黃紅雨，趙虎，金曉艷

（1.昌吉職業(yè)技術學院，新疆昌吉831100；2.昌吉州中醫(yī)醫(yī)院，新疆昌吉831100）

響應面試驗優(yōu)化牛樟芝總三萜提取工藝

黃紅雨1，趙虎2，金曉艷1

（1.昌吉職業(yè)技術學院，新疆昌吉831100；2.昌吉州中醫(yī)醫(yī)院，新疆昌吉831100）

對牛樟芝總三萜提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化研究。采用單因素和響應面法優(yōu)化最佳工藝條件。結果表明，牛樟芝總三萜提取最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度78%、提取時間81 min、料液比1∶20（g/mL），在此條件下，牛樟芝總三萜得率為5.26%。方差分析表明，影響牛樟芝總三萜得率由大到小的因素為乙醇濃度＞提取時間＞料液比。研究結果表明響應面法可用來優(yōu)化牛樟芝總三萜的提取工藝，通過牛樟芝總三萜的提取可為進一步開發(fā)藥食同源類產(chǎn)品提供借鑒作用。

牛樟芝；總三萜；響應面；工藝優(yōu)化

牛樟芝（Antrodia cinnamomea）又被稱作牛樟菇，產(chǎn)于我國臺灣，主要在牛樟樹上，生長海拔較高[1-2]，是一種名貴藥材，藥用部分為子實體，形狀不規(guī)則，具有大量的藥用活性成分[3-4]，其中包括多糖、黃酮類化合物，三萜類化合物，核酸類物質，免疫蛋白等，有專家研究得出，多糖類化合物雖然含量很少[5]，但具有提高機體免疫力、抗腫瘤、抗血栓等功效，核酸類物質能夠抑制血小板凝聚，預防和治療動脈硬化等功效[6-7]。三萜類化合物能夠起到抗氧化作用以及抑制癌細胞的繁殖，還具有降血壓、降血糖等功效[8]，因此，牛樟芝總三萜類化合物具有重要的藥用研究價值，提取牛樟芝總三萜成為目前急需解決的問題。本研究以牛樟芝為原料，利用單因素和響應面試驗優(yōu)化提取牛樟芝總三萜最佳工藝參數(shù)，為開發(fā)利用牛樟芝總三萜類藥食同源產(chǎn)品提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與材料

BOEN型紫外-可見分光光度計：費爾伯恩精密儀器（上海）有限公司；ScienTZ-10N冷凍干燥機：臨安匯發(fā)機械設備有限公司；熊果酸標品（批號100080-200306，質量分數(shù)≥98.5%）：北京華諾信得科技有限公司；牛樟芝：臺灣亞芯生物科技有限公司；乙醇、高氯酸、5%香草醛-冰乙酸：臨沂商城冠林化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛樟芝總三萜提取工藝流程

牛樟芝→清洗→瀝水→烘干→破碎→超微粉碎→乙醇浸提→牛樟芝總三萜

1.2.2 牛樟芝總三萜提取單因素試驗

1.2.2.1 乙醇濃度對牛樟芝總三萜得率的影響

在提取時間80 min、料液比1∶20（g/mL）的條件下，乙醇濃度分別為65%、70%、75%、80%、85%時，以牛樟芝總三萜得率為考核指標，考察乙醇濃度對牛樟芝總三萜得率的影響。

1.2.2.2 提取時間對牛樟芝總三萜得率的影響

在乙醇濃度75%、料液比1∶20（g/mL）的條件下，提取時間分別為70、75、80、85、90 min時，以牛樟芝總三萜得率為考核指標，考察提取時間對牛樟芝總三萜得率的影響。

1.2.2.3 料液比對牛樟芝總三萜得率的影響

在乙醇濃度75%、提取時間80 min的條件下，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）時，以牛樟芝總三萜得率為考核指標，考察料液比對牛樟芝總三萜得率的影響。

1.2.3 牛樟芝總三萜提取工藝響應面試驗

綜合考察單因素試驗結果，以乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）作為因素，以牛樟芝總三萜得率（Y）為考察值，設計三因素三水平的響應面試驗，確定飲料最佳工藝參數(shù)。試驗設計因素水平見表1。

