趙 欣,易若琨,騫 宇,*

(1.重慶第二師范學(xué)院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶 400067;2.重慶第二師范學(xué)院，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400067;3.重慶第二師范學(xué)院，功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室,重慶 400067;4.重慶第二師范學(xué)院，生物與化學(xué)工程系,重慶 400067)

?

玻璃和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉的乙醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞的體外凋亡誘導(dǎo)效果比較

趙 欣1,2,3,4,易若琨1,2,3,4,騫 宇1,2,3,4,*

(1.重慶第二師范學(xué)院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶 400067;2.重慶第二師范學(xué)院，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400067;3.重慶第二師范學(xué)院，功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室,重慶 400067;4.重慶第二師范學(xué)院，生物與化學(xué)工程系,重慶 400067)

對玻璃和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉的體外結(jié)腸癌抑制效果進(jìn)行了研究。兩種水豆豉乙醇提取物中的染料木素和棉籽糖含量高于原料大豆乙醇提取物(RS),玻璃容器發(fā)酵水豆豉乙醇提取物(GVFS)中的染料木素和棉籽糖含量高于不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉乙醇提取物(SSVFS)。通過對體外培養(yǎng)的HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得出GVFS具有最強(qiáng)的結(jié)腸癌細(xì)胞生長抑制效果,同時(shí)SSVFS對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制效果高于RS。進(jìn)一步的RT-PCR實(shí)驗(yàn)也顯示GVFS、SSVFS和RS均可以上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞的Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達(dá),同時(shí)下調(diào)Bcl-2、Bcl-xL表達(dá),且GVFS的作用強(qiáng)于SSVFS和RS。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GVFS具有最高的染料木素和棉籽糖含量,同時(shí)具有最高的癌細(xì)胞增殖抑制效果和凋亡誘導(dǎo)效果,玻璃容器可以用來發(fā)酵具有高生理活性作用的水豆豉。

水豆豉,容器,結(jié)腸癌,凋亡,表達(dá)

水豆豉(Shuidouchi)是川渝地區(qū)一種釀造調(diào)味食品,可以直接食用,亦可用于烹飪[1]。水豆豉是由大豆發(fā)酵制成的一種營養(yǎng)豐富的豆制品,其生產(chǎn)工藝簡單,除了家庭可直接制作外,企業(yè)也根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化工藝可進(jìn)行快速生產(chǎn)[2]。水豆豉除了口味鮮美,生產(chǎn)簡單等優(yōu)點(diǎn)外,還具有包括抗氧化效果等多種功效[3];同時(shí),我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)還認(rèn)為，水豆豉可緩解風(fēng)熱頭痛、胸悶煩嘔、痰多虛煩的多種病癥[4]。水豆豉中含有豐富的營養(yǎng)成分,包括蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì);同時(shí),水豆豉中還含有大豆低聚糖類物質(zhì),除了大豆原料中的低聚糖,也含有大豆經(jīng)發(fā)酵后新產(chǎn)生的幾種低聚糖,豆豉中的大豆低聚糖類物質(zhì)能提高消化功能,提高機(jī)體免疫力,降低腸道內(nèi)產(chǎn)生的有毒物質(zhì),從而起到預(yù)防腸道腫瘤的效果[5]。大豆中含有豐富大豆異黃酮,研究表明大豆有效提取物中有近35%為大豆異黃酮,大豆中最主要的抗癌成分為大豆異黃酮[6]。經(jīng)過發(fā)酵后，大豆中的大豆異黃酮可轉(zhuǎn)化為具有更好生理活性的活性異黃酮,從而更好地預(yù)防機(jī)體氧化和腫瘤的發(fā)生[7]。李里特研究表明,亞洲人(中國、日本)的乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌的低發(fā)病率與食用大豆制品攝入大量染料木素有直接關(guān)系,染料木素可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管生成,從而起到抑制癌癥的作用[8]。大豆低聚糖中重要的活性成分包括棉籽糖,可抑制致癌物質(zhì)生成的有害酶,起到抗癌作用[9]。大豆發(fā)酵為水豆豉的過程中,蛋白質(zhì)、脂肪、灰分和粗纖維的變化不大,但是風(fēng)味物質(zhì)、大豆異黃酮和大豆低聚糖的含量變化較大,發(fā)酵后的水豆豉含有更多的風(fēng)味物質(zhì)、大豆異黃酮和大豆低聚糖[10],大豆異黃酮和大豆低聚糖變化可能是水豆豉抗癌作用差異的關(guān)鍵活性物質(zhì)。同時(shí),不同的發(fā)酵條件對水豆豉中功效成分的含量都會有一定的影響,影響的因素包括發(fā)酵時(shí)間、浸泡水量、發(fā)酵溫度、后發(fā)酵時(shí)間等[11];功效成分的含量差異也造成不同加工工藝的水豆豉生理活性產(chǎn)生差異,最新的研究還顯示，不同容器對水豆豉的生理活性也有顯著影響[3]。

