葉超群 王曉藝 常維山

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271000②山東省煙臺(tái)市牟平區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站）

泰安一兔養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌耐藥性的檢測(cè)

葉超群①王曉藝②常維山①

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271000②山東省煙臺(tái)市牟平區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站）

本試驗(yàn)旨在了解泰安寧陽(yáng)地區(qū)兔養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌的流行情況與耐藥性。在2017年3月份從泰安寧陽(yáng)一兔養(yǎng)殖場(chǎng)采集20份腹瀉兔子的肛門棉拭子。采集后的樣品經(jīng)選擇培養(yǎng)基并對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色、生化鑒定和16srRNA分離鑒定大腸桿菌后，采用紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)檢測(cè)其對(duì)常用14種抗生素的敏感性以表明兔源大腸桿菌分離菌株的耐藥性。本試驗(yàn)檢測(cè)了兔源大腸桿菌分離菌株中24種耐藥基因的存在情況，試驗(yàn)檢出與編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)的blaTEM和blaCTX-M基因，這兩個(gè)基因的檢出率最高，這與頭孢類抗生素在兔養(yǎng)殖業(yè)里被普遍的使用有關(guān)。本試驗(yàn)分析兔養(yǎng)殖場(chǎng)中大腸桿菌的耐藥特點(diǎn)，為臨床合理選擇抗生素提供了可以借鑒的初步依據(jù)，對(duì)以后在臨床工作中能更全面的防治大腸桿菌所引發(fā)的感染，從而更有針對(duì)性的做出預(yù)防對(duì)策。

大腸桿菌 耐藥基因 檢測(cè)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)也稱為大腸桿菌，是在1885年由德國(guó)細(xì)菌學(xué)家Escherich分離得到的。大腸桿菌屬于革蘭氏染色陰性、無(wú)芽孢的中等大小直桿菌，它的大小為(0.4～0.7)μm×(2～3)μm，其菌體兩端鈍圓，多單個(gè)散在或者成對(duì)排列(Changqingetal.，2001)。從1928年發(fā)現(xiàn)青霉素后，各類抗生以及化學(xué)合成抗菌藥不斷的被開發(fā)和使用，雖然抗生素在治療人和畜禽的疾病方面產(chǎn)生了重要的作用，但由于近幾十年以來(lái)，抗生素被廣泛和持續(xù)的使用，在加上不科學(xué)的使用抗生素，使用時(shí)劑量不足或不規(guī)范造成抗生素殘留等問(wèn)題，細(xì)菌的耐藥性開始產(chǎn)生，耐藥菌株也相應(yīng)的迅速出現(xiàn)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性傳播。尤其是在畜禽養(yǎng)殖業(yè)上，一些養(yǎng)殖戶和小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)將某些抗生素作為飼料添加劑加入到日常的飼料或飲水中，在這種特定的抗性選擇壓力下，病原菌對(duì)這些拌料使用的抗生素產(chǎn)生的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，這些病菌對(duì)抗生素的耐藥水平也越來(lái)越高。(Threfall et al.，1993)。細(xì)菌耐藥基因一方面是由其染色體攜帶，并通過(guò)染色體垂直傳播。另一方面也可以通過(guò)細(xì)菌可遺傳因子進(jìn)行傳播。耐藥基因通過(guò)其攜帶后再進(jìn)行下一步的融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化，在不同種屬的遺傳物質(zhì)之間轉(zhuǎn)移或者進(jìn)行集聚重排由此細(xì)菌耐藥性開始較為廣泛的傳播。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)中所需要用到的革蘭染色液、腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定盒、試驗(yàn)用藥敏紙片都購(gòu)買于杭州濱和微生物試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient Agar Medium)、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)、麥康凱培養(yǎng)基(Maconkey Agar)、SS瓊脂培養(yǎng)基都購(gòu)買青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)中所用的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；PCR反應(yīng)所需試劑TaqDNA聚合酶、10xPCRBuffer、dNTP和DNAMarker DL 2000等均購(gòu)自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理 2016年2月到5月，從泰安寧陽(yáng)地區(qū)發(fā)病兔養(yǎng)殖場(chǎng)場(chǎng)各采20份發(fā)病兔子糞便樣品(肛門棉拭子)，將采集到的共60份病兔糞便樣品裝入無(wú)菌密封袋中，放置在裝有冰袋的實(shí)驗(yàn)室專用泡沫盒內(nèi)。隨后將糞便樣品在24h內(nèi)低溫送到實(shí)驗(yàn)室，再進(jìn)行對(duì)樣品中大腸桿菌的分離鑒定。

