戚勃，楊少玲，楊賢慶，鄧建朝，吳燕燕，陳勝軍，黃卉，胡曉

(中國水產(chǎn)科學研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州，510300)

分光光度法測定水產(chǎn)品中的二甲胺

戚勃，楊少玲，楊賢慶*，鄧建朝，吳燕燕，陳勝軍，黃卉，胡曉

(中國水產(chǎn)科學研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州，510300)

建立了分光光度法測定水產(chǎn)品中二甲胺(dimethylamine，DMA)含量的方法。水產(chǎn)樣品中的DMA用三氯乙酸提取、與銅銨試劑反應(yīng)顯色后用苯萃取，用分光光度計在波長434 nm測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品中二甲胺的含量。結(jié)果表明：反應(yīng)體系在pH 12.0、50℃水浴時間3 min下顯色良好，DMA濃度在0～10 mg/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.057 4x-0.005 7(R2=0.999 7)，檢出限為6 mg/kg。選用6種不同品種的水產(chǎn)品作加標回收率試驗，其加標回收率為86.7%～99.2%，相對標準偏差為1.36%～4.78%。

二甲胺；水產(chǎn)品；分光光度法

二甲胺是一種常見低分子有機胺，通常存在于自然環(huán)境和水產(chǎn)品中，尤其是海產(chǎn)品中含量較高[1-2]。水產(chǎn)品中的DMA是由氧化三甲胺TMAO經(jīng)酶或微生物分解作用生成，同時還生成等比例的甲醛。LIN[3]對17種海產(chǎn)鮮品中DMA含量進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)鯊魚翅中DMA的含量高達895 mg/kg。BATTITT[4]和SPINELLI[5]在水產(chǎn)干制品中也檢測到大量的DMA，并證明熱處理和一些化合物都能夠促進DMA的形成。研究證明，食品中的二甲胺能與亞硝酸鹽形成致癌性很強的二甲基亞硝胺[6-7]。因此，二甲胺在水產(chǎn)品中的含量受到廣泛關(guān)注，日本、中國臺灣還將DMA作為水產(chǎn)品鮮度指標。

目前，對DMA測定方法較多，主要有分光光度法、液相色譜法、氣相色譜法、離子色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和毛細管電泳等方法[8-11]。但是，這些方法主要用于肉制品和環(huán)境中二甲胺的檢測。色譜類檢測方法具有分離效率高、選擇性高、靈敏度高、分析速度快、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但是用色譜測定時，一般需要進行化學衍生處理，操作繁瑣，耗時長，且衍生過程需加熱會使樣品中氧化三甲胺發(fā)生降解產(chǎn)生DMA，使得測定結(jié)果含量偏高，產(chǎn)生誤差[12]，而且色譜類檢測儀器昂貴，不利于在中小企業(yè)或普通實驗室應(yīng)用。我國還未有DMA在食品中的限量標準，也沒有針對水產(chǎn)品中DMA測定的標準方法。因此，針對水產(chǎn)品建立簡單、快捷、準確又能被廣泛應(yīng)用的DMA檢測方法，具有重要的現(xiàn)實應(yīng)用價值。

本文在參考文獻[13]的基礎(chǔ)上，通過三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)提取、銅胺試劑顯色、分光光度計比色、優(yōu)化測定條件，建立了水產(chǎn)品DMA的測定方法。分光光度法操作簡單，無需特殊儀器，重現(xiàn)性、靈敏度均能達到食品檢測的要求，有利于本方法的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原材料

魷魚、海蝦、蟹、蛤蜊肉、墨魚、海參、龍頭魚等冷凍水產(chǎn)品，購自廣州華潤萬家超市。

1.1.2 試劑

無水NaSO4、NaOH、苯、CS2、CuSO4、乙酸銨、氨水、鹽酸二甲胺，均為分析純；試驗用水符合GB/T 6682規(guī)定的二級水標準。

1.2 主要儀器

紫外-可見分光光度計UV3000，上海美譜達儀器有限公司；25 mL具塞比色管、1 cm氣密式石英比色皿；分析天平，密多利斯科學儀器北京有限公司；均質(zhì)機，IKA；Na2SO4玻璃砂芯層析柱(內(nèi)徑×長度=10 mm×100 mm，填充約5 g無水Na2SO4)

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗原理[13]