表1 因素與水平Table1 Factors and levels

1.2.4 牛樟芝總三萜檢測[9-10]

1.2.4.1 對照樣的制備

準確量取熊果酸對照樣10.00 mg，使用乙醇定容至100 mL，得到濃度為0.10 mg/mL的熊果酸對照樣液，備用。

1.2.4.2 標準曲線的制作

準確取 0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL熊果酸對照樣液，用水浴法將其干燥后，向其中加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，70℃水浴35 min，立即冰浴10 min，加入5.00 mL冰醋酸，搖勻，直到室溫條件，同時做空白試驗。采用紫外-可見分光光度計于548 nm處測定其吸光度（A）值，以熊果酸質量濃度（X）作為橫坐標，以吸光度A值（Y）作為縱坐標，做出曲線，得標準曲線方程為Y=57.327 X+ 0.002 3，r=0.999 7，表明熊果酸在10 μg～120 μg線性關系良好。

1.2.4.3 待測樣液的制備

準確稱牛樟芝細粉末1 g，使用20 mL 90%乙醇溶液根據(jù)單因素試驗規(guī)定進行浸提，過濾后，將濾液定容為250 mL。再精確量取1 mL于10 mL容量瓶中進行定容，測其吸光度，根據(jù)標準曲線即可得出牛樟芝總三萜得率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理時，各個數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差（x± s）的形式表示，并且通過SPSS 16.0數(shù)據(jù)分析軟件進行分析處理[11]。

2 結果

2.1 牛樟芝總三萜提取單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對牛樟芝總三萜得率的影響

乙醇濃度對牛樟芝總三萜得率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對牛樟芝總三萜得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the total triterpenoid yield of Antrodia cinnamomea

由圖1可得，當乙醇濃度為65%時，牛樟芝總三萜得率最低，當乙醇濃度升高后，牛樟芝總三萜得率逐漸升高，當乙醇濃度達到75%時，牛樟芝總三萜得率最高，為4.52%。繼續(xù)增大乙醇濃度后，牛樟芝總三萜得率幾乎不變，因此選擇乙醇濃度為70%、75%、80%為響應面研究水平。

2.1.2 提取時間對牛樟芝總三萜得率的影響

提取時間對牛樟芝總三萜得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對牛樟芝總三萜得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on total triterpenoid yield of Antrodia cinnamomea

由圖2可得，當提取時間為70 min時，牛樟芝總三萜得率最低，當延長提取時間后，牛樟芝總三萜得率升高，當提取時間為80 min時，牛樟芝總三萜得率最高，為4.50%。繼續(xù)延長提取時間后，牛樟芝總三萜得率幾乎不變，因此選擇提取時間為75、80、85 min為響應面研究水平。

2.1.3 料液比對牛樟芝總三萜得率的影響

料液比對牛樟芝總三萜得率的影響見圖3。

圖3 料液比對牛樟芝總三萜得率的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on total triterpenoid yield of Antrodia cinnamomea

由圖3可知，當料液比為1∶10（g/mL）時，牛樟芝總三萜得率最低，隨著溶劑的增多，牛樟芝總三萜得率先升高后降低，當料液比為1∶20（g/mL）時牛樟芝總三萜得率最高，隨著溶劑的增多后，得率又逐漸下降，因此選擇料液比為1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）為響應面研究水平。

2.2 牛樟芝總三萜提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 牛樟芝總三萜數(shù)學模型的建立與顯著性檢驗

根據(jù)單因素試驗結果，應用響應面軟件進一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)?？疾煲掖紳舛龋ˋ）、提取時間（B）、料液比（C）對牛樟芝總三萜得率（Y）的影響，試驗設計方案及結果見表2。

表2 Box-Benhnken的中心組合試驗設計及結果Table 2 Box-Benhnken the central composite experimental design and results

采用Design-Expert8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗，得到以牛樟芝總三萜得率為目標函數(shù)，關于各條件編碼值的二次回歸方程為：Y=4.89＋0.98A＋0.71B＋0.23C＋0.55AB＋0.065AC－0.37BC－1.48A2－1.17B2－0.78C2。對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗，方差結果見表3，可信度分析結果見表4。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance table for regression model

