鄒德輝 盧宗孝 晏珺 陳玉佩 劉通 陳冬荔 張佳怡 許玥 白玉琢 張莉 霍則軍

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電針“委中”對大鼠腰多裂肌損傷后LIF、IL-17表達的影響

鄒德輝 盧宗孝 晏珺 陳玉佩 劉通 陳冬荔 張佳怡 許玥 白玉琢 張莉 霍則軍

目的 觀察電針“委中”對大鼠腰多裂肌損傷后組織形態(tài)學(xué)變化以及對骨骼肌肌肉因子白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、骨骼肌損傷前炎癥因子白介素17(interleukin，IL-17)表達含量的影響。 方法 將90只雄性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、模型對照組、電針委中組、電針腎俞組，每組18只。每組再隨機分為1天、3天、7天三個時間點。麻醉后于雙側(cè)L4-5多裂肌注射0.5%布比卡因溶液復(fù)制多裂肌損傷模型，通過光鏡觀察分析造模后多裂肌形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。通過ELISA和免疫組化觀察1天、3天、7天多裂肌LIF、IL-17表達含量的動態(tài)時相變化。 結(jié)果 造模后，與空白組比較，模型組不同時間點的LIF及IL-17表達含量均明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，電針委中和電針腎俞組的IL-17表達含量有所降低(P<0.01)，而LIF的表達含量有所增加(P<0.01)；與電針腎俞組比較，電針委中組在1天后下調(diào)IL-17的表達含量更明顯(P<0.05)，在3天、7天后上調(diào)LIF的作用更顯著(P<0.05)。結(jié)論 電針委中可促進IL-17的表達下調(diào)，減輕炎癥反應(yīng)的程度，同時可增加LIF的表達含量，促進骨骼肌中葡萄糖的攝取，利于骨骼肌修復(fù)。

多裂?。?損傷修復(fù)； 炎癥因子； 白血病抑制因子； 白介素17

多裂肌是位于脊柱最內(nèi)側(cè)且附著面積最大的椎旁肌，腰骶段的多裂肌對腰椎的動力性穩(wěn)定起到80%以上的重要作用[1]。一旦腰多裂肌發(fā)生損傷、萎縮及功能紊亂，就可能導(dǎo)致腰椎失穩(wěn)引發(fā)腰痛。骨骼肌損傷后需經(jīng)歷炎癥(壞死)、修復(fù)與再生等3個病理階段[2]。早期的炎癥反應(yīng)過程與骨骼肌的修復(fù)和再生密切相關(guān)。骨骼肌損傷后肌細胞能夠分泌上百種分泌蛋白，包括幾十種生長因子、細胞因子和金屬肽酶等，這些蛋白質(zhì)能有效調(diào)節(jié)骨骼肌細胞及其他組織和細胞的功能[3-4]。 Pedersen等[5]將這些由骨骼肌細胞產(chǎn)生、分泌到細胞外并具有內(nèi)分泌功能的細胞因子、肽等稱為肌肉因子。已往的研究發(fā)現(xiàn)一些肌肉因子與骨骼肌自身的損傷修復(fù)和再生有關(guān)，如胰島素樣生長因子1、機械生長因子、肌肉抑制素、白介素6等都參與了骨骼肌的損傷修復(fù)和再生[6-9]。白血病抑制因子(leukaemia inhibi-tory factor，LIF)也是一種肌肉因子[10-11]，在骨骼肌的損傷修復(fù)和再生中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。因此，本實驗擬從骨骼肌損傷后的前炎癥因子白介素17(interleukin，IL-17)和骨骼肌肌肉因子LIF表達含量變化的角度進一步探討電針“委中”穴對多裂肌的損傷修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級健康成年雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量280～320 g，由維通利華實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。所有大鼠按體質(zhì)量分層，采用隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、模型對照組、電針委中組、電針腎俞組，每組18只。每組大鼠再隨機分為1天、3天、7天三個時間點，每個時間點6只大鼠。

