陳紅運，宋全厚，2，*，尹建軍，2，侯玉柱，2，劉秀，2

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；2.國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，北京100027）

有機干擾物對超氧化電位水殺菌效果影響研究

陳紅運1，宋全厚1，2，*，尹建軍1，2，侯玉柱1，2，劉秀1，2

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；2.國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，北京100027）

試驗以牛血清白蛋白（BSA）為有機干擾物質(zhì)，大腸桿菌為滅菌對象，通過懸液定量殺菌試驗和理化分析方法研究有機干擾物質(zhì)對超氧化電位水（NEOW）殺菌效果影響。試驗結果顯示：在不含有機干擾物時，NEOW作用30s，能夠將菌落數(shù)對數(shù)值為7.76的大腸桿菌完全殺滅。用無菌水對NEOW稀釋后，pH和氧化還原電位（ORP）變化不明顯，有效氯濃度（ACC）隨著稀釋度的增加而降低，但稀釋至60%時同樣保持快速殺滅能力。在干擾物作用下，隨著BSA濃度增加，NEOW殺菌效果降低。但NEOW在低濃度BSA的干擾下，可以通過增加殺菌時間或者增加有效氯濃度達到殺菌效果；在高濃度BSA的干擾下，需要對消毒環(huán)境進行預先清洗降低干擾物的量再進行消毒。

有機干擾物；大腸桿菌；超氧化電位水；殺菌效果

氧化電位水具有快速、廣譜殺菌效果以及低殘留、無毒副作用等正越來越多在農(nóng)業(yè)、生活中得到應用[1-7]。然而在實際消毒過程中，消毒對象表面往往含有較多油脂、蛋白質(zhì)以及產(chǎn)品碎片等有機物，有文獻表明這些物質(zhì)會降低氧化電位水的殺菌效果[8-10]。2002年版《消毒技術規(guī)范》[11]以及GB28234-2011《酸性氧化電位水生成器安全與衛(wèi)生標準》[12]規(guī)定在研究消毒劑的殺菌效果時，使用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為有機干擾物，以其濃度的大小作為代表消毒對象的清潔狀況。因此實驗以大腸桿菌為滅菌對象，以牛血清白蛋白為有機干擾物質(zhì)，研究清潔條件（無干擾物）及不同濃度有機干擾物對發(fā)酵院自行研制的超氧化電位水生成裝置制備的電位水殺菌效果的影響，同時研究不同種類物質(zhì)對超氧化電位水理化特性的影響，為其實際應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水乙醇，山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司；氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、硫代硫酸鈉，北京化工廠；營養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨、吐溫80，北京路橋技術有限責任公司；牛血清白蛋白、聚醚砜濾膜（孔徑0.22 μm），北京博奧拓達科技有限公司。

1.2 試驗指示菌

大腸桿菌（CICC10389），購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 儀器與設備

超氧化電位水生成器：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院自行研制；雙路pH/ORP控制器：杭州聯(lián)測自動化技術有限公司；消毒液有效氯檢驗試紙：廣州達元綠洲食品安全科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 NEOW的制備

NEOW生成器在電解電流40A、出水流量500L/h、無隔膜電解槽條件下電解質(zhì)量分數(shù)0.1%的NaCl溶液，制備得到NEOW。用雙路pH/ORP控制器測定其pH值和氧化還原電位（oxidation reduction potential，ORP），用消毒液有效氯檢驗試紙測定其有效氯濃度（available chlorine concentration，ACC）。

1.4.2 0.22 μm的聚醚砜濾膜過濾BSA

由于BSA是一種蛋白質(zhì)，其溶液不能高壓滅菌，實驗采用0.22μm的聚醚砜濾膜對配制的BSA進行過濾，用紫外分光光度法測定過濾后BSA濃度[13]，同時按GB 4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》方法觀察過濾后的樣液是否含有雜菌[14]。

1.4.3 中和劑鑒定試驗

在評價NEOW的殺菌效果時，作用到規(guī)定時間后必須終止殘留NEOW的消毒作用，因此需要選擇適當?shù)闹泻蛣?。試驗選擇中和劑組成為0.8%的硫代硫酸鈉+0.5%的吐溫80的磷酸鹽緩沖液（pH7.2～7.4），鑒定程序按照2002年版《消毒技術規(guī)范》中2.1.1.5.5步驟進行，設計6組，評價標準為第一組無菌生長或少于第二組；第二組菌數(shù)遠小于第三、四、五組；第三、四、五組間菌數(shù)誤差不超過15%；第六組無菌生長。