續(xù)表3 回歸方程方差分析表Continue table 3 Analysis of variance table for regression model

表4 回歸模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the established regression model

由表3、4可知，此模型P值遠小于0.01，能夠得出此模型極顯著，誤差很小，故能夠用此模型代替真實值對牛樟芝總三萜得率做出分析，R2=98.61%，試驗值與理論值相關性高，此模型可靠性高。在回歸模型中，一次項A、B，交互項AB，二次項A2、B2、C2，均極顯著，一次項C，交互項BC，均顯著。方差分析表明，影響牛樟芝總三萜得率由大到小的因素為乙醇濃度>提取時間>料液比。

2.2.2 因素間相互作用響應面分析結果

因素間相互作用響應面分析結果見圖4。

圖4 響應面及等高線圖Fig.4 Response surfaces and contour plots.

響應面圖能夠反映出各個因素之間的相互關系以及相互作用程度[12-13]。通過響應面軟件對數(shù)據(jù)進行分析，可得到圖4。等高線能夠更清晰直觀反映兩因素之間關系。橢圓形表示兩因素之間影響極顯著，圓形表示因素間影響不顯著。乙醇濃度（A）與提取時間（B）為橢圓形，影響極顯著，提取時間（B）與料液比（C）為橢圓形，影響顯著，而乙醇濃度（A）與料液比（C）為圓形，影響不顯著。

2.2.3 優(yōu)化牛樟芝總三萜提取工藝參數(shù)

為確定最佳參數(shù)，對擬合的回歸方程求分別一階偏導數(shù)，并設其為0，得到三元一次方程如下：

求解得：A＝0.533、B＝0.200、C＝0，根據(jù)生產(chǎn)實際的水平，調(diào)整最佳參數(shù)為乙醇濃度為78%、提取時間為81 min、料液比為1∶20（g/mL），在此條件下，根據(jù)三次平行驗證試驗可得，牛樟芝總三萜得率為5.26%。

3 結論

以牛樟芝為原料，利用乙醇浸出法從其中提取牛樟芝總三萜類化合物。根據(jù)單因素和響應面試驗得出，牛樟芝總三萜提取最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度78%、提取時間81 min、料液比1∶20（g/mL），在此條件下，牛樟芝總三萜得率為5.26%。方差分析表明，影響牛樟芝總三萜得率由大到小的因素為乙醇濃度＞提取時間＞料液比。說明響應面法可用來優(yōu)化牛樟芝總三萜的提取工藝，通過牛樟芝總三萜的提取可為牛樟芝總三萜提供參考，為進一步開發(fā)藥食同源類產(chǎn)品提供借鑒作用。

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Response Surface Test Optimization of Extraction Process of Total Triterpenoids from Antrodia cinnamomea

HUANG Hong-yu1，ZHAO Hu2，JIN Xiao-yan1
（1.Changji Vocational and Technical College，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Changji Chinese Medicine Hospital，Changji 831100，Xinjiang，China）

The extraction parameters of total triterpenoids from Antrodia cinnamomea were optimized.The optimum conditions were optimized by single factor and response surface method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：the concentration of ethanol was 78%，the extraction time was 81min，and the ratio of material to liquid was 1：20（g/mL）.Under this condition，the total triterpenes yield was 5.26%.The variance analysis showed that the factors influencing the yield of total triterpenes from Antrodia cinnamomea were ethanol concentration＞extraction time＞ratio of material to liquid.The results showed that the response surface method could be used to optimize the extraction process of triterpenoids from Antrodia cinnamomea，and the extraction of triterpenoids from Antrodia cinnamomea could provide a reference for the further development of medicinal and edible homologous products.

Antrodia cinnamomea；totaltriterpenes；response surface；process optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.008

2017-03-14

新疆維吾爾自治區(qū)高等學校科研項目（XJEDU2014S081）

黃紅雨（1976—），女（漢），講師，本科，研究方向：天然藥物及中藥開發(fā)。