1.2.2 大腸桿菌的分離純化及鑒定 增菌：將2g左右的糞便放入滅好菌的LB液體培養(yǎng)基試管內(nèi)進(jìn)行搖菌，在37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)12h。劃線分離：將接種環(huán)在酒精燈外焰下燒至發(fā)紅，待冷卻后蘸取菌液，采用三線法將菌液接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上，然后放置到37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h，可在培養(yǎng)8h左右時(shí)先觀察一次菌落，繼續(xù)培養(yǎng)后仔細(xì)觀察培養(yǎng)基上細(xì)菌的形態(tài)，接著挑取疑似菌落進(jìn)行下一步的生化鑒定試驗(yàn)。經(jīng)生化鑒定后進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)，經(jīng)16srRNA方法鑒定。

1.2.3 藥敏實(shí)驗(yàn) 采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的KB法檢測(cè)14種常用抗菌藥物的敏感性(環(huán)丙沙星、氯霉素、萘啶酸、阿莫西林棒酸、妥布霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、慶大霉素、復(fù)方新諾明、亞胺培南、四環(huán)素、氨芐西林、頭孢西叮、阿米卡星)。本試驗(yàn)用大腸埃希菌ATCC25922作為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株。

1.2.4 耐藥基因的檢測(cè) （1）細(xì)菌培養(yǎng)：取保存的大腸桿菌菌種，三線法接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落接種到LB培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)18h。（2）細(xì)菌DNA提?。篜CR引物的設(shè)計(jì)：依據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，下列引物的合成都是由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列見表1。（3）PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系由以下成分組成：12.5μl PremixTaq酶、模板DNA2μl、上下游引物各1μl、滅菌去離子水8.5μl，反應(yīng)體系共25μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min，4℃預(yù)冷3min。各擴(kuò)增程序中，退火溫度依據(jù)擴(kuò)增用引物的Tm的不同而定異；（4）PCR產(chǎn)物電泳鑒定：將PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物加入到1%的瓊脂糖凝膠的加樣孔中，然后再進(jìn)行電泳(1xTAE為電泳緩沖液，EB染色，3V/cm條件下電泳1h)，以DL2000 DNA Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，將電泳結(jié)果在紫外分析儀上曝光并保存結(jié)果；（5）結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析：依據(jù)試驗(yàn)的記錄結(jié)果統(tǒng)計(jì)出每個(gè)基因的陽(yáng)性個(gè)數(shù)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

表1 耐藥基因序列(部分)

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌的分離鑒定結(jié)果

本試驗(yàn)從泰安寧陽(yáng)地區(qū)一兔養(yǎng)殖場(chǎng)采集20份腹瀉兔子的肛門棉拭子。經(jīng)分離鑒定得到20株非重復(fù)的大腸桿菌。大腸桿菌接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)18～24h后，在培養(yǎng)基表面能看到不產(chǎn)生色素、形狀為圓形、表面有微微凸起、邊緣整齊、半透明灰白色的菌落，形狀為中等大小。在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成黑色帶金屬閃光的光滑性菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其生長(zhǎng)后形成紅色菌落。將大腸桿菌接種到液體培養(yǎng)基里面生長(zhǎng)培養(yǎng)18～24h后，能見到試管內(nèi)部的菌液混濁，在試管的底部有黏性沉淀存在并在試管液面的管壁上形成一圈肉眼能看見的菌環(huán)個(gè)別致病菌株在血瓊平板上出現(xiàn)β溶血。根據(jù)《伯杰氏手冊(cè)》上面有關(guān)于大腸桿菌鑒定，菌株都符合大腸桿菌的生化特性。經(jīng)16srRNA鑒定后將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，均與大腸桿菌屬的序列同源性為99%以上。由此判斷經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基和生化試驗(yàn)篩選出來(lái)的是大腸桿菌。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

20株兔源大腸桿菌分離菌株對(duì)14種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥，相比較來(lái)看，該養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌分離菌株對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高，對(duì)萘啶酸、氨芐西林的耐藥率還是比較高的，對(duì)復(fù)方新諾明、氯霉素這抗菌兩種藥物的耐藥率次之。對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、亞胺培南、阿米卡星這四種藥物敏感幾乎都不產(chǎn)生耐藥。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 大腸桿菌耐藥基因的擴(kuò)增結(jié)果

