湯歡+向麗+李西文+孫偉+王美娜+黃云峰+葉萌

[摘要] 蘭科藥用植物形態(tài)分類困難，此研究采用DNA條形碼分子鑒定法從分子水平驗證蘭科藥用植物的傳統(tǒng)形態(tài)分類。以matK，psbA-trnH和ITS2序列作為DNA條形碼對已進(jìn)行了形態(tài)鑒定的49屬135種163份蘭科藥用植物樣品進(jìn)行分子鑒定，經(jīng)DNA提取，PCR擴(kuò)增、雙向測序及校對拼接后，將得到的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，然后運(yùn)用MEGA 7.0軟件中的Neighbor-joining （NJ）法構(gòu)建物種系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，163份樣品均能成功提取DNA；matK，psbA-trnH和ITS2序列的PCR擴(kuò)增效率分別為100%，100%，98.77%；共獲得487條序列，其中345條序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對到了相應(yīng)物種的序列，142條為新增序列；運(yùn)用NJ法構(gòu)建的蘭科藥用植物系統(tǒng)進(jìn)化樹中，基于matK序列所構(gòu)建的物種系統(tǒng)進(jìn)化樹要優(yōu)于基于psbA-trnH和ITS2序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹。matK，psbA-trnH和ITS2序列在鑒定蘭科藥用植物過程中互為補(bǔ)充，DNA條形碼分子鑒定法可用于輔助蘭科藥用植物的分類鑒定。

[關(guān)鍵詞] 蘭科；DNA條形碼；藥用植物；分子鑒定

[Abstract] In this study，DNA barcoding was used to validate the traditional morphological classification of medicinal plants of Orchidaceae. The 163 samples of 135 species belong to 49 genera which have been confirmed by morphological identification were collected. Candidate sequences，including matK，psbA-trnH and ITS2 sequences，were amplified，bidirectionally sequenced，and assembled. All the sequences were blasted to GenBank database at NCBI，then analyzed using Neighbor-joining tree method by MEGA 7.0. The results showed that the DNAs of 163 samples were successfully extracted. The amplification efficiency of matK，psbA-trnH and ITS2 sequences were 100%，100% and 98.77%，respectively. The 487 sequences were obtained，345 sequences of which have matched corresponding sequences in the GenBank database and 142 sequences were new sequences. The topology of NJ tree which were constructed with the matK sequences was better than the trees of psbA-trnH and ITS2 sequences. In conclusion，the matK，psbA-trnH and ITS2 sequences were complementary and suitable for identification of medicinal plants of Orchidaceae. DNA barcoding can be used as an auxiliary means for identification of medicinal plants of Orchidaceae.

[Key words] Orchidaceae；DNA barcoding；medicinal plants；molecular identification

蘭科Orchidaceae是世界性大科之一，包括地生、附生、菌類寄生等生活方式[1]，在全世界約有800屬20 000～35 000種[2-4]，F(xiàn)lora of China中記載中國境內(nèi)的野生蘭科植物共有194屬（中國特有屬11個） 1 388種（中國特有種491個）[4]。蘭科植物中的許多物種因其形態(tài)高度進(jìn)化，物種之間僅有極細(xì)微的差異，從形態(tài)上對其進(jìn)行鑒定較困難。

自雙名法確立以來的250多年里，人類共鑒定和描述了約170萬種生物[5]，但這僅僅占到分類學(xué)家預(yù)計物種數(shù)量的15%[6]。DNA條形碼（DNA barcoding）是一種基于DNA序列進(jìn)行生物物種鑒定的技術(shù)，即利用標(biāo)準(zhǔn)化的一個或者幾個DNA片段進(jìn)行序列分析，根據(jù)核苷酸序列差異，對物種進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的鑒定[7-9]。傳統(tǒng)物種分類學(xué)主要依據(jù)物種形態(tài)和解剖特點(diǎn)進(jìn)行鑒定，受鑒定人員的知識結(jié)構(gòu)、經(jīng)驗以及物種生長發(fā)育狀態(tài)等因素的影響[10]。DNA條形碼分子鑒定法因是從分子水平對物種進(jìn)行鑒定，突破了對經(jīng)驗的過度依賴，并且不受樣品形態(tài)和取樣部位的限制，鑒定穩(wěn)定性和重復(fù)性高，操作簡單，便于缺少分類學(xué)知識的人員進(jìn)行物種鑒定，能極大緩解當(dāng)前分類人才短缺的現(xiàn)狀。DNA條形碼分子鑒定法通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，可加速隱存種和新物種的發(fā)現(xiàn)。通過信息平臺建立物種DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，易于實(shí)現(xiàn)數(shù)字化，實(shí)現(xiàn)資源共享[11-15]。目前，DNA條形碼分子鑒定法已在多種類型的藥用植物鑒定中得到了廣泛應(yīng)用，表現(xiàn)出較強(qiáng)的鑒定能力[16-22]。

