取A企業(yè)樣品適量（約相當于頭孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，置4500 lx強光下照射5天，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。⑤熱破壞產(chǎn)物的制備：取A企業(yè)樣品適量（約相當于頭孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，105℃烘箱中放置1 h，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

破壞試驗結(jié)果表明，在強酸、強堿中主成分全部降解破壞，氧化后在6.8 min，10.8 min處有較大破壞產(chǎn)物，熱破壞也增加了幾個小的雜質(zhì)峰，光照對峰影響較小。綜上所述，強酸、強堿和強氧化對頭孢克洛顆粒的性質(zhì)影響很大，同時表明本色譜系統(tǒng)破壞產(chǎn)物與主成分峰完全分離。

3.2 精密度試驗

取“2.2.2”項下的供試品溶液，連續(xù)進樣6次，峰面積測得結(jié)果為122915296，122917960，123546606，123836596，124030541，1241345421，RSD為0.44%，結(jié)果表明，本法進樣精密度良好。

3.3 檢出限試驗

取“2.2.1”項下的對照溶液，用溶劑逐級稀釋制成系列濃度進樣檢測，當信噪比為3∶1時，頭孢克洛的最低檢測限度為0.25 ng左右，頭孢克洛δ-3-異構體的最低檢測限度為1 ng左右。

3.4 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液及其自身對照溶液，分別于0，2，4，6，12，24，36 h進樣，記錄色譜圖，主峰峰面積無明顯的降解。結(jié)果表明該溶液在室溫條件下穩(wěn)定性良好，不過為避免溫度影響，USP39-NF34明確規(guī)定，樣品液在室溫條件下應2 h內(nèi)進樣，冰箱保存條件下在20 h內(nèi)應進樣。

3.5 線性試驗

精密稱取頭孢克洛對照品12.5 mg，置50 mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置10 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為頭孢克洛對照品系列濃度溶液。取上述溶液進樣。以峰面積A為縱坐標，濃度C（μg/mL）為橫坐標，進行線性回歸。頭孢克洛在25～75 μg/mL內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關系，線性回歸方程：

A＝31999C＋21142，

相關系數(shù)r＝0.9999。

精密稱取δ-3頭孢克洛對照品20 mg，置20 mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mL，置20 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為δ-3頭孢克洛對照品系列濃度溶液。取上述溶液進樣。以峰面積A為縱坐標，濃度C（μg/mL）為橫坐標，按最小二乘法進行線性回歸。δ-3頭孢克洛濃度在25～150 μg/mL內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關系，線性回歸方程：

A＝35782C＋36433，

相關系數(shù)r＝0.9999。

3.6 準確度試驗

精密稱取A企業(yè)樣品適量（約相當于頭孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，加入δ-3頭孢克洛對照品0.8，1.0，1.2 mL，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過。分析結(jié)果見表1，可見該方法的準確度良好。

3.7 樣品測定

共考察不同廠家的供試品8批，結(jié)果見表2。

表1 有關物質(zhì)回收率結(jié)果（n＝6）

表2 頭孢克洛顆粒有關物質(zhì)檢測結(jié)果

4 結(jié)論

參照《中華人民共和國藥典》（2015年版）二部頭孢克洛干混懸劑有關物質(zhì)檢查項下要求[1]，8批樣品均在限度范圍內(nèi)，即單個雜質(zhì)峰面積均小于對照溶液主成分峰面積的2倍（2.00%），各雜質(zhì)峰面積和均小于對照溶液主成分峰面積的3倍（3.00%），本實驗建立的HPLC方法真實反映了市場上頭孢克洛顆粒的質(zhì)量情況，該方法專屬性好，靈敏度高，可作為檢測頭孢克洛顆粒有關物質(zhì)的方法，對進一步提高頭孢克洛顆粒的標準具有積極意義，更保證了藥品使用的安全性和有效性。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版）二部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:258-261.

[2]劉海濤,張寒,王俊秋,等.北京地區(qū)市售頭孢克洛膠囊質(zhì)量評價[J].首都醫(yī)藥,2011,18(12):48-49.

[3]李薔薇,李強,鄧俊豐,等．HPLC法測定頭孢克洛原料中雜質(zhì)C的研究[J].中國抗生素雜志,2015,40(8):599-602.

[4]向世英,林波,梁振益.頭孢克洛干混懸劑中有關物質(zhì)的研究[J].化學分析計量,2009,18(1):44-47.

[5]傅小英,鄭悅,田增光,等.頭孢克洛膠囊有關物質(zhì)考察[J].解放軍藥學學報,2013,29(3):244-246.

本文編輯：張鈺

Determination of Relevant Substances in Cefaclor Granules by HPLC

Gu Xiao-hong

(Suzhou Research Center for Drug Control and Detection, Jiangsu Suzhou 215104, China)

Objective：To establish a method for determination of cefaclor-related substances in cefaclor granules. Methods：HPLC was adopted by using a C18column, serving 0.78% sodium dihydrogen phosphate (pH 4.0) as the mobile phase A and 0.78% sodium dihydrogen phosphate (pH 4.0)-acetonitrile (55∶45) as the mobile phase B. The detection wavelength was 220 nm, while the flow rate was 1.0 mL/min. Linear gradient elution was adopted. Results：The RSD in stability test was 0.44%. The average recovery was 99.1% with a RSD of 0.52%. All the determination results of eight batches of samples from eight manufacturers were satisfied. Conclusion：The method is specific and sensitive, which may be for the determination of cerfaclor-related substances in cefaclor granules.

HPLC; Cefaclor Granules; Related Substances

R917

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.04.009

2017-02-03

顧曉紅，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥品質(zhì)量檢驗。E-mail：callmegxh@126.com