圖1 大腸桿菌 blaTEM 基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3.2 大腸桿菌耐藥基因的統(tǒng)計(jì)結(jié)果 利用PCR技術(shù)檢測(cè)了20株兔源大腸桿菌分離菌株對(duì)24種耐藥基因的攜帶情況。此外blaSHV、blaOXA、blaPSE、qnrA、qnrB、qepA、aac(3′)-I、aph(3′)-IV、ant(2”)、tetA和catB基因的檢出率為零。檢出率最高的是β內(nèi)酰胺酶類的兩種耐藥基因，分別是blaTEM(100%)和blaCTX-M(95%)。qnrS和aac(6′)-Ib-cr耐藥基因的檢出率分別是5%和10%。aac(3)-Ⅱ耐藥基因的檢出率為15%。有2株大腸桿菌檢測(cè)出tetB耐藥基因，檢出率為10%?；前奉惸退幓?sul-1、sul-2、sul-3)結(jié)果顯示：有8株大腸桿菌檢測(cè)出sul-2耐藥基因的，檢出率為40%。氯霉素耐藥基因cmlA和flor耐藥基因的檢出率分別是5%和10%。

表3 耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)從泰安寧陽(yáng)地區(qū)一兔養(yǎng)殖場(chǎng)采集20份腹瀉兔子的肛門棉拭子。經(jīng)分離鑒定得到20株非重復(fù)的大腸桿菌。（1）從試驗(yàn)結(jié)果可知，從泰安寧陽(yáng)地區(qū)分離的20株兔源大腸桿菌分離菌株對(duì)14種抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥。20株兔源大腸桿菌分離菌株對(duì)阿莫西林棒酸、妥布霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、阿米卡星、頭孢西叮、亞胺培南這7種藥物表現(xiàn)為敏感，其原因可能是在獸醫(yī)臨床應(yīng)用方面者四種藥物使用較少或者時(shí)間上較晚導(dǎo)致。其中頭孢他啶對(duì)細(xì)菌的作用較強(qiáng)但其對(duì)鈍化酶穩(wěn)定，所以在一定程度上敏感率是較高的。分離菌株對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、萘啶酸、復(fù)方新諾明、氯霉素、環(huán)丙沙星等藥物耐藥性具有耐藥性，究其原因可能與在臨床用藥方面這幾種藥物使用的時(shí)間早且與使用廣泛有關(guān)，而四環(huán)素屬于在應(yīng)用時(shí)間上較晚且劑量上面較少的抗菌藥物，但細(xì)菌對(duì)四環(huán)素已表現(xiàn)出較高的耐藥性。與此同時(shí)喹諾酮類藥物是在臨床用藥方面應(yīng)用比較晚的一種廣譜抗菌藥物，而它的耐藥性也已經(jīng)開始不斷的產(chǎn)生。這表明了動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的適應(yīng)性較強(qiáng)，也提醒在獸醫(yī)臨床用藥方面抗菌要去的選擇并不是越新的藥物效果就越好。因此，臨床用藥方面應(yīng)該根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果科學(xué)的選擇針對(duì)病原菌的抗菌藥物。在聯(lián)合用藥方面，最好與沒有交叉耐藥性的藥物進(jìn)行配合使用，并做到劑量科學(xué)。在療程上時(shí)間要充足并盡可能控制和推遲大腸桿菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，在一定程度上提高藥物防治大腸桿菌的效果。（2）在耐藥基因的檢測(cè)中檢出與編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)的 blaTEM和blaCTX-M基因，這兩個(gè)基因的檢出率最高，這與頭孢類抗生素在兔養(yǎng)殖業(yè)里被普遍的使用有關(guān)，也有相關(guān)的報(bào)道稱(RotimiVO，2008)頭孢類的耐藥菌株已經(jīng)出現(xiàn)，并且耐藥性率逐年升高，由此說(shuō)明了該養(yǎng)殖場(chǎng)具有對(duì)頭孢菌素產(chǎn)生耐藥性的潛能，應(yīng)該要引起注意。在耐藥基因的檢測(cè)中磺胺類的耐藥基因sul-2的檢測(cè)率較高為40%，這說(shuō)明泰安地區(qū)兔源大腸桿菌分離菌株對(duì)磺胺類藥物不敏感，其耐藥性也較高。坤清芳等(馮雯雯，2016)對(duì)兔源大腸桿菌喹諾酮基因中qnrS和aac(6′)-Ib-cr 基因的檢出率分別為59.8%和80.4%，本試驗(yàn)中對(duì)qnrS和aac(6′)-Ib-cr 基因的檢出率分別為5%和10%。本次檢測(cè)出的幾種喹諾酮基因檢出率均較低，表明該養(yǎng)殖場(chǎng)兔源大腸桿菌中流行的PMQR基因多樣性較低，細(xì)菌的耐藥基因在一定程度上存在很大的差異，究其原因這可能與地域差異性和不同的養(yǎng)殖情況有關(guān)。

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S852.61+2

A

1007-1733(2017)06-0004-03

2017–05–01）