在悠久的中醫(yī)藥發(fā)展過程中，勞動人民很早就利用一些蘭科植物進(jìn)行治病，在中國現(xiàn)存最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中就以赤箭、石斛、白芨之名記載了3種蘭科植物。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為許多蘭科藥用植物具有生津止渴、潤肺化痰、清熱解毒、活血調(diào)經(jīng)、軟堅散結(jié)、祛風(fēng)止痛、止血、定驚、斂瘡等功效。蘭科藥用植物的藥用部位一般為其全草、塊莖或假鱗莖，一些常用物種，如天麻、石斛、白及、山慈菇等，均具有較高藥用價值？由于蘭科藥用植物形態(tài)分類較困難，很容易采集到形態(tài)相近的偽品而威脅到用藥安全。因此，此研究運(yùn)用DNA條形碼分子鑒定法對蘭科藥用植物進(jìn)行鑒定研究，篩選適合蘭科藥用植物分子鑒定的DNA條形碼序列，探討其在鑒定蘭科藥用植物上的可行性，從分子水平驗證蘭科藥用植物的傳統(tǒng)形態(tài)分類結(jié)果，保障用藥安全。

1 材料

1.1 采集與鑒定

查閱中國數(shù)字植物標(biāo)本館（Chinese Virtual Herbarium，CVH，http：//www.cvh.org.cn/）和相關(guān)文獻(xiàn)，并根據(jù)實(shí)際情況確定采樣區(qū)域和采樣路線。采樣時，依據(jù)CVH中的標(biāo)本信息，在蘭科藥用植物分布較集中的區(qū)域進(jìn)行重點(diǎn)調(diào)查采集。采集地主要包括：廣西壯族自治區(qū)百色市境內(nèi)的那坡縣老虎跳自然保護(hù)區(qū)和樂業(yè)-鳳山世界地質(zhì)公園以及廣東省深圳市梧桐山腳下的“深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心”。共采集了49屬135種163份蘭科藥用植物，經(jīng)過“深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心”饒文輝館長和廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員等蘭科專家鑒定。

1.2 采樣區(qū)域概況

那坡縣老虎跳自然保護(hù)區(qū)位于廣西西南部的百色市那坡縣，與云南東南部、越南北部相鄰。該區(qū)域地理坐標(biāo)為東經(jīng)105°31′—105°53′ E，北緯22°56′—23°15′ N，最高峰海拔1 603 m；多年平均日照1 404 h，年均溫18.8 ℃，≥10 ℃的活動積溫6 026 ℃，無霜期324 d；多年平均降水量1 408 mm，蒸發(fā)量1 388 mm；土壤主要為紅壤、黃紅壤、黃壤、石灰土等；氣候溫和、雨熱充沛，植被保存較好，屬北熱帶氣候帶，地帶性植被型以溝谷雨林和石灰?guī)r山地季雨林為主，是中越邊境植物多樣性核心區(qū)域，蘭科植物尤為豐富。廣西樂業(yè)-鳳山世界地質(zhì)公園位于云貴高原向廣西盆地過渡的斜坡地帶，由相鄰的樂業(yè)大石圍國家地質(zhì)公園和鳳山巖溶國家地質(zhì)公園組成，該區(qū)域地理坐標(biāo)為東經(jīng)106°18′—107°06′ E，北緯24°18′—24°50′ N，海拔274～1 500 m，屬亞熱帶氣候，熱量充沛，干濕季明顯，每年5—10月為雨季，11月至次年4月為旱季；該區(qū)域土壤多為由砂頁巖風(fēng)化的殘積母質(zhì)發(fā)育而成的紅壤、黃壤和低海拔的褐紅壤，局部有石灰土。廣東省深圳市梧桐山腳下的“深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心”保存著中國近千種原生蘭科植物資源，被譽(yù)為“中國蘭谷”，該中心所在區(qū)域?qū)倌蟻啛釒夂颉?/p>