水產(chǎn)品中含有的二甲胺經(jīng)過三氯乙酸提取后，在氨水共存的堿性溶液中，經(jīng)劇烈搖動與CS2縮合生成二甲基二硫代氨基甲酸銨，該縮合物又與醋酸二價Cu2+反應(yīng)生成黃色的絡(luò)合物，經(jīng)苯萃取后，用分光光度計在波長434 nm處比色定量測定。

1.3.2 主要試劑配制

(1)120 g/L NaOH：稱取12 g NaOH，用水溶解，冷卻后定容至100 mL容量瓶。

(2)銅銨試劑：分別稱取25 g乙酸銨、10 g NaOH、0.2 g CuSO4，分別用少量水溶解，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，再加入20 mL濃氨水，用水定容至刻度。

(3)5%CS2苯溶液：吸取50 mLCS2于1 000 mL容量瓶，用苯定容至刻度。

(4)50 g/L三氯乙酸溶液：稱取50 g三氯乙酸，用水溶解并定容至1 000 mL容量瓶。

(5)35%酸溶液：量取35 mL冰醋酸于100 mL容量瓶，用水定容至刻度。

(6)二甲胺標準儲備液：稱取經(jīng)硅膠干燥器干燥的鹽酸二甲胺0.180 9 g，用50 g/L三氯乙酸溶液溶解并定容于100 mL容量瓶，作為儲備液。該儲備液相當于二甲胺濃度1 000 mg/L，置4℃冰箱冷藏。

(7)二甲胺標準使用液：臨用時吸取2.50 mL二甲胺儲備液，移入50 mL容量瓶，用50 g/L 三氯乙酸定容至刻度。該標準使用液濃度為50 mg/L。

1.3.3 標準曲線繪制

分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和1.5 mL二甲胺標準使用液于25 mL比色管，再分別加入50 g/L的三氯乙酸溶液使各管總體積為5 mL，即相當于二甲胺系列濃度為0、1、2、4、6、8、10、15 mg/L，再分別加入1 mL 120 g/L NaOH、1 mL銅銨試劑和10 mL CS2苯溶液，混勻。在50℃水浴3 min，立即劇烈振搖150次，再加入1 mL 35%的醋酸溶液，立即振搖120次，靜置30 min；吸取上層顯色液，經(jīng)Na2SO4玻璃砂芯層析柱過濾至10 mL具塞試管，吸取顯色液于1 cm比色皿，以0管為參比空白，在434 nm處測定各管的吸光度值，以吸光度值對標準液濃度繪制標準曲線。

1.3.4 樣品測定

1.3.4.1 樣品處理

魚經(jīng)清洗、去皮，取背部肌肉；海蝦清洗后去頭、去殼、去腸腺，取整條蝦肉；魷魚、墨魚清洗后去頭、去鞘、去內(nèi)臟，取胴體部分；蟹清洗后去殼、去腮后取可食用部分(肉及腺體)；將取得的樣品用絞肉機絞碎、混勻，及時測定，不能及時測定的樣品放-18 ℃冰箱凍藏。

1.3.4.2 樣品液制備

稱取攪碎的肉樣5 g，置于100 mL離心管，加入50 g/L三氯乙酸溶液45 mL，用均質(zhì)機在10 000 r/min下勻漿約20 s，5 000 r/min下離心10 min，上清液經(jīng)中速濾紙濾入100 mL容量瓶；沉淀再重復(fù)處理1次，合并2次濾液，再用50 g/L三氯乙酸溶液定容至刻度。

1.3.4.3 樣品液測定

吸取樣品溶液5 mL于25 mL比色管，再分別加入1 mL 120 g/L NaOH、1 mL銅銨試劑和10 mL CS2苯溶液，混勻。以下操作同標準曲線繪制方法。同時用50 g/L三氯乙酸作試劑空白，在434 nm處測定各管的吸光度值，根據(jù)標準曲線回歸方程計算二甲胺濃度。

1.3.4.4 樣品中二甲胺含量計算

樣品中二甲胺含量計算按式(1)計算：

(1)

式中：x，樣品中二甲胺含量，mg/kg；C，樣品溶液二甲胺濃度測定值，mg/L；V，樣品溶液定容體積，mL，m，取樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 二甲胺測定波長確定