1.2 主要儀器和試劑

半自動化石蠟切片機(RM2245，德國萊卡儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(SKP-02.600，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)；正置智能型顯微鏡及采集系統(tǒng)(BX53，奧林巴斯，中國有限公司)；韓式電針儀(HANS-200A，北京思盛達醫(yī)療器械中心)。

布比卡因(美國Sigma，生產(chǎn)批號：B5274-1G)；10%水合氯醛(北京歐北生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：OB12365)；40%多聚甲醛溶液(北京蘭博利德，生產(chǎn)批號：P4500)；大鼠白血病抑制因子酶聯(lián)免疫試劑盒、大鼠白介素17酶聯(lián)免疫試劑盒(北京鼎國生物科技有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號：CSB-E07432r、CSB-EL011601RA)；大鼠白血病抑制因子抗體、白介素17抗體(美國Santa，生產(chǎn)批號：N-18、E-19)。

1.3 動物模型制備

模型組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，選擇脊柱L4、L5水平兩旁的4個點，使用一次性4號針頭注射器抽取0.5 %布比卡因肌肉注射400 μL(100 μL×4)，針頭緊貼棘突旁進入肌肉，直到接觸關(guān)節(jié)突和乳突所在的骨面回抽套管1 mm無血，表明針頭已到達多裂肌，各點分別注射布比卡因100 μL，時間不得小于3秒，以利于藥物的吸收。單次注射完成造模。模型對照組采用同樣方法注射生理鹽水，空白組不做任何處理。

1.4 干預(yù)方法

空白組不做任何處理。模型對照組、模型組：與電針組同步抓取、固定，不進行針刺干預(yù)。參照《實驗針灸學(xué)》[14]常用實驗動物穴位圖譜，電針委中組：選取雙側(cè)“委中”(膝關(guān)節(jié)背面正中)；電針腎俞組：選取雙側(cè)“腎俞”(第2腰椎旁開7 mm)。將大鼠固定后，暴露后肢。采用華佗牌0.30×15 mm一次性針灸針，直刺進針后連接韓式電針儀，選用疏密波，頻率2/10 Hz，電流強度 1～2 mA，持續(xù)20分鐘，每天1次，3個亞組分別治療1天、3天、7天。

1.5 取材方法

各組分別在造模后的第1天、3天、7天同步取材6只。10 %水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，剔除背部皮毛、筋膜，充分暴露腰部肌肉，剝離最長肌和髂肋肌，銳性切取L4和L5水平多裂肌組織，左側(cè)多裂肌置于40 g/L多聚甲醛溶液固定，取右側(cè)約1 mm×1 mm×1 mm多裂肌迅速置于液氮固定，操作過程保證無菌。

1.6 樣本處理

1.6.1 HE染色 左側(cè)多裂肌經(jīng)40 g/L多聚甲醛溶液固定滿意之后，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，然后對切片進行二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗；蘇木精染色5分鐘，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化10秒，自來水沖洗10分鐘，置于伊紅液2分鐘，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，再脫水、透明，封固。光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化。

1.6.2 免疫組化法及酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠多裂肌LIF、IL-17的表達 免疫組化：60℃烤片6小時，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，熱修復(fù)抗原，PBS沖洗，過氧化氫封閉10分鐘，滴加一抗，4℃孵育16小時，加二抗，DAB顯色，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)棕黃色后即把切片放入自來水沖洗終止反應(yīng)，復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、采集圖像，采用Imageprofessional Plus 6.0軟件進行圖像分析。LIF、IL-17的結(jié)果判讀方法：LIF、IL-17的陽性染色模式為胞漿著色，呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒；染色判斷標準：陰性胞漿未見著色，弱陽性胞漿內(nèi)顆粒較細，呈淡黃色，顯色高于背景，強陽性胞漿內(nèi)陽性顆粒粗而多，呈棕黃色甚至棕褐色，顯色明顯高于背景。光鏡下，全視野無偏采樣方法，每張切片選取5個視野，進行圖像分析，測量每個視野中LIF、IL-17陽性表達區(qū)域的平均光密度值(mean optical density，MOD)，取平均值為該樣本MOD值。酶聯(lián)免疫吸附法：多裂肌上清液采用雙抗體夾心ELISA方法，參照試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)變化

