張立華,李 妍,張 沛,陳 青,王 歡

(棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東棗莊 277160)

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干燥方式對(duì)核桃青皮胡桃醌含量與抑菌性能的影響

張立華,李 妍,張 沛,陳 青,王 歡

(棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東棗莊 277160)

為考察核桃青皮抑菌活性與干燥方式的關(guān)系,以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和石榴干腐病菌為供試菌,評(píng)價(jià)了自然干燥(P1)、烘干(P2)及真空冷凍干燥(P3)核桃青皮的抑菌活性。結(jié)果顯示,3種樣品對(duì)3種供試菌均有較強(qiáng)的抑制作用,并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng),即M1>M2>M3(M1,M2,M3濃度分別為100、80和60 mg/mL的核桃青皮萃取液),3種干燥方式間比較均表現(xiàn)為P3>P2>P1;P1、P2和P3對(duì)大腸桿菌和石榴干腐病菌的最小抑菌濃度(MIC)結(jié)果一致,分別為20、15和10 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC分別是15、10 和5 mg/mL;P1、P2和P3樣品中胡桃醌的含量分別是8.04、9.46和11.84 mg/g,與其抑菌活性呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)。表明干燥方式會(huì)影響核桃青皮中胡桃醌含量及抑菌活性,其中真空冷凍干燥是一種理想的干燥方式。

核桃青皮,干燥方式,胡桃醌,抑菌活性

核桃(JuglansregiaLinn.),又名核桃楸、胡桃,是一種傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)樹(shù)種,在我國(guó)栽培歷史悠久、分布廣泛,全國(guó)24個(gè)省(區(qū))都有栽培和分布,其面積和產(chǎn)量均居世界首位[1]。核桃的青果皮,中藥稱青龍衣,用于治療泄瀉、痢疾、白帶、目赤及胃炎等癥,外用于疥癬、疣等皮膚病[2-4],在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域還可以用作環(huán)境友好型農(nóng)藥[5-6]。大量研究表明，核桃青皮含有酚酸、萘醌及其苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、二芳基庚烷類(lèi)、甾體等多種活性物質(zhì)[7-9],而其中的醌類(lèi)物質(zhì)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的更多關(guān)注。林君陽(yáng)等[10]從山核桃外果皮分離鑒定出5-羥基-2-甲氧基-1,4-萘醌,該物質(zhì)對(duì)番茄灰霉病菌和小麥赤霉病的孢子萌發(fā)均有一定抑制作用,在供試濃度為0.5 g/L時(shí),對(duì)2種供試菌孢子萌發(fā)抑制率均超過(guò)70%。許紹惠等[11]從核桃楸(Mandshuricamaxim)的新鮮根皮、枝皮和青果皮中分離出抑菌活性成分—3′3-雙胡桃醌和3,6′-雙胡桃醌。還有研究表明胡桃醌對(duì)紅蜘蛛及蚜蟲(chóng)也有毒殺作用[12]。此外,胡桃醌還具有一定的抗腫瘤作用[13-14]。為便于提取核桃青皮中的胡桃醌,多將原料進(jìn)行烘干處理,但這些醌類(lèi)物質(zhì)穩(wěn)定性差,易受高溫、光照等因素影響而被降解[15],季宇彬等[16]發(fā)現(xiàn)核桃青皮中胡桃醌的含量60 ℃烘干處理顯著低于陰干或40 ℃烘干的樣品。因此,對(duì)核桃青皮的干燥處理方式可能會(huì)對(duì)其中的活性成分及抑菌活性產(chǎn)生影響,但目前鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文即探究不同干燥方式對(duì)核桃青皮中胡桃醌含量及抑菌活性的影響,為更高效利用核桃青皮資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃 為棗莊市山亭區(qū)店子鎮(zhèn)產(chǎn)青皮核桃,剝?nèi)『颂仪嗥溆?供試菌種 大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、石榴干腐病菌(ZythiaversonianaSacc.)Zy06,來(lái)源于棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸銅、無(wú)水甲醇等 國(guó)產(chǎn)分析純,胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%) 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

UV/VIS-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司;SPX-300B型生化培養(yǎng)箱 廣州市海輝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;YXQ-LS-100Sò型立式壓力蒸汽滅菌器 廣州東南科儀有限公司;AIR TECH型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司制造;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;TOFFLON真空冷凍干燥機(jī) 上海東富龍科技股份有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱 精宏XMTD-8222;離心機(jī) 飛鴿ANKE TDL-40B。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品干燥處理 剝?nèi)〉男迈r核桃青皮采取不同方式干燥處理,自然干燥:放在室外晾曬3～5 d,令其自然干燥,含水率為2.87%,該處理標(biāo)記為樣品P1;熱風(fēng)干燥:在105 ℃下快速殺青5 min,然后在65 ℃下烘干,含水率為2.32%,該處理標(biāo)記為樣品P2;冷凍干燥:冷凍室壓力10 Pa,溫度-45 ℃,含水率為2.58%,該處理樣品標(biāo)記為P3。充分干燥后使用粉碎機(jī)將樣品粉碎并過(guò)40目篩,備用。