1.4.4 懸液定量殺菌試驗

將試管斜面保存的大腸桿菌接種到營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，然后用10 mL胰蛋白胨生理鹽水（TPS）洗下菌苔，經(jīng)過10倍稀釋后得到濃度為1×107cfu/mL～9×107cfu/mL的菌懸液。將NEOW與無菌蒸餾水以體積比混合均勻，得到80%、60%、40%的稀釋液，然后參照2002版《消毒技術規(guī)范》2.1.1.7.4對大腸桿菌進行懸液定量殺菌操作。BSA對NEOW影響試驗，是將菌懸液與BSA對倍稀釋后代替原始菌懸液，然后按照上述步驟進行。作用完成后以GB4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》法測定樣液殘留的細菌總數(shù)，然后計算滅菌對數(shù)值（對照組平均活菌濃度的對數(shù)值-試驗組活菌濃度對數(shù)值）。

1.4.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，試驗結果以均值±標準偏差（a±SD）表示，采用組間t檢驗，P< 0.05具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 聚醚砜濾膜對BSA過濾結果

孔徑為 0.22 μm聚醚砜濾膜對 3、5、10 mg/mL BSA過濾結果見表1。

表1 孔徑為0.22 μm聚醚砜濾膜對3、5、10 mg/mL BSA過濾結果Table 1 Results of 3，5，10 mg/mL BSA filtration with a pore size of 0.22 μm PES membrane

由表1可見，孔徑為0.22 μm聚醚砜濾膜對BSA過濾后，其濃度分別從3、5、10 mg/mL，上升為3.27、5.30、11.00 mg/mL，變化不顯著（P＞0.05）且濾液不含雜菌，因此孔徑為0.22 μm聚醚砜濾膜適合對BSA進行過濾。

2.2 中和劑鑒定試驗

中和劑鑒定結果見表2。

表2 中和劑鑒定結果Table 2 The result of verification test for neutralizer

由表2可見，第一組菌落數(shù)遠少于第二組，第三、四、五組組間誤差率為9.25%<15%。因此0.8%的硫代硫酸鈉+0.5%的吐溫80的磷酸鹽緩沖液（pH7.2～7.4）能夠有效中和NEOW原液對大腸桿菌的滅菌作用，并且中和劑、中和產(chǎn)物對大腸桿菌的生長無顯著影響（P>0.05），符合2002年版《消毒技術規(guī)范》要求。

2.3 在清潔條件下，不同稀釋度NEOW對大腸桿菌殺滅效果

用無菌水將NEOW以體積比分別稀釋至80%、60%、40%，然后對不同稀釋度NEOW按照1.4.4懸液定量殺菌步驟進行，理化指標及殺菌效果見表3。

表3 NEOW不同稀釋度理化指標變化及殺菌效果Table 3 Changes of physical and chemical indexes of different dilution degree and germicidal efficacy of NEOW

由表3可知：NEOW在40%稀釋范圍內(nèi)，ORP和pH變化不明顯，ACC隨著稀釋倍數(shù)的增加而降低。NEOW原液在60%稀釋度內(nèi)，作用30 s可將大腸桿菌完全殺滅。稀釋至40%時，盡管NEOW保持高ORP值，但滅菌對數(shù)值僅為1.95，遠低于其他稀釋度殺菌效果；但將NEOW使用量提升至9 mL后，在30 s內(nèi)也能將大腸桿菌完全殺滅（結果沒有顯示）。由此可見，NEOW對大腸桿菌殺滅能力極強，但在低有效氯條件下，僅靠高ORP不能發(fā)揮快速殺菌作用，需要增加電位水的使用量或者提高有效氯濃度達到快速的殺菌效果。

2.4 BSA對NEOW殺菌效果影響

3 mg/mLBSA對不同稀釋度超氧化電位殺菌效果影響見表4。

表4 3 mg/mL BSA對不同稀釋度超氧化電位殺菌效果Table 4 Under 3 mg/mL BSA，germicidal efficacy of different dilution degree of NEOW

由表4可知，在3 mg/mLBSA干擾下，隨著稀釋倍數(shù)的增加，在相同時間內(nèi)滅菌效果逐漸降低，但在相同稀釋度時，隨著時間的延長，殺菌效果增強；NEOW原液作用3 min及80%稀釋范圍內(nèi)作用5 min即可達到殺菌效果。5 mg/mL和10mg/mLBSA對超氧化電位原液殺菌效果影響見表5。