結(jié)腸癌是一種發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤,結(jié)腸癌發(fā)病與飲食有直接關(guān)系,健康的飲食能夠避免腸炎的發(fā)生,從而避免結(jié)腸炎誘發(fā)結(jié)腸癌[12],臨床數(shù)據(jù)顯示，慢性結(jié)腸炎患者的結(jié)腸癌的發(fā)生率比一般人群高[13]。實(shí)驗(yàn)證明水豆豉有一定體外癌細(xì)胞抑制效果[14],本研究針對水豆豉生產(chǎn)中最常用的玻璃容器和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉的體外癌細(xì)胞誘導(dǎo)作用進(jìn)行初步研究,通過細(xì)胞增殖的測定和癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的變化測定比較玻璃容器和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用,結(jié)合生理活性物質(zhì)大豆低聚糖和大豆異黃酮的含量分析容器對水豆豉生理活性作用的影響,結(jié)果對水豆豉的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)將起到一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆(黃豆) 蘭西縣匯源植物油有限公司;染料木素對照品 上海源葉生物科技有限公司;棉子糖對照品 合肥博美生物科技有限公司;MTT試劑 上海伊卡生物技術(shù)有限公司;RPMI-1640液體培養(yǎng)基 美國Hyclone公司;CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒 德國Becton Dickinson公司;Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTP 和MLV 美國Invitrogen公司;RT-PCR引物Bax、Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 天根生化科技有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純;HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞 中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

Biomate3S紫外可見光分光光度儀、3111二氧化碳培養(yǎng)箱、A200PCR儀、LUX多功能性酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;Tancon2500PCR凝膠成像儀 上海天能科技有限公司;ICEN-24R高速冷凍離心機(jī) 杭州奧盛儀器有限公司;BI-150A生化培養(yǎng)箱 施都凱儀器設(shè)備有限公司;Scientz-10冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水豆豉的發(fā)酵和提取 參照文獻(xiàn)[3]將大豆與蒸餾水按重量比1∶2浸泡12 h,然后在105 ℃下蒸煮大豆60 min。大豆冷卻到36 ℃后均勻放入同容積的開口玻璃容器和不銹鋼容器中在36 ℃的生化培養(yǎng)箱中保溫發(fā)酵72 h。將發(fā)酵好的水豆豉冷凍干燥,然后將凍干后的水豆豉打碎成粉末,加入20倍量的80%乙醇(v/v)提取12 h,重復(fù)提取3次并合并提取液,減壓蒸干溶劑得到水豆豉的乙醇提取物待用[14]。