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

2.1.1 DNA提取 用75%乙醇擦拭經(jīng)50 ℃低溫干燥的葉片樣品，稱取約30 mg，經(jīng)適當(dāng)剪切后，將樣品移入已滅菌的2 mL圓底EP管中，并向EP管中加入一顆小鋼珠，再放入高通量組織研磨儀（Sceintz Biotech Co.，China）中，在50 Hz頻率下研磨120 s后，加入核分離液（配方為：Tris-HCl （pH 8.0）終濃度100 mmol·L^-1，EDTA （pH 8.0）終濃度20 mmol·L^-1，NaCl終濃度0.7 mol·L^-1，PVP-40為2%，以上各物質(zhì)配成溶液后滅菌，使用之前加入0.4%的β-巰基乙醇）[23]清洗1至多次（800 μL/次）至上清液無色后，用移液槍吸去上清液，留沉淀，再向其中加入裂解液，混勻后，使用56 ℃水浴過夜（8～12 h） （對于新鮮樣品或較易提取出DNA的樣品，可置于65 ℃水浴鍋中水浴60～90 min），再采用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取蘭科藥用植物樣品總基因組DNA。詳細(xì)操作步驟參見中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則及試劑盒說明書。

2.1.2 PCR擴(kuò)增和測序 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[24-31]，選擇在蘭科藥用植物中使用較廣泛的葉綠體基因組matK序列和psbA-trnH序列以及核基因組ITS2序列作為DNA條形碼序列。擴(kuò)增引物及PCR擴(kuò)增程序詳見相關(guān)文獻(xiàn)[23]。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增情況，對出現(xiàn)清晰目的條帶的樣品進(jìn)行純化后，運(yùn)用ABI 3730XL測序儀（Applied Biosystems Co.，USA）進(jìn)行雙向測序。

2.2 數(shù)據(jù)處理

使用CodonCode Aligner V6.0.2 （CodonCode Co.，USA）軟件對測序獲得的序列進(jìn)行質(zhì)量分析和校對拼接，去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)，獲得了ITS2，psbA-trnH，matK這3種DNA條形碼序列。再運(yùn)用MEGA 7.0 （Molecular Evolutionary Genetics Analysis，USA）軟件對候選條形碼序列進(jìn)行序列分析，用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并用自舉檢驗法Bootstrap 1 000次檢驗各分支的支持率[32]。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增

將163份蘭科藥用植物樣品用核分離液洗后，加入裂解液，用56 ℃水浴過夜（8～12 h），以保證樣品中的DNA能夠充分溶出，提高DNA提取的成功率。之后，嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行操作。163份蘭科藥用植物樣品DNA均成功提取。PCR擴(kuò)增后，樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）。163條matK序列和psbA-trnH序列全擴(kuò)增成功，ITS2序列擴(kuò)增出161條（2條未出），擴(kuò)增成功率98.77% （表1）。擴(kuò)增成功的樣品均有較明顯的單一目的條帶。經(jīng)雙向測序和校對拼接后，共得到487條DNA條形碼序列。

3.2 BLAST分析

對得到的487條序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中運(yùn)用BLAST方法進(jìn)行序列比對。此研究獲得的序列中，有345條在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對到了相應(yīng)物種的序列，其中，在matK序列中有61條的BLAST比對率為100%，62條的BLAST比對率為99%，2條的BLAST比對率為98%，1條的BLAST比對率為97%；psbA-trnH序列中有23條的BLAST比對率為100%，46條的BLAST比對率為99%，21條的BLAST比對率小于99%；ITS2序列中有72條的BLAST比對率為100%，34條的BLAST比對率為99%，23條的BLAST比對率小于99%。另外，此研究中共有142條DNA條形碼序列（分別為37條matK序列，73條psbA-trnH序列和32條ITS2序列）在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對不到相應(yīng)的序列，這些DNA條形碼序列作為新增條形碼，將進(jìn)一步完善數(shù)據(jù)庫（表2）。

