李 芳 曹云鵬

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001)

抗Aβ抗體清除Aβ寡聚體后BV2細胞對SH-SY5Y細胞損傷的影響及機制

李 芳 曹云鵬

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001)

目的 研究抗 Aβ1～42抗體清除Aβ1～42寡聚體后的BV2細胞對SH-SY5Y細胞損傷的影響及機制。方法 2 μmol/L Aβ1～42寡聚體處理BV2細胞為激活組，2 μmol/L Aβ1～42寡聚體處理BV2細胞6 h后加入12 μl抗Aβ1～42抗體清除Aβ1～42為抗體組，對照組加入等量的生理鹽水，各組培養(yǎng)24 h。將各組收集的條件培養(yǎng)液分別處理SH-SY5Y細胞24 h，MTT法檢測神經(jīng)細胞活力。ELISA法檢測BV2細胞上清液腫瘤壞死因子(TNF)-α水平，Western印跡法檢測磷酸化p38 MAPK的表達情況。結(jié)果 抗體組對神經(jīng)細胞的損傷較激活組嚴(yán)重(P<0.01)，抗體組TNF-α的釋放水平與激活組相當(dāng)(P>0.05)，且抗體組中磷酸化p38 MAPK蛋白仍能持續(xù)表達。結(jié)論 抗 Aβ抗體清除Aβ寡聚體后神經(jīng)退行性變依然存在，而這種退行性變可能由p38 MAPK通路激活引起的免疫炎癥介導(dǎo)。

抗 Aβ1～42抗體；阿爾茨海默病；小膠質(zhì)細胞；神經(jīng)退行性變

阿爾茨海默病(AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是造成癡呆最常見原因。目前關(guān)于AD病因的主要假說是淀粉樣蛋白級聯(lián)假說〔1〕，這一理論認為Aβ，尤其是高毒性的低聚形式是促發(fā)疾病發(fā)生的主要原因。最近研究表明,Aβ1～42寡聚體對神經(jīng)元的毒性及誘導(dǎo)膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)最強,且被認為是AD炎癥病理生理發(fā)生發(fā)展的早期始發(fā)因子〔2,3〕。AD免疫治療旨在清除腦內(nèi)Aβ的沉積，從而減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變來改善AD患者癥狀。臨床研究顯示，用抗Aβ抗體清除Aβ后AD患者認知及腦脊液中tau蛋白水平并沒有改善〔4〕。因此,本研究以小鼠BV2小膠質(zhì)細胞及神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)為實驗對象,應(yīng)用抗Aβ1～42抗體清除Aβ1～42寡聚體后預(yù)處理小膠質(zhì)細胞,觀測其條件培養(yǎng)液對SH-SY5Y神經(jīng)細胞的影響,探討抗Aβ抗體清除Aβ后對細胞損傷的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 小鼠BV2小膠質(zhì)細胞(購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細胞庫)，神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y(中科院上海細胞庫)。

1.2 主要試劑和儀器 Aβ1～42粉，二甲基亞砜(DMSO)和四甲基偶氮唑藍(MTT)(Sigma公司)，抗Aβ1～42抗體(Abcam公司)，六氟異丙醇(HFIP)(上海紫一試劑廠)，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(HyClone公司)。Ham.s F-12培養(yǎng)基(BioSource公司)，p38 MAPK,磷酸化p38 MAPK及α-tubulin抗體(Cell Signaling公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒，Western印跡化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(RD公司)。

1.3 Aβ1～42寡聚體的制備 按Klein WL(2002)方法制備Aβ1～42寡聚體，凍干Aβ1～42粉經(jīng)化學(xué)試劑HFIP處理后風(fēng)干,用少量DMSO溶解后,重懸于Ham.s F-12培養(yǎng)基,配成50 μmol/L的母液,4℃孵育24 h備用。

1.4 BV2小膠質(zhì)細胞實驗分組及條件培養(yǎng)液的制備 激活組：向BV2細胞培養(yǎng)液中加入2 μmol/L Aβ1～42寡聚體，抗體組：向BV-2細胞培養(yǎng)液中加入2 μmol/L Aβ1～42寡聚體后6 h再加入12 μl抗Aβ1～42抗體形成抗原抗體復(fù)合物，清除Aβ1～42。對照組：BV2小膠質(zhì)細胞加入等量生理鹽水各組培養(yǎng)24 h后，取上清離心后備用。

1.5 SH-SY5Y細胞處理及MTT測細胞存活率 SH-SY5Y細胞以每孔10×105/ml細胞密度于前夜接種于96孔板中(每孔200 μl),培養(yǎng)過夜后更換上述收集的3組條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl,37℃孵育4 h后，加入DMSO 150 μl并震蕩15 min,于570 nm波長處測定各孔A570值。細胞存活率=(實驗組OD值-調(diào)零OD值)/(對照組OD值-調(diào)零OD值),實驗重復(fù)3次。