表5 5 mg/mL和10 mg/mLBSA對超氧化電位原液殺菌效果Table 5 Under 5 mg/mL and 10 mg/mL BSA，germicidal efficacy of NEOW

由表5可知，隨著BSA濃度增加，NEOW殺菌效果顯著減低，在5 mg/mLBSA干擾下，NEOW原液作用時間需提高到20 min才能達到殺菌效果，而在10 mg/mL BSA干擾下殺菌效果較差。與表3中不含BSA殺菌效果比較，BSA能夠干擾NEOW的殺菌能力，但在低濃度BSA的干擾下，可以通過增加殺菌時間或者增加有效氯濃度達到殺菌效果。但在高濃度BSA的干擾下，需要對消毒環(huán)境進行預先清洗降低干擾物的量從而達到殺菌效果。

2.5 BSA對NEOW理化指標影響

為研究BSA降低NEOW消毒效果的機理，將無菌BSA和NEOW原液混合，攪拌混勻后測定其pH、ACC、ORP。結果見表6。

表6 BSA對NEOW理化指標影響Table 6 Changes of physical and chemical indexes of NEOW of BSA

由表6可知：在不含菌懸液條件下，其ACC和ORP急劇下降，并且BSA濃度越高，下降越顯著；而pH基本無變化。3 mg/mL BSA時，ACC濃度由50 mg/L下降到20 mg/L，ORP由799 mV下降到472 mV。將BSA提升至10 mg/mL后，ACC僅為5 mg/L，ORP為307 mV。表明BSA能夠與NEOW的有效殺菌成分反應，使ACC和ORP值大幅度下降，導致NEOW殺菌效果顯著降低。

2.6 其他物質(zhì)對NEOW理化指標影響

消毒環(huán)境中往往含有多種雜質(zhì)，可能會改變NEOW的理化特性進而影響消毒效果，因此研究不同物質(zhì)對NEOW的理化指標影響，結果見表7。

表7 不同物質(zhì)對NEOW理化指標影響Table 7 Changes of physical and chemical indexes of NEOW of different substances

由表7可知，蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素類能夠將NEOW的ORP和ACC大幅度降低，進而降低殺菌效果；有機酸、碳水化合物、油脂對ORP和ACC的影響較?。坏V物質(zhì)類中具有還原性的物質(zhì)如硫酸亞鐵能夠將有效氯還原、強氧化物質(zhì)如重鉻酸鉀能夠將有效氯氧化而使ORP、ACC、pH變化較大，而中性的硫酸鎂對理化特性影響較小。不同物質(zhì)對NEOW的理化特性影響不同，因此在實際消毒時，可根據(jù)消毒環(huán)境干擾物的種類及所占比例選擇適宜濃度和使用量的NEOW。

3 結論

曾新平[15]，Eun-JinPark[16]，VicenteM[17]等學者很早對BSA對氧化電位水的殺菌效果進行研究，但其研究只是針對酸性氧化電位水，也沒有進一步研究有機物及各種物質(zhì)對NEOW理化特性影響。本實驗按照2002年版《消毒技術規(guī)范》研究有機物對NEOW殺菌效果影響，試驗結果表明在不含有機干擾物時，發(fā)酵院自行研制的NEOW具有快速滅菌能力。NEOW可以通過增加殺菌時間或者有效氯濃度抵抗低濃度的BSA干擾。但在高濃度BSA的干擾下，需要對消毒環(huán)境進行預先清洗降低干擾物的量從而達到殺菌效果。不同種類物質(zhì)對NEOW的3個關鍵指標pH、ACC、ORP的影響不同，因此可根據(jù)消毒環(huán)境干擾物的種類及所占比例選擇適宜濃度和使用量的NEOW。本研究對超氧化電位水在實際應用時具有指導意義。

[1]曾新平,林黎,張經(jīng)緯,等.酸性氧化電位水對金黃色葡萄球菌的殺滅效果研究[J].中國消毒學雜志,2008,25(4)：355-358

[2]TIAND S,M.E R,Purev U,et al.Modelling of Escherichia coli O157：H7 grow that various storage temperatures on beef treated with electrolyzed oxidizing water[J].Journal of Food Engineering,2009,97：497-503

[3]SETAREH G,OVISSIPOUR M,CAROLYN R,et al.Efficacy of electrolyzed oxidizing water as pretreatment method for reducing Listeria monocytogenes contamination in cold-smoked Atlanticsalmon (Salmosala[J].Food Control,2015,60：401-407

[4]ZENGXinping,YEGuoqing,TANGWenwei,et al.Fungicidal efficiency of electrolyzed oxidizing water on Candida albicans and its biochemical mechanism[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2011,112(1)：86-91