1.2.2 染料木素計(jì)含量測定 稱取5 mg的染料木素標(biāo)準(zhǔn)品置于25 mL容量瓶中,用80%乙醇(v/v)定容。分別吸取不同量的此溶液用80%乙醇稀釋成濃度分別是1、2、3、4和5 μg/mL的染料木素標(biāo)準(zhǔn)液,在271 nm處測吸光度,通過吸光度和棉籽糖含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將水豆豉乙醇提取物1 g置于100 mL容量瓶中用80%乙醇定容,在271 nm處測定吸光度對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得水豆豉乙醇提取物中大豆異黃酮(以染料木素計(jì))的含量[15]。

1.2.3 棉籽糖含量測定 稱取1 g的棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中,用80%乙醇(v/v)定容。分別吸取不同量的此溶液用80%乙醇稀釋成濃度分別是20、40、60、80和100 mg/mL的棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)液,分別取0.2 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液,加入0.1 mL濃度為50 mg/mL的苯酚溶液,再加入5 mL 的濃硫酸,100 ℃水浴加熱3 min后在490 nm處測定吸光度,通過吸光度和棉籽糖含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將水豆豉乙醇提取物1 g置于10 mL容量瓶中用混合展開劑(v/v/v,乙腈∶冰乙酸∶水=6∶3∶2)定容,取5 μL乙醇提取物溶液在薄層板(110 ℃活化1 h)上進(jìn)行條帶長為3 cm的點(diǎn)樣。將此薄層板放置于層析缸中展開(25 ℃恒溫,6 h),噴上顯色劑(苯胺-二苯胺-磷酸)顯色(85 ℃,15 min)。收集1.5 cm×4.0 cm的棉籽糖的條帶區(qū)域加3 mL的80%乙醇(v/v),超聲提取20 min后在4500 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min,取上清液重復(fù)棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定吸光度值,計(jì)算棉籽糖含量[16]。

1.2.4 MTT法測定癌細(xì)胞增殖 將HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞接種于RPMI1640液體培養(yǎng)液(含10%滅活小牛血清)中,在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng),每2 d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)一周后,用0.05% Trypsin-EDTA消化貼壁癌細(xì)胞,將收集到的癌細(xì)胞按濃度1×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種200 μL含癌細(xì)胞的液體培養(yǎng)基,繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞貼壁后棄去上層液體培養(yǎng)基,然后每孔加入200 μL濃度為2 mg/mL的原料大豆(RS)、玻璃容器發(fā)酵水豆豉(GVFS)和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉(SSVFS)乙醇提取物的液體培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h。最后棄去上層液體培養(yǎng)基后每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的含MTT試劑的液體培養(yǎng)基200 μL培養(yǎng)培養(yǎng)4 h,棄去上層液體培養(yǎng)基后每孔加入200 μL的DMSO后振蕩30 min,570 nm波長下用酶標(biāo)儀測定各孔OD值并按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率公式(%)=[(空白孔OD值-水豆豉乙醇提取物OD值)/空白孔OD值]×100[17]。

1.2.5 RT-PCR法測定癌細(xì)胞凋亡相關(guān)表達(dá) 用10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿按MTT法測定癌細(xì)胞增殖同樣培養(yǎng)HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞并用水豆豉乙醇提取物進(jìn)行處理,培養(yǎng)完成后在4500 r/min下離心分離10 min,除去上層培養(yǎng)液后加入一定量PBS進(jìn)行洗滌,再在4500 r/min下離心分離10 min后用RNAzol提取各組癌細(xì)胞的總RNA,然后將總RNA濃度稀釋到1 μg/μL。在RNA 提取液(2 μL)中按次序分別加入1 μL的OligodT18、RNase、dNTP 、MLV酶和10 μL的5×Buffer,在條件37 ℃ 120 min,99 ℃ 4 min,4 ℃ 3 min合成cDNA。然后以反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增Bax、Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的mRNA表達(dá),同時(shí)以持家基因GAPDH作為內(nèi)參照按同樣同樣條件進(jìn)行擴(kuò)增。最后用含溴化乙錠瓊脂(1%濃度)電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,并用Image 1.44軟件進(jìn)行半定量分析[3]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將三組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值,然后使用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件采用one-way ANOVA方法分析各組數(shù)據(jù)在p<0.05水平上相互是否具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 玻璃和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉中染料木素含量比較