1.2.2 核桃青皮萃取液的制取 各稱取P1、P2和P3樣品粉末10.00 g加入150 mL 95%乙醇溶液,65 ℃下回流提取2 h[17],過(guò)濾,濾液減壓濃縮,最后用水定容至50 mL,相當(dāng)生藥含量為200 mg/mL,作為實(shí)驗(yàn)?zāi)敢?。各取母?0 mL,用蒸餾水稀釋至生藥含量為100、80和60 mg/mL,并依次標(biāo)記為M1、M2和M3,用于抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 樣品中胡桃醌含量測(cè)定 采用分光光度法測(cè)定3種樣品中胡桃醌的含量[18],分別取1.2.2中制取的母液1.0 mL加入無(wú)水甲醇定容至25 mL萃取,經(jīng)4000 r·min-1離心10 min,取上清液在426 nm下測(cè)定其吸光值。以胡桃醌為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算各樣品中胡桃醌的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:稱取胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品溶解于甲醇中,配制成質(zhì)量濃度分別為0.6、1.2、2.4、4.8 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在426 nm下測(cè)定其吸光值,以吸光度值對(duì)樣品質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌實(shí)驗(yàn) 采用平皿打孔法[19]測(cè)定核桃青皮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性。分別將配制好并已滅菌的各固體培養(yǎng)基熔化倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿(規(guī)格9 cm)中,每皿15 mL,冷卻凝固后,用移液槍取0.1 mL充分混合的107～109cfu/mL供試菌懸液于培養(yǎng)皿中,用涂布棒均勻涂開(kāi)。用口徑5 mm的無(wú)菌打孔器在平板上等距離打孔,每皿5孔,并在不同孔中加入50 μL 3種處理樣品(P1、P2和P3)不同稀釋倍數(shù)的提取液(M1、M2和M3)和對(duì)照樣液,做好標(biāo)記,放入培養(yǎng)箱中,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。5 mg/mL的克林霉素作為陽(yáng)性對(duì)照,無(wú)菌水作為空白對(duì)照。用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑,結(jié)果取三次重復(fù)的平均值。抑菌能力的強(qiáng)弱用抑菌圈直徑或抑菌率表示。抑菌率的計(jì)算公式見(jiàn)式(1)。

抑菌率(%)=(實(shí)驗(yàn)組抑菌圈直徑-空白對(duì)照抑菌圈直徑)/實(shí)驗(yàn)組抑菌圈直徑×100

式(1)

1.2.4.2 石榴干腐病菌抑菌實(shí)驗(yàn) 采用菌絲生長(zhǎng)速率抑制法[20]測(cè)定核桃青皮對(duì)石榴干腐病菌的抑菌活性。將PDA培養(yǎng)基熔化冷卻至50 ℃倒入培養(yǎng)皿(規(guī)格為6 cm),每皿9 mL,冷卻凝固后,用移液槍取50 μL 3種處理樣品(P1、P2和P3)不同稀釋倍數(shù)的提取液(M1、M2和M3)和對(duì)照樣液于不同的培養(yǎng)皿中,用涂布棒均勻涂開(kāi)。用滅菌打孔器取直徑5 mm的圓形菌片,移到涂有樣液的平板上,做好標(biāo)記,每個(gè)處理重復(fù)3次,將各皿放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,測(cè)量其菌落直徑,抑菌率的計(jì)算公式見(jiàn)式(2)。

抑菌率(%)=(空白對(duì)照組菌落直徑-實(shí)驗(yàn)組菌落直徑)/空白對(duì)照組菌落直徑

式(2)