[5]AFARI G,HUNG C,KING H,et al.Reduction of Escherichia coli O157：H7 and Salmonella Typhimurium DT104 on fresh produce using an automated washer with near neutral electrolyzed(NEO)water and ultrasound.Food Control,2015,63(35)：246-254

[6]KE Xiong,LIU Hai-jie,LIN Rong,et al.Differences in fungicidal efficiency against Aspergillus flavus for neutralized and acidicel ectrolyzed oxidizing waters[J].International Journal of Food Microbiology,2009,137：67-75

[7]ZACHARIA A,KAMITAN I,MIWA N,et al.Application of slightly acidic electrolyzed water as a potential non-thermal food sanitizer for decontamination of fresh ready-to-eat vegetables and sprouts[J]. Food Control,2011,22(3)：601-607

[8]王軍,丁甜.電位水在食品殺菌領域的研究進展[J].食品科學, 2011,32(3)：241-248

[9]張學輝,馬軍,鄧樺,等.酸性氧化電位水殺菌效果評價[J].中國消毒學雜志,2012,29(2)：93-97

[10]FANG A,JENNIFE R,LCANNON K,et al.The efficacy of EO waters on inactivating norovirus and hepatitis A virus in th presence of organic matter[J].Food Microbiology,2016,61：13-19

[11]中華人民共和國衛(wèi)生部.消毒技術規(guī)范[Z].北京：中國標準出版社,2002

[12]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 28234-2011酸性氧化電位水生成器安全與衛(wèi)生標準[S].北京：中國標準出版社,2011

[13]田志梅,張永順.紫外分光光度法快速測定液體奶、奶粉中蛋白質(zhì)含量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,18(2)：263-264

[14]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.2-2010食品安全國家標準食品微生物學檢測菌落總數(shù)測定[S].北京：中國標準出版社,2010

[15]曾新平,葉國青,唐文偉,等.酸性氧化電位水對大腸桿菌殺滅效果及其主導因素研究[J].中國消毒學雜志,2011,28(2)：131-135

[16]EUNJIN P,EDWARD A,GARY T,et al.The decontaminative effects of acidic electrolyzed water for Escherichiacoli O157：H7,Salmonella typhimurium,and Listeria monocytogeneson green onions and tomatoes with differing organic demands[J].FoodMicrobiology,2008, 26：386-390

[17]VINCENTE M,GOMEZ L,MARIA I.Cross-contamination of Escherichia coliO157：H7 is inhibited by electrolyzed water combined with salt under dynamic conditions of increasing organic matter[J]. Food Microbiology,2015,46：471-478

Study on the Influence of Organic Interfering Substance on Germicidal Efficacy of Neutral Electrolyzed Oxidizing Water

CHEN Hong-yun1，SONG Quan-hou1，2，*，YIN Jian-jun1，2，HOU Yu-zhu1，2，LIU Xiu1，2
（1.China National Research Institute of Food&Fermentation Industries，Beijing 100027，China；2.National Center for Food Quality Supervision and Testing，Beijing 100027，China）

Bovine serum albumin（BSA）was as organic interfering substances，Escherichia coli was for sterilization object in the laboratory.Suspension quantitative germicidal test and physicochemical analysis method were carried out to observe the influence of organic interfering substance on germicidal efficacy of neutral electrolyzed oxidizing water（NEOW）.The results showed that when without organic interfering substances，the killing logartithm of Escherichia coli exposed to the NEOW for 30 s was 7.76.pH and oxidation reduction potential（ORP）changesd were not obvious after dilution of NEOW.Available chlori-ne concentration（ACC）decreased as dilution，however，the 60%of dilution of NEOW maintained same germicidal efficacy.Germicidal efficacy of NEOW was significantly reduced as the BSA concentration increased.But germicidal efficacy of NEOW could be available by increasing time or ACC at low conce-ntrations of BSA，it need to be cleaned to reduce the amount of organic interfering substances and then disinfected at high concentrations of BSA.

organic interfering substance；Escherichia coli；neutral electrolyzed oxidizing water；germicidal efficacy

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.041

2016-12-01

國家重點研發(fā)計劃生物安全重點專項（2016YFC1201504）作者簡介：陳紅運（1987—），男（漢），碩士研究生，研究方向：超氧化電位水消毒技術的研究與應用。

*通信作者：宋全厚，教授級高級工程師，研究方向：長期從事食品質(zhì)量安全技術研發(fā)管理工作。