空白組：縱切面可見排列緊密、規(guī)律的縱向肌纖維，肌纖維粗細均勻，肌間隙大小基本一致，可見有若干個胞核分布于每個肌纖維膜下。橫切面可見肌細胞呈較為規(guī)則的多邊形，大小均勻，排列整齊，肌間隙大小一致，一個或數(shù)個胞核位于細胞的邊緣。見圖1AB。

模型對照組：縱切面和橫切面觀察均與空白組類似，偶見細胞間質(zhì)輕微水腫，肌纖維排列仍整齊，形態(tài)未見明顯異常。見圖1CD。

模型組：縱切面可見肌纖維有斷裂，排列不齊，肌細胞出現(xiàn)少量損傷壞死，肌間隙有炎細胞浸潤。橫切面可見肌細胞大小不一，形態(tài)各異，有明顯的壞死，肌間隙有大量的炎細胞分布。見圖1EF。

注： A.空白組(縱切面)；B.空白組(橫切面)； C.模型對照組(縱切面)；D.模型對照組(橫切面)； E.模型組(縱切面)；F.模型組(橫切面)

圖1 各組大鼠腰多裂肌1天HE染色(×100)

2.2 免疫組化法檢測大鼠多裂肌IL-17及LIF的表達

結(jié)果如表1所示，針刺1天：與模型組比較，委中組、腎俞組IL-17表達含量減少(P<0.01)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；針刺3天：與模型組比較，委中組、腎俞組 IL-17表達含量減少(P<0.01，P<0.05)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；針刺7天：與模型組比較，模型對照、委中、腎俞組IL-17表達含量減少(P<0.01)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠不同時段腰多裂肌IL-17表達免疫組化染色結(jié)果見圖2。

注：A.空白組;B.模型對照組;C.模型組1天;D.電針委中組1天;E.電針腎俞組1天;F.模型組3天;G.電針委中組3天; H.電針腎俞組3天;I.模型組7天;J.電針委中組7天; K.電針腎俞組7天

圖2 各組大鼠不同時段腰多裂肌IL-17表達免疫組化染色(×100)

表1 各組大鼠不同時段多裂肌IL-17表達MOD值比較

注： 與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01,cP<0.05；與電針腎俞組比較，dP<0.05。

結(jié)果如表2顯示，針刺1天：與空白組比較，模型組、委中組、腎俞組LIF表達含量迅速增加(P<0.01)，模型對照組表達含量有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，委中組、腎俞組LIF表達含量增加(P<0.01)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；針刺3天：與空白組比較，模型組、委中組、腎俞組LIF表達含量增加(P<0.01)，模型對照組表達含量增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，委中組LIF表達含量升高(P<0.01)，腎俞組表達含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量升高(P<0.01)；針刺7天：與空白組比較，對照、模型、委中、腎俞組LIF表達含量增加(P<0.01)；與模型組比較，委中組LIF表達含量增加(P<0.01)，腎俞組表達含量降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各組大鼠不同時段腰多裂肌LIF表達免疫組化染色結(jié)果見圖3。

表2 各組大鼠不同時段多裂肌LIF表達MOD值比較

注： 與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01,cP<0.05；與電針腎俞組比較，dP<0.05。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠多裂肌IL-17和LIF的表達

注：A.空白組;B.模型對照組;C.模型組1天;D.電針委中組1天;E.電針腎俞組1天;F.模型組3天;G.電針委中組3天; H.電針腎俞組3天;I.模型組7天;J.電針委中組7天; K.電針腎俞組7天

圖3 各組大鼠不同時段腰多裂肌LIF表達免疫組化染色(×100)