通過標(biāo)準(zhǔn)品吸光度的測定繪制出染料木素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=7.478X+0.141(R2=0.997,Y為染料木素濃度,X為吸光度值)(圖1),對照標(biāo)準(zhǔn)曲線可知未發(fā)酵的大豆(原料大豆)、玻璃容器和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉乙醇提取物中染料木素的濃度分別為0.24、1.21和0.76 mg/g(圖2),大豆原料和不同容器發(fā)酵水豆豉乙醇提取物含有染料木素的含量具有顯著差異(p<0.05)。大豆異黃酮是大豆中重要的生理活性物質(zhì),大豆發(fā)酵食品的發(fā)酵過程可使大豆異黃酮轉(zhuǎn)化成便于人體吸收的游離型大豆異黃酮[18]。染料木素是大豆發(fā)酵食品中重要的游離型大豆異黃酮,研究顯示染料木素對非小細(xì)胞型肺癌A549[19]和人宮頸癌Siha細(xì)胞[20]具有明顯的凋亡誘導(dǎo)效果,是一種具有較強(qiáng)癌細(xì)胞抑制作用的生物活性物質(zhì)。本研究中發(fā)酵水豆豉乙醇提取物中的染料木素含量大大高于未發(fā)酵的RS,且GVFS乙醇提取物中含有的染料木素顯著高于SSVFS乙醇提取物。由此可以推斷玻璃容器有利于水豆豉發(fā)酵過程中產(chǎn)生更多的染料木素,提高水豆豉的生物活性作用。

圖1 染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of genistein

圖2 水豆豉乙醇提取物中染料木素含量Fig.2 Genistein content of Shuidouchi ethanol extracts注:RS,2 mg/mL原料大豆乙醇提取物;GVFS,2 mg/mL玻璃容器發(fā)酵水豆豉乙醇提取物;SSVFS，2 mg/mL不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉乙醇提取物；不同字母表示各組數(shù)據(jù)平均值差異顯著(p<0.05),圖4同。

2.2 玻璃和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉中棉籽糖含量比較

通過標(biāo)準(zhǔn)品吸光度的測定繪制出棉籽糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=82.71X+2.163(R2=0.998,Y為棉籽糖濃度,X為吸光度值)(圖3),對照標(biāo)準(zhǔn)曲線可知未發(fā)酵的大豆(原料大豆)、玻璃容器和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉乙醇提取物中棉籽糖的濃度分別為126.4、202.3和177.6 mg/g(圖4),各組棉籽糖的含量具有顯著差異(p<0.05)。棉籽糖是優(yōu)良的雙歧桿菌增殖因子,具有很強(qiáng)的結(jié)腸保護(hù)作用,同時(shí)具有一定的癌細(xì)胞抑制功效[21]。棉籽糖是大豆低聚糖的重要組成部分,發(fā)酵過程中由于微生物的作用可使大豆發(fā)酵制品中的大豆低聚糖的含量大大提高[22],本研究也得到了相同的結(jié)果,發(fā)酵過程使水豆豉比原料大豆含有更多的棉籽糖,且玻璃容器更有利于棉籽糖的產(chǎn)生,使發(fā)酵的水豆豉具有更多的活性成分。