吸取DMA標準使用液0.8 mL，以下按照1.3.3的操作方法使之顯色。顯色液移入1 cm比色皿，用分光光度計在500～400 nm范圍內(nèi)間隔1 nm進行波長掃描(圖1)。由圖1可見，最大吸收峰出現(xiàn)在434 nm處，由此確定本方法DMA檢測波長為434 nm。

圖1 二甲胺吸收光譜圖Fig. 1 Absorbtion spectrum of DMA

2.2 最佳pH值

二甲胺需要在堿性條件下發(fā)生縮合反應(yīng)而最終顯色，由于樣品提取液為50 g/L的三氯乙酸溶液，測定時僅加入銅銨試劑，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系的pH值較低(pH 9.6左右)，靈敏度不高。因此需要另外添加一定量的NaOH中和過多的三氯乙酸，以提高pH值。為了確定添加NaOH的量，作NaOH加入量與吸光度之間的關(guān)系試驗。分別吸取1 mL二甲胺標準使用液于9支25 mL比色管中，分別添加50 g/L三氯乙酸至5 mL，分別加入不同體積120 g/L NaOH溶液，以下步驟同1.3.3。同時做試劑空白試驗，重復(fù)作3個平行試驗，結(jié)果取平均值。NaOH加入量與吸光度的關(guān)系如圖2所示。

圖2 NaOH添加量與吸光度的關(guān)系Fig. 2 Relation between absorbensy and addition of sodium hydroxide

由圖2可見，隨著NaOH加入量的增加DMA吸光度也隨之升高，當NaOH加入到0.8 mL后，吸光度值趨于平緩，當加到1.0 mL左右時(pH 12.0左右)，吸光度值達到最大值0.570；當加入量超過1 mL后，吸光度值開始下降。因此，本方法NaOH加入量確定為1.0 mL。

2.3 水浴時間

DMA顯色反應(yīng)需要在40～50℃的條件下進行，為了確定最佳反應(yīng)條件，作水浴時間與吸光度之間的關(guān)系試驗(圖3)。

圖3 水浴時間與吸光度之間的關(guān)系Fig.3 Relation between water bath time absorbensy

分別吸取1 mL二甲胺標準工作液于5支25 mL比色管中，分別添加50 g/L三氯乙酸至5 mL，以下同1.3.3加入試劑。同時作空白試劑試驗。加完試劑后搖勻，同時放入50℃水浴鍋，每間隔1 min各抽取1支比色管(分別代表水浴時間1、2、3、4、5 min)，立即劇烈振搖150次，再加1 mL 35%醋酸溶液，振搖120次，以下同標準曲線操作、比色。重復(fù)作3個平行試驗，取平均值。

由圖3可見，在50 ℃下水浴5 min時間內(nèi)，隨著時間的延長，吸光度值先升高、再趨于平衡，在顯色3 min時，吸光度達到最大值(0.576)，即表示已反應(yīng)完全。因此，本方法確定水浴條件為50℃下水浴3 min。

2.4 靜置時間

經(jīng)水浴劇烈振搖后的DMA顯色液含有大量氣泡和水分，需要靜置一定時間，充分分層才能達到澄清、透明狀態(tài)，比色時吸光度值也才能達到穩(wěn)定。為了確定靜置時間，作靜置時間與吸光度之間的關(guān)系試驗。吸取1 mL二甲胺標準使用液于6支25 mL比色管中，以下操作同1.3.3標準曲線繪制方法。同時做空白試驗。水浴振搖顯色后，靜置60 min，每間隔10 min(分別代表靜置10、20、30、40、50、60 min)取1支比色管的顯色液進行比色。重復(fù)作3個平行試驗，取平均值。靜置時間與吸光度之間的關(guān)系見圖4。

圖4 靜置時間與吸光度之間的關(guān)系Fig.4 Relation between standing time and absorbensy

由圖4可見，經(jīng)水浴后的DMA顯色液，在靜置60 min內(nèi)，吸光度值變化不大，在0.566～0.581內(nèi)，靜置30 min時吸光度為0.577，靜置60 min時吸光度值為0.581，說明靜置時間對吸光度值影響并不明顯。但是試驗過程中發(fā)現(xiàn)，在靜置20 min內(nèi)進行比色，吸光度值讀數(shù)不穩(wěn)定。這可能是由于在短時間內(nèi)靜置，DMA顯色液還不能降低到室溫，顯色液中的苯揮發(fā)較快，造成顯色液濃度升高，吸光度值變大。靜置30 min時，比色時吸光度讀數(shù)趨于穩(wěn)定。因此，本方法確定顯色后的DMA宜靜置30 min后再進行比色測定。