結(jié)果如表3所示，針刺1天：與空白組比較，模型組、腎俞組IL-17表達含量增加(P<0.01)；與模型組比較，模型對照組、委中組IL-17表達含量減少(P<0.01)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量減少(P<0.05)；針刺3天：與空白組比較，模型對照組、模型組、腎俞組IL-17表達含量增加(P<0.01)；委中組IL-17(P<0.05)；與模型組比較，委中組IL-17表達含量減少(P<0.01)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量減少，但差異統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；針刺7天：與空白組比較，模型對照、模型、委中、腎俞組IL-17表達含量增加(P<0.01)；與模型組比較，模型對照、委中、腎俞組IL-17表達含量減少(P<0.01)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠不同時段多裂肌IL-17表達量比較

注： 與空白組比較，aP<0.01,bP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與電針腎俞組比較，dP<0.05。

結(jié)果如表4所示，針刺1天：與空白組比較，模型組、委中組、腎俞組LIF表達含量迅速升高(P<0.01)，模型對照組表達含量有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，委中組、腎俞組LIF表達含量升高(P<0.01、P<0.05)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；針刺3天：與空白組比較，模型組、委中組、腎俞組LIF表達含量增加(P<0.01)，模型對照組表達含量增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，委中組LIF表達含量升高(P<0.01)，腎俞組表達含量降低(P>0.05)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量升高(P<0.01)；針刺7天：與空白組比較，對照、模型、委中、腎俞組LIF表達含量增加(P<0.01)；與模型組比較，委中組LIF表達含量增加(P<0.01)，腎俞組表達含量降低(P>0.05)；與電針腎俞組比較，委中組表達含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表4 各組大鼠不同時段多裂肌LIF表達量比較

注： 與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01,cP<0.05；與電針腎俞組比較，dP<0.01,eP<0.05。

3 討論

骨骼肌損傷后，炎性壞死組織的降解和吸收以及肌纖維的修復(fù)和再生是“祛邪”“生新”的過程，針刺能疏通經(jīng)絡(luò)、行氣活血、祛瘀生新，促進組織的修復(fù)和再生。電針是臨床上治療骨骼肌損傷的重要手段，在輔助針刺鎮(zhèn)痛和促進骨骼肌損傷修復(fù)中療效較佳。委中和腎俞是臨床治療腰痛使用頻率最高的前兩位效穴[15]?！把澄星蟆笔恰端目傃ǜ琛穼ξ兄委熝刺禺愋辕熜У慕?jīng)典總結(jié)。作為膀胱經(jīng)的下合穴，委中穴在臨床上多用來治療急性腰扭傷、脊柱強直、坐骨神經(jīng)痛、腰椎間盤突出癥等急性腰背痛；而腎俞穴是治療腰痛的局部取穴，也是腎的背俞穴，多用來治療慢性腰肌勞損，腎虛腰痛、慢性疲勞綜合征等慢性病癥。

骨骼肌損傷后，首先在損傷的局部出現(xiàn)肌纖維結(jié)構(gòu)的破壞、變性和壞死，之后炎癥細胞和致炎因子浸潤至損傷部位。IL-17是由TH17細胞分泌的一種強有力的前炎癥細胞因子，具有強大的募集中性粒細胞及促進多種炎性細胞因子釋放的作用，可以激活以及刺激巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞產(chǎn)生多種致炎因子，包括白介素-1、白介素-6、腫瘤壞死因子α、化學(xué)增活素、金屬蛋酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶等[16]，從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。本實驗結(jié)果顯示多裂肌損傷后模型組IL-17大量表達，且呈現(xiàn)不同時相的遞增趨勢，電針組可明顯降低IL-17含量的表達，且電針委中組降幅最大，這說明電針委中組在骨骼肌損傷早期可能通過下調(diào)前炎癥因子IL-17的過度表達，降低炎癥反應(yīng)的劇烈程度，縮短肌細胞壞死的進程，從而發(fā)揮“祛邪”“生新”的作用，促進骨骼肌修復(fù)。