3.3 NJ樹分析

采用Bootstrap 1 000次重復(fù)，僅顯示自展支持率≥50%的數(shù)值。

將135種蘭科藥用植物的163條matK、163條psbA-trnH和161條ITS2序列分別運(yùn)用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。matK，psbA-trnH，ITS2這3種序列的蘭科藥用植物NJ樹中，各屬物種均分別聚成一支，各物種的多條序列也分別聚成一支，3種序列相互補(bǔ)充，能夠很好地將此研究中所做的蘭科藥用植物各物種區(qū)分開。其中matK序列構(gòu)建的NJ樹中各亞族能夠很清晰地被分開，白及亞族與筍蘭亞族及貝母蘭亞族聚成一支，樹蘭族的香莢蘭亞族沒有和其他樹蘭族的物種聚成一支，柄唇蘭亞族與毛蘭亞族聚成一支，鳥巢蘭族各亞族聚成一支，杓蘭亞科各物種聚成一支。psbA-trnH序列構(gòu)建的NJ樹中各亞族能夠很清晰地被分開，但杓蘭亞科的物種沒有聚成一支，毛蘭亞族各屬聚成了2支，鳥巢蘭族各亞族聚成一支。ITS2序列構(gòu)建的NJ樹中各亞族能夠很清晰地被分開，白及亞族與筍蘭亞族及貝母蘭亞族聚成一支，毛蘭亞族與柄唇蘭亞族各聚成一支，但樹蘭族的各亞族被分成了2部分，鳥巢蘭族各亞族聚成一支，杓蘭亞科各物種聚成一支。

4 結(jié)果與討論

此研究選擇在蘭科植物中使用較廣泛的matK，psbA-trnH，ITS2這3種條形碼序列作為蘭科藥用植物分子鑒定的DNA條形碼序列。此研究中163份蘭科藥用植物樣品均在提取DNA前，使用核分離液進(jìn)行了一至多次洗滌，以加大所提DNA的純度和濃度。PCR反應(yīng)體系為25 μL，當(dāng)使用2.5 μmol·L^-1的引物各1 μL時擴(kuò)增效果較好，而引物濃度過高時，比較容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)，容易產(chǎn)生引物二聚體，降低效率，而引物濃度過低時，會使擴(kuò)增產(chǎn)物過少而影響后續(xù)實(shí)驗。PCR循環(huán)的次數(shù)主要取決于起始模板DNA的濃度，由于循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)越多，反應(yīng)中產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物的量越大，因此，在滿足產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)，此研究中設(shè)置的PCR循環(huán)次數(shù)為35～40次，所得到的PCR產(chǎn)量均能滿足后續(xù)實(shí)驗要求。

中國學(xué)者建立了以ITS2序列為主，psbA-trnH序列為輔的藥用植物類中藥材DNA條形碼鑒定體系[33-35]。通過運(yùn)用matK，ITS2和psbA-trnH這3種DNA條形碼序列對135種163份蘭科藥用植物樣品進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定后發(fā)現(xiàn)matK序列較ITS2序列和psbA-trnH序列更適宜用于鑒定此研究中的蘭科藥用植物。Lahaye等[24]分析了以蘭科為主的1 600份植物的DNA序列，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用matK序列的鑒定效率可達(dá)到90%以上。此研究的研究結(jié)果與Lahaye等的研究結(jié)果相符，這可能是由于

matK序列為葉綠體基因組序列，比較適宜鑒定蘭科等單子葉植物，而ITS2為核基因組序列，在雙子葉植物中有比較好的鑒定效率。由于蘭科藥用植物樣品采集較困難，此研究所采集的蘭科藥用植物樣品份數(shù)較少，上述發(fā)現(xiàn)還有待更深入的研究。由于所采集的每個物種僅有1～3份樣品，這會導(dǎo)致對物種內(nèi)變異的低估，或者沒有分析姊妹類群而高估種間差異，使DNA條形碼分析結(jié)果中的DNA條形碼鑒定有效性和準(zhǔn)確率偏高，在今后還應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大物種量和樣品量，繼續(xù)進(jìn)行更深入的研究。

由于亞種、變種等種下等級以及某些屬內(nèi)物種，其DNA序列的差異較小，即使同時使用多段DNA條形碼序列也很難對其進(jìn)行有效鑒定，如在此研究中的石斛屬樣品，盡管同時運(yùn)用了3種DNA條形碼序列對其進(jìn)行鑒定，仍然有一些物種不能分開。因此，很有必要在今后繼續(xù)探索通用DNA條形碼序列，并探索專門用于某些物種的特異DNA條形碼序列，進(jìn)一步改善相關(guān)的DNA提取方法和提取試劑，不斷完善此分子鑒定法，逐步解決對種下居群鑒定困難等問題，并加速對蘭科物種的大規(guī)模測序，完善蘭科植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，為今后更高效快捷地運(yùn)用此DNA條形碼分子鑒定法鑒定蘭科植物提供參考序列，積極推進(jìn)蘭科植物鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]