1.2.4.3 最小抑菌濃度測(cè)定 將3種樣品的母液用10%吐溫-80稀釋至生藥含量25、50、75、100、125和150 mg/mL 6個(gè)梯度,然后吸取2 mL加入8 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中,充分振蕩混勻,倒平板,使培養(yǎng)基中核桃青皮最終生藥含量5、10、15、20、25和30 mg/mL。待培養(yǎng)基冷卻后,用預(yù)先培養(yǎng)好的菌懸液劃線接種,分別按前述條件培養(yǎng),每一濃度均做3組平行實(shí)驗(yàn)。觀察結(jié)果,從無(wú)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿中找出最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)的培養(yǎng)皿,即為提取液的最小抑菌濃度(MIC)。以10%吐溫-80作為對(duì)照[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)以上重復(fù),數(shù)據(jù)為多個(gè)重復(fù)的平均值,使用Excel軟件做各處理樣品(P1、P2、P3)、各稀釋倍數(shù)(M1、M2、M3)的差異顯著性及相關(guān)性分析，M1、M2、M3于表中標(biāo)注，P1、P2、P3未標(biāo)注。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式的核桃青皮對(duì)大腸桿菌的抑制效果

各樣品對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑和抑菌率見(jiàn)表1。不同干燥方式的核桃青皮對(duì)大腸桿菌的抑制作用有差別,P3的抑菌圈直徑和抑菌率大于相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的P2,P2又大于P1,且差異明顯(p<0.05),表明干燥方式對(duì)核桃青皮的抑菌活性有明顯影響。同一處理的核桃青皮隨用量的減少,其抑菌圈直徑和抑菌率減小,即M1>M2>M3,且差異顯著(p<0.05)。其中P1的抑菌活性M1略低于5 mg/mL的克林霉素,而P2和P3均高于陽(yáng)性對(duì)照,表明核桃青皮有較強(qiáng)的抑制大腸桿菌作用,并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。醌類(lèi)物質(zhì)由于不飽和鍵的存在穩(wěn)定性差,易受高溫、光照等因素影響而降解,P1為自然晾曬干燥,處理時(shí)間較長(zhǎng),核桃青皮中的有效成分被氧化分解較多,從而使其抑菌活性降低;P2為熱風(fēng)干燥,加熱處理時(shí)間相對(duì)較短,有效成分的損失相對(duì)較少;而P3為真空低溫條件下冷凍干燥,有效成分的損失最少,因此抑菌活性最強(qiáng)。

表1 不同干燥方式的核桃青皮對(duì)大腸桿菌的抑制效果Table 1 Antibacterial effect of different drying on E. coli

表2 不同干燥的核桃青皮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果Table 2 Antibacterial effect of different drying on Staphylococcus aureus

表3 不同干燥方式的核桃青皮對(duì)石榴干腐病菌的抑制效果Table 3 Antibacterial effect of different drying on Zythia versoniana Sacc.

2.2 不同干燥方式的核桃青皮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果

各樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑和抑菌率見(jiàn)表2。不同干燥方式的核桃青皮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用有差別,P3的抑菌圈直徑和抑菌率大于相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)P2,P2又大于P1,且差異明顯(p<0.05),表明干燥方式對(duì)核桃青皮的抑菌活性有明顯影響。同一處理的核桃青皮隨用量的減少,其抑菌圈直徑和抑菌率減小,即M1>M2>M3,且差異顯著(p<0.05)。雖然各樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果均低于5 mg/mL的克林霉素,但抑菌率均在60%以上,表明核桃青皮對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌活性,并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

2.3 不同干燥方式的核桃青皮對(duì)石榴干腐病菌的抑制效果

石榴干腐病菌在含各樣品培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落直徑和抑菌率見(jiàn)表3。3種干燥方式的核桃青皮對(duì)石榴干腐病菌的抑制效果存在差別,P3的菌落直徑小于P2的,P2又小于P1,且差異明顯(p<0.05),表明干燥方式對(duì)核桃青皮的抑菌活性有明顯影響。同一處理的核桃青皮隨用量的減少,其菌落直徑增大,即M1

2.4 最小抑菌濃度測(cè)定

3種不同處理樣品對(duì)3種供試菌的最小抑菌濃度(MIC)見(jiàn)圖1,P1、P2和P3對(duì)大腸桿菌和石榴干腐病菌的MIC一致,分別是20、15和10 mg/mL;對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC分別是15、10和5 mg/mL,均低于另2種供試菌,說(shuō)明金黃色葡萄球菌對(duì)核桃青皮更敏感。P1、P2和P3相比,不同的干燥處理方式對(duì)核桃青皮中胡桃醌的含量會(huì)有明顯影響,這一結(jié)果表明處理方式可能是影響了核桃青皮中的胡桃醌的含量從而影響了抑菌效果。

表4 胡桃醌含量與MIC的相關(guān)性分析Table 4 The correlation of MIC and juglone

注:**在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān),n=3。仍然是P3的MIC最低,其次P2,最高的是P1。