圖3 棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of raffinose

圖4 水豆豉乙醇提取物中棉籽糖含量Fig.4 Raffinose content of Shuidouchi ethanol extracts

2.3 玻璃和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響比較

由表1可知,相同濃度染料木素、棉籽糖、RS、GVFS和SSVFS乙醇提取物處理HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞后,癌細(xì)胞的OD570值較未處理的癌細(xì)胞顯著下降(p<0.05),染料木素表現(xiàn)出最強(qiáng)對結(jié)腸癌體外增殖抑制效果,GVFS的癌細(xì)胞體外增殖抑制效果僅次于染料木素,顯著高于棉籽糖、SSVFS和RS(p<0.05)。運(yùn)用MTT法可以測定食品對癌細(xì)胞的增長抑制效果,從而判斷食品的生物活性作用,是一種常用的檢測方法[17],本研究也運(yùn)用該方法得出發(fā)酵后的大豆制品(水豆豉)比原料大豆具有更好的結(jié)腸癌增殖抑制效果,玻璃容器發(fā)酵水豆豉(GVFS)比不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉(SSVFS)具有更強(qiáng)的結(jié)腸癌增殖抑制效果,且GVFS提取物的作用低于最主要的活性成分染料木素,高于活性成分棉籽糖,由此也證明水豆豉中的染料木素和棉籽糖均起到很強(qiáng)的抗癌作用。

表1 水豆豉乙醇提取物對HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞的體外增殖抑制效果Table 1 In vitro proliferation inhibitory effects of Shuidouchi ethanol extracts in HT-29 and HCT-116 colon cancer cells

注：同列不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05);表2、表3同。

圖5 水豆豉乙醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞Bax、Bcl-2和Bcl-xL mRNA表達(dá)的作用Fig.5 Effects of Bax,Bcl-2 and Bcl-xL mRNA of Shuidouchi ethanol extracts in colon cancer cells注:A:HT-29細(xì)胞;B:HCT-116細(xì)胞。

2.4 玻璃和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉對結(jié)腸癌細(xì)胞Bcl-2家族mRNA表達(dá)的影響比較

通過RT-PCR分析可知,大豆和水豆豉處理HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞相對未經(jīng)處理的癌細(xì)胞均具有較高的Bax mRNA表達(dá)和較低的Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)(圖5、表2)。并且GVFS組癌細(xì)胞的Bax表達(dá)顯著(p<0.05)強(qiáng)于其他組癌細(xì)胞,同時(shí)GVFS組癌細(xì)胞的Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)則顯著(p<0.05)弱于其他癌細(xì)胞。Bcl-2是一種重要的原癌基因,與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要的聯(lián)系;同時(shí)Bcl-2可抑制癌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,而Bcl-2蛋白家族中的Bcl-xL能起到和Bcl-2一樣的抑制癌細(xì)胞凋亡的作用[15]。Bcl-2家族中另一類促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的基因代表就是Bax,Bcl-2能與Bax形成二聚體,當(dāng)Bax的量高于Bcl-2時(shí),Bax與Bcl-2形成更多的二聚體,抑制Bcl-2作用,從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[23]。本研究的結(jié)果顯示，玻璃容器發(fā)酵水豆豉比不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉更顯著的上調(diào)Bax表達(dá)和下調(diào)Bcl-2、Bcl-xL,從而更好地起到誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用,具有更好的體外抗癌功效。

表2 水豆豉乙醇提取物對HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞Bax、Bcl-2和Bcl-xL mRNA表達(dá)的半定量分析Table 2 Semi-quantitative analysis of Bax,Bcl-2 and Bcl-xL mRNA of Shuidouchi ethanol extracts in HT-29 and HCT-116 colon cancer cells

表3 水豆豉乙醇提取物對HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表達(dá)的半定量分析Table 3 Semi-quantitative analysis of Caspase-3,Caspase-8 and Caspase-9 mRNA of Shuidouchi ethanol extracts in HT-29 and HCT-116 colon cancer cells

圖6 水豆豉乙醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表達(dá)的作用Fig.6 Effects of Caspase-3,Caspase-8 and Caspase-9 mRNA of Shuidouchi ethanol extracts in colon cancer cells 注:A:HT-29細(xì)胞;B:HCT-116細(xì)胞。

2.5 玻璃和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉對結(jié)腸癌細(xì)胞Caspase家族mRNA表達(dá)的影響比較