1.6 ELISA測定BV2細胞上清液TNF-α ①加樣：向反應(yīng)板相應(yīng)孔依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣本各100 μl；②反應(yīng)板加蓋覆膜，37℃溫育1 h；③洗滌：棄去反應(yīng)板孔內(nèi)液體，用洗滌液充分洗滌3次，用濾紙吸干；④顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl,再加入顯色劑B 50 μl,振蕩混勻，37℃避光顯色10 min；⑤顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl,再加入顯色劑B 50 μl,振蕩混勻，37℃避光顯色10 min；⑥終止：每孔加入終止液50 μl,終止反應(yīng)；⑦測定：加終止液后10 min，以空白孔調(diào)零，450 nm處測量各孔OD值。

1.7 Western 印跡法檢測磷酸化p38 MAPK表達水平 將收集的BV2細胞用細胞裂解緩沖液裂解后，用蛋白定量分析(BCA法)測定細胞蛋白濃度。蛋白加樣量為50 μg,經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜，置膜于5%BSA封閉液中封閉1 h,加入兔抗鼠磷酸化p38 MAPK,總p38 MAPK一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)2 h,化學(xué)發(fā)光顯色。實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 SH-SY5Y細胞存活率檢測結(jié)果 與對照組(100%)相比，激活組和抗體組的細胞存活率明顯下降，分別為(61.65±3.04)%和(13.55±3.04)%，提示Aβ1～42寡聚體誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液可引起神經(jīng)元損傷?？贵w組的神經(jīng)細胞存活率明顯低于激活組(P<0.01)。

2.2 細胞因子TNF-α檢測結(jié)果 激活組〔(263.4±13.38)ng/L〕和抗體組〔(268.6±12.10)ng/L〕均可引起TNF-α的釋放且水平明顯高于對照組〔(124.3±7.43)ng/L,P<0.05〕。激活組和抗體組引起的TNF-α升高水平相當(dāng)，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示加入抗體清除Aβ后由小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)仍然存在。

2.3 磷酸化p38 MAPK蛋白的檢測結(jié)果 Aβ1～42寡聚體可以誘導(dǎo)磷酸化p38 MAPK的表達且作用6 h后達高峰，從而激活p38 MAPK通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。在上述通路激活后加入抗體清除Aβ后，p38 MAPK通路依然持續(xù)激活。見圖1。

圖1 各組作用于小膠質(zhì)細胞磷酸化p38 MAPK蛋白的表達水平

3 討 論

免疫炎癥是AD的一個重要發(fā)病機制，在AD患者腦中可以觀察到炎癥過程的激活和自身免疫反應(yīng)〔5〕。有研究表明，Aβ寡聚體可以激活小膠質(zhì)細胞中的特定信號通路，如p38 MAPK〔6〕，釋放炎癥介質(zhì)如TNF-α從而引起細胞凋亡。本研究利用Aβ寡聚體作用于小膠質(zhì)細胞6 h后p38 MAPK通路激活并達高峰,并且與對照組相比TNF-α水平顯著增高，且其條件培養(yǎng)液作用于神經(jīng)細胞后可引起神經(jīng)細胞顯著損傷。AD的免疫治療旨在清除患者腦內(nèi)的Aβ,從而阻止神經(jīng)退行性變的進展。一些主動和被動免疫方法正在臨床試驗階段〔7～9〕。然而，有臨床研究顯示，用抗Aβ抗體清除Aβ后AD患者的認知及腦脊液中tau蛋白水平并沒有改善，且某些免疫治療甚至可引起腦膜腦炎及血管性水腫等不良反應(yīng)〔8,10〕。本研究利用抗Aβ抗體清除Aβ后，神經(jīng)細胞損傷并沒有減輕反而加重，提示神經(jīng)退行性變依然存在。本實驗證實Aβ激活小膠質(zhì)細胞中的p38 MAPK信號通路啟動神經(jīng)炎癥后清除Aβ，此通路仍持續(xù)激活并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)損傷神經(jīng)細胞，參與神經(jīng)退行性變，提示在Aβ產(chǎn)生之前對其干預(yù)或?qū)π∧z質(zhì)細胞中p38 MAPK信號通路及所釋放的炎癥介質(zhì)進行干預(yù)可能是治療AD的有效方法。

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〔2016-02-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

曹云鵬(1963-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事阿爾茨海默病的發(fā)病與治療研究。

李 芳(1989-)，女，在讀碩士，主要從事阿爾茨海默病的發(fā)病與治療研究。

R742

A

1005-9202(2017)11-2624-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.010