圖1 不同干燥方式核桃青皮的最小抑菌濃度Fig.1 MIC of different drying methods of green walnut husk

2.5 樣品中胡桃醌含量及其與抑菌活性的關(guān)系

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算知,P1、P2和P3樣品中胡桃醌的含量分別是8.04、9.46和11.84 mg/g。不同干燥方式使核桃青皮樣品中胡桃醌的含量是有較大差別的。核桃青皮中胡桃醌等成分由于結(jié)構(gòu)中含有不飽和鍵不穩(wěn)定,易受外界因素的影響而發(fā)生降解[15]。P1為自然晾曬干燥,經(jīng)過(guò)3～5 d的風(fēng)吹日曬,核桃青皮中的有效成分胡桃醌被氧化分解較多;P2為快速烘干,加熱處理時(shí)間相對(duì)較短,胡桃醌的損失相對(duì)較少;而P3為真空低溫條件下冷凍干燥,胡桃醌的損失最少。經(jīng)分析3種樣品中胡桃醌的含量,P1、P2和P3樣品中胡桃醌的含量分別是8.04、9.46和11.84 mg/g,也證實(shí)了這一點(diǎn),說(shuō)明干燥處理的方式會(huì)對(duì)胡桃醌的含量產(chǎn)生影響。因此,為更好地保持核桃青皮中有效成分的含量,要選擇適宜的加工方式。

供試的3種菌中大腸桿菌為革蘭氏陰性細(xì)菌,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,石榴干腐病菌為真菌,3種類(lèi)型的樣品對(duì)這3種供試菌的抑制作用雖然有一定的差別,但與陽(yáng)性對(duì)照相比均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌活性。喬永剛等[22]發(fā)現(xiàn)核桃青皮提取物對(duì)多種植物枯萎病菌也有抑制作用,表明核桃青皮具有廣譜的抑菌作用。普遍認(rèn)為胡桃醌是核桃青皮中的主要有效成分[23-25],本文對(duì)樣品中胡桃醌含量與其MIC數(shù)據(jù)做了相關(guān)性分析,結(jié)果見(jiàn)表4。胡桃醌含量與對(duì)3種供試菌的抑菌活性之間的相關(guān)系數(shù)均為0.981,胡桃醌含量與抑菌活性之間呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),也再一次印證胡桃醌是核桃青皮抑菌的主要有效成分,表明胡桃醌是核桃青皮抑菌的主要有效成分。

3 結(jié)論

自然干燥(P1)、65 ℃烘干(P2)及真空冷凍干燥(P3)核桃青皮的抑菌活性均表現(xiàn)為P3>P2>P1;P1、P2和P3對(duì)大腸桿菌和石榴干腐病菌的最小抑菌濃度(MIC)結(jié)果一致,分別為20、15和10 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC分別是15、10和5 mg/mL;P1、P2和P3樣品中胡桃醌的含量分別是8.04、9.46和11.84 mg/g,與其抑菌活性呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)。因此,干燥方式對(duì)核桃青皮中胡桃醌含量有顯著影響,進(jìn)而影響了核桃青皮的抑菌活性。低溫真空冷凍干燥能較好保持核桃青皮中胡桃醌含量,是一種理想的干燥方式。

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Effects of drying methods on the juglone content and antibacterial activity of green walnut husk

ZHANG Li-hua,LI Yan,ZHANG Pei,CHEN Qing,WANG Huan

(College of Life Science,Zaozhuang University,Zaozhuang 277160,China)

To explore the relationship between dry method and antibacterial activity of green walnut husk,the antibacterial activities of natural drying(P1),hot-air drying(P2)and vacuum freeze drying(P3)of green walnut husk were evaluated,usingEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandZythiaversonianaSacc. as test microorganisms in this paper. Results showed that the three samples all had strong inhibition,and presented a dose-response relationship,namely M1>M2>M3(dose of walnut green husk extract were respectively 100(M1),80(M2),and 60(M3) mg/mL). The drying methods were characterized by P3>P2>P1. For P1,P2and P3,the minimum inhibition concentration(MIC)ofE.coliandZythiaversonianaSacc. were consistent. The doses were 20,15 and 10 mg/mL respectively. The MIC ofStaphylococcusaureuswere 15,10,and 5 mg/mL. The juglone content of samples were respectively 8.04(P1),9.46(P2),and 11.84(P3) mg/g,significant positive correlation with antibacterial activity(p<0.01). In conclusion,the drying methods could affect the juglone content and antibacterial activity of green walnut husk,vacuum freeze drying was an ideal way.

green walnut husk;drying method;juglone;antibacterial activity

2016-09-02

張立華(1968-)，男，博士，教授，研究方向：植物資源開(kāi)發(fā)，E-mail：chinazhanglh@163.com。

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2013BL018)。

TS261.4

A

1002-0306(2017)10-0141-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.019