2.5 顯色穩(wěn)定性

為了考查本方法顯色液的穩(wěn)定性，將1.3.3繪制標準曲線后剩余的顯色液放置1 d后再比色，比較其吸光度值變化情況(表1)。由表1可見，DMA顯色液放置1 d后，其吸光度值略微升高，這可能是由于在放置過程中，苯有微量揮發(fā)導(dǎo)致顯色液濃度略微升高，因此吸光度值變大，但是吸光度值變化幅度在0.006內(nèi)。因此本方法具有良好的穩(wěn)定性。

表1 顯色穩(wěn)定性試驗

注：*標準曲線測定數(shù)據(jù)。

2.6 標準曲線

對1.3.3顯色液用分光光度計在波長434 nm處進行比色，以DMA濃度x為橫坐標，吸光度y為縱坐標繪制DMA標準準曲線，如圖5所示。

圖5 二甲胺標準曲線Fig. 5 Standard curve of DMA

由圖5可見，標準曲線在0～15 mg/L(相當于樣品0～300 mg/kg)濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.057 4x-0.005 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。

2.7 檢出限

根據(jù)國際理論與應(yīng)用化學聯(lián)合會(IUPAC)的規(guī)定[14]，分光光度法檢測樣品，以扣除空白值后的吸光度為0.01相對應(yīng)的濃度即為檢出限。試驗配制一系列低濃度的DMA標準溶液，按照1.3.3標準曲線操作方法測定其吸光度，根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)的線性關(guān)系和吸光度值確定方法的檢出限，試驗結(jié)果如表 2 所示。

表2 檢出限試驗結(jié)果

由表2可見，DMA濃度為0.3 mg/L時，吸光度值為0.012，接近檢出限吸光度值。因此，本方法測定DMA的方法檢出限為0.3 mg/L，相當于樣品的檢出限為6 mg/kg。

2.8 精密度

精密度試驗采用3個標準濃度(1、6、10 mg/L)進行試驗，每個濃度測定6次，結(jié)果如表3所示。

表3 精密度試驗結(jié)果

由表3可知，該方法測得3個不同濃度的標準溶液RSD值分別為6.42%、2.22%和1.41%，除低濃度(1 mg/L)RSD略高于5%，其他濃度的RSD均低于5%，說明本方法具有良好的重現(xiàn)性，準確度高，條件合理。

2.9 回收率

取6種不同的海產(chǎn)品，根據(jù)樣品本底含量不同，向樣品中分別添加不同量的DMA標準溶液，按照本試驗方法進行樣品測定，每個加標濃度作3個平行，結(jié)果如表4。

表4 樣品回收率試驗

由表4可見，6種海產(chǎn)品的加標平均回收率在86.7%～99.2%，且RSD在1.36%～4.78%，均<5%，說明本方法測定水產(chǎn)品中的DMA具有很好的準確度。

3 結(jié)論與討論

本試驗建立了水產(chǎn)品中DMA含量的分光光度法測定方法，優(yōu)化了最佳測定條件：測定波長434 nm、顯色pH 12.0、水浴時間為3 min(50 ℃)、顯色后靜置分層時間30 min，方法靈敏度b=0.057 4，樣品檢出限6 mg/kg；樣品用50 g/L三氯乙酸提取2次、加標回收率均達85%以上，相對標準偏差RSD均<5%，該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，儀器要求不高，符合水產(chǎn)品中二甲胺的檢測要求。

本檢測方法對比色皿有較為嚴格的要求，宜采用氣密式燒制成型的石英或玻璃比色皿。由于本方法顯色液為CS2苯液，屬于極易揮發(fā)性有機試劑，對有機材料或黏結(jié)劑具有較強的腐蝕和溶解作用。在試驗過程中，未能充分考慮到這一特性，曾采用膠黏結(jié)成型的玻璃比色皿或一次性有機玻璃比色皿，顯色液對這兩種比色皿造成脫膠或溶解性損壞；使用不帶蓋或普通塑料蓋片的比色皿，由于密封性不好，比色皿中的苯不斷揮發(fā)造成顯色濃度不斷升高，比色過程中讀數(shù)不斷升高，無法穩(wěn)定讀數(shù)。本試驗最后選用了氣密式燒制成型的石英比色皿，顯色液既不會損壞比色皿，比色時讀數(shù)也很穩(wěn)定。