由圖6和表3可知,相對了未經(jīng)樣品處理的對照組HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞,GVFS最大程度的上調(diào)了Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表達(dá),GVFS組癌細(xì)胞的以上表達(dá)顯著強(qiáng)于SSVFS組和RS組HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞(p<0.05)。Caspase家族基因可以對某些促癌蛋白質(zhì)進(jìn)行切割,促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡,Caspase-9作為凋亡過程中的上游啟動性半胱天冬酶,Caspase-9表達(dá)的加強(qiáng)能加強(qiáng)對下游 Caspase-3半胱天冬酶的刺激,從而使Caspase-3降解細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能蛋白,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[24]。而Caspase-8作為外源性凋亡途徑的執(zhí)行者,能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡,引發(fā)癌細(xì)胞死亡,起到抗癌的作用[25]。水豆豉乙醇提取物表現(xiàn)出上調(diào)癌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表達(dá)的作用,而玻璃容器發(fā)酵的水豆豉起到了更強(qiáng)的上調(diào)作用,具有更好結(jié)腸癌體外抑制作用。

3 結(jié)論

對玻璃容器和不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉的體外結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)玻璃容器發(fā)酵水豆豉的染料木素和棉籽糖含量均高于不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉,兩種水豆豉對HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制效果均大大強(qiáng)于未發(fā)酵的原料大豆,且玻璃容器發(fā)酵水豆豉的癌細(xì)胞生長抑制效果高于不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明玻璃容器發(fā)酵水豆豉能夠上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞的Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達(dá)和下調(diào)Bcl-2、Bcl-xL表達(dá),且效果強(qiáng)于不銹鋼容器發(fā)酵水豆豉。由此可見,在水豆豉的發(fā)酵工藝中,選擇玻璃容器進(jìn)行發(fā)酵可更好地提高水豆豉中的勝利活性成分,起到更好的結(jié)腸癌抑制功效。

[1]趙欣. PBL教學(xué)法在提高水豆豉感官評價(jià)水平上的應(yīng)用[J]. 中國調(diào)味品,2014,39(4):24-27.

[2]趙欣,李貴節(jié). 浸泡水量對水豆豉理化特性的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(22):217-220.

[3]馮霞,趙欣. 不同容器發(fā)酵水豆豉預(yù)防CCl4誘導(dǎo)肝損傷的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2016,37(7):338-342.

[4]趙欣,王強(qiáng). 不同后發(fā)酵時(shí)間的水豆豉理化特性比較研究[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(11):346-349,354.

[5]江和源,呂飛杰,邰建祥. 大豆中生物活性成分及其功能[J]. 大豆科學(xué),2000,19(2):160-164.

[6]史桂玲,馬欣,楊軍,等. 豆制品中大豆異黃酮的含量比較[J]. 華西藥學(xué)雜志,2006,21(3):305-306.

[7]趙欣,騫宇. 發(fā)酵時(shí)間對水豆豉理化特性和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞體外抑制作用的影響[J]. 中國糧油學(xué)報(bào),2015,30(1):27-32.

[8]李里特,王海. 功能性大豆食品[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社,2002.

[9]李疆. 大豆生物活性物質(zhì)的綜合開發(fā)[J]. 糧食與食品工業(yè),2006,13(1):34-38.

[10]趙欣,騫宇. 發(fā)酵時(shí)間對水豆豉理化特性和 MCF-7人乳腺癌細(xì)胞體外抑制作用的影響[J]. 中國糧油學(xué)報(bào),2015,30(1):27-32.

[11]馮霞,趙欣. 不同容器發(fā)酵水豆豉的理化特性比較研究[J]. 中國調(diào)味品,2016,41(1):77-81.

[12]王錫山,衣曉峰. 結(jié)腸癌與飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)[J]. 中國保健食品,2005(9):74.

[13]馬高峰,劉江,張相安. 潰瘍性結(jié)腸炎與大腸癌的關(guān)系[J]. 中國實(shí)用醫(yī)刊,2001,28(2):10-11.