實驗表明，酸堿度對吸光度影響較大。參考文獻[15]Dyer法pH 10左右，許龍福[13]采用4%高氯酸，用80 g/L NaOH調(diào)pH 11左右，吸光度均偏低。為提高靈敏度，本法根據(jù)文獻[13]提示，改加1 mL 120 g/L NaOH提高pH 12左右，此時提高了測試靈敏度。

試驗采用低濃度50 g/L TCA提取DMA，取得較好的準確度。在預(yù)實驗中，參考許龍福[13]和李豐[12]的方法，分別采用不同濃度的高氯酸和三氯乙酸進行DMA提取，發(fā)現(xiàn)TCA更易使樣品中的蛋白質(zhì)沉淀，樣品處理液變得澄清透明，因此選用TCA作為樣品處理液。在樣品處理時，預(yù)期通過提高TCA的濃度，以縮短樣品處理時間和效果，但是提高了TCA的濃度，在測定時需要添加更多NaOH中和TCA，對測定結(jié)果產(chǎn)生明顯的干擾。通過反復(fù)對比試驗，采用50 g/L TCA提取DMA得到了良好的結(jié)果。據(jù)此，標準液配制以及樣品處理液均采用50 g/L TCA，保證了標準液與樣品待測液pH值一致，提高了測定準確度。

顯色液比色前進行Na2SO4脫水為本方法的關(guān)鍵。標準液經(jīng)劇烈振搖后的顯色液中混有許多微小致密的水泡，樣品待測液中或多或少還殘留有微量蛋白質(zhì)等有機物質(zhì)，加入CS2苯液經(jīng)劇烈振搖，顯色液中會出現(xiàn)微量微小懸浮物，在靜置分層的過程中很難完全沉降到水層，因此顯色液變得略顯渾濁，導(dǎo)致比色結(jié)果偏高。本試驗改變直接往顯色液中加入Na2SO4的脫水方法，采用Na2SO4層析柱過濾式脫水，使得脫水完全，同時也能夠過濾掉顯色液中的微小懸浮物，使顯色液澄清、透明，消除了比色干擾。另外，試驗中也嘗試先采用0.45 μ的濾膜對樣品待測液進行過濾后再測定，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)效果與直接用Na2SO4層析柱過濾結(jié)果一樣，為節(jié)約成本和減少操作，試驗采用Na2SO4層析柱過濾法脫水。

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Spectrophotometry detection of dimethylamine in aquatic products

QI Bo，YANG Shao-ling，YANG Xian-qing*，DENG Jian-chao，WU Yan-yan，CHEN Sheng-jun， HUANG Hui，HU Xiao

(South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture, National Research and Development Center for Aquatic Product Processing, Guangzhou 510300, China)

A method for determining dimethylamine (DMA) in aquatic products was established using spectrophotometry. The DMA in aquatic products was extracted by TCA, after color reaction with copper-amine, it was then extracted by benzene. The absorbance of DMA colorimetric solution at 434 nm; the content of DMA was calculated based on the DMA standard curve. The results shows that：the color was kept well under pH 12.0 and water bath at 50℃ for 3 min. Under the optimal conditions，the standard curve was linear in the range of 0-15 mg/L for DMA with a detection limit of 6 mg/kg，the regression equation of the concentration(x) and the absorbance(y) of DMA wasy=0.057 4x-0.005 7 and correlation coefficient wasR2=0.999 7. The average recoveries for DMA at three spike levels for six different kinds of aquatic products were in the ranges of 86.7%-99.2%，with relative standard deviations (RSD) of 1.36%-4.78%. Therefore，this method is simple，and the result is reproducible and sensitive. Therefore, it is suitable for common laboratory usage.

dimethylamine; aquatic products; spectrophotometry

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705034

碩士,副研究員(楊賢慶研究員為通訊作者，E-mail：yxqgd@163.com)。

廣東省科技計劃項目(2013B021100013)；國家“十二五”科技支撐計劃項目(2015BAK36B06，2015BAD17B03-1)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(2016TS05，2016TS11)

2016-07-22，改回日期：2016-10-07