[14]趙欣,李貴節(jié). 發(fā)酵時(shí)間和浸泡水量對水豆豉理化特性和體外抗癌效果的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(23):344-348.

[15]黃蕓,崔力劍,竇玉紅,等. 紫外分光光度法測定大豆中異黃酮的含量[J]. 大豆科學(xué),2007,26(2):273-275.

[16]廖春龍,邱奇琦,印遇龍,等. 薄層色譜-苯酚-硫酸法分析大豆低聚糖中棉籽糖含量[J]. 食品科學(xué),2010,31(16):200-203.

[17]趙欣,王強(qiáng),騫宇,等. 不同濃度苦丁茶對TCA8113人舌鱗癌細(xì)胞的體外抗癌效果[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(4):153-155,163.

[18]劉志勝,李里特,辰巳英三. 大豆異黃酮及其生理功能研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2000(1):78-80.

[19]任彥,陸紅玲,宋永祥,等. 染料木素對非小細(xì)胞型肺癌A549/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J]. 中國免疫學(xué)雜志,2014(5):669-672.

[20 李莉,王薇,廖書杰,等. 染料木素對人宮頸癌Siha細(xì)胞增殖凋亡和周期的影響[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2011,30(9):1147-1150.

[21]段雅婷,田苗,路鋒,等. 棉籽糖藥學(xué)研究現(xiàn)狀[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(13):7175-7176.

[22]劉玉蘭,田原,鮑丹青. 大豆糖蜜發(fā)酵制備功能性大豆低聚糖的研究[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,31(2):1-5.

[24]馮霞,羅敏,趙欣. 蟲茶對癌細(xì)胞生長和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2013,29(8):1898-1905.

[25]韓陽,官大威,侯震寰,等. Caspase-8及其研究進(jìn)展[J]. 中國法醫(yī)學(xué)雜志,2006,21(2):94-96.

Invitroapoptosis inducing effects comparison of ethanol extracts ofglass and stainless steel vessels fermented Shuidouchi in colon cancer cells

ZHAO Xin1,2,3,4,YI Ruo-kun1,2,3,4,QIAN Yu1,2,3,4,*

(1.Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;2.Chongqing Engineering Research Center of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;3.Chongqing Engineering Laboratory for Research and Development of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;4.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

Theinvitrocolon cancer cells inhibitory effects of glass and stainless steel vessels fermented Shuidouchi were determined in this study. Two kinds of Shuidouchi ethanol extracts contained more genistein and raffinose than raw soybean ethanol extract(RS),genistein and raffinose contents of glass vessel fermented Shuidouchi ethanol extract(GVFS)were higher than stainless steel vessels fermented Shuidouchi ethanol extract(SSVFS). GVFS had the strongest colon cancer cells inhibitory effects,and the colon cancer cells inhibitory effects of SSVFS were higher than RS by the experiments ofinvitrocultured HT-29 and HCT-116 colon cancer cells. The results of further RT-PCR experiment also showed that GVFS,SSVFS and RS could raise Bax,Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9 mRNA expressions of colon cancer,and reduce Bcl-2,Bcl-xL expressions,the effects of GVFS were stronger than SSVFS and RS. From the results,GVFS contained highest genistein and raffinose contents,and GVFS had highest cancer cells inhibitory effects and apoptosis inducing effects,glass vessel could be used for high physiological activities Shuidouchi fermentation.

Shuidouchi;vessel;colon cancer;apoptosis;expression

2016-11-28

趙欣(1981-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養(yǎng)和功能性食品，E-mail:zhaoxin@cque.edu.cn。

*通訊作者:騫宇(1976-)，女，博士，副教授，研究方向：食品營養(yǎng)和功能性食品，E-mail:qianyubaby@126.com。

重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目(CXTD201601040)；重慶市工程技術(shù)研究中心建設(shè)項(xiàng)目(cstc2015yfpt_gcjsyjzx0027)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)10-0345-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.058