骨骼肌是人體最大的內(nèi)分泌器官，骨骼肌損傷后，其分泌的肌肉因子可通過自分泌或旁分泌的形式作用于骨骼肌或者其他的組織和器官[8-9]。目前發(fā)現(xiàn)的肌肉因子包括白介素-6、白介素-15、肌肉素、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等[7,16]。作為白介素-6家族的重要成員，LIF在促進骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖[18]、促進骨骼肌中葡萄糖的攝取[19-20]，以及促進骨骼肌損傷修復(fù)[11]和加速骨骼肌再生[17]方面有重要作用。

在完整未損傷的小鼠[21]和人類[22]骨骼肌中LIF mRNA的表達量非常低，在創(chuàng)傷和肌營養(yǎng)不良的肌肉中其表達量顯著升高[23-24]。Srikuea等[25]發(fā)現(xiàn)wistar大鼠腓腸肌挫傷后3小時，LIF mRNA是非損傷對照組的7倍，LIF mRNA在腓腸肌挫傷后6 小時的表達量是非挫傷對照組的9倍，之后它的表達量緩慢下調(diào)。本實驗結(jié)果顯示：造模1、3、7天后，空白組LIF表達含量較低，而模型對照組、模型組、電針委中組、電針腎俞組的LIF表達含量出現(xiàn)先增高后緩慢下調(diào)的趨勢與Srikuea的研究一致，其中電針組的LIF表達含量高于模型組，電針委中組高于電針腎俞組，說明電針委中和電針腎俞均可促進LIF含量的表達，參與肌肉的損傷修復(fù)，但電針委中組作用更佳。

綜上，電針干預(yù)治療可下調(diào)IL-17的過度表達，減輕炎癥反應(yīng)的劇烈程度，縮短骨骼肌壞死進程；電針干預(yù)可促進LIF的適度表達，促進骨骼肌中葡萄糖的攝?。浑娽樜性诠趋兰p傷早期可減輕肌纖維壞死程度，促進肌纖維的有序排列，加速損傷肌纖維的再生，這為骨骼肌損傷早期針刺遠端取穴療效優(yōu)于局部取穴提供重要依據(jù)。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effects of electroacupuncture “Weizhong” (BL 40) on the expression of LIF and IL-17 in rats with multifidus muscle injury

ZOUDehui，LUZongxiao，YANJun，etal.

Acupuncture-MoxibustionandTuina，BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Beijing100029，China

ZHANGLi，E-mail:zhangli1572@sina.com

Objective To observe the effect of electroacupuncture (EA) stimulate at “Weizhong”(BL 40) on the expression of leukaemia inhibi-tory factor(LIF)and interleukin-17(IL-17)in rats with multifidus muscle injury.Methods A total of 90 rats were randomly divided into blank group, model control group, model group, EA “Weizhong”(BL 40) group and a EA “Shenshu”(BL 23) group, 18 rats in each group. Each group was randomly divided into a 1-day subgroup, a 3-day subgroup and a 7-day subgroup again, 6 rats in each subgroup. Both sides of multifidus muscle (L4 and L5) were injected with 0.5% bupivacaine. The morphological and ultrastructural changes of multifidus muscle were observed and analyzed with light microscope at 1st, 3rd, 7th day after model establishment. The expression of leukaemia inhibi-tory factor(LIF)and interleukin-17(IL-17)was measured by immunohistochemical method and elisa method.Results After modeling, compared with the blank group, the expression of LIF and IL-17 in multifidus muscle of model group was significantly increased(P<0.01); Compared with the model group, the expression of the LIF were significantly increased(P<0.01) and the expression of IL-17 in multifidus muscle was significantly decreased(P<0.01) in the EA “Weizhong” group and EA “Shenshu” group. Compared with EA “Shenshu” group, the expression of the IL-17 in multifidus muscle was significantly decreased at 1th day; the expression of LIF was significantly increased at 3th day and 7th day. Conclusion EA “Weizhong”(BL 40) can increase the expression of LIF and decrease the expression of IL-17, and can reduce inflammatory reaction and promote skeletal muscle glucose uptake, so as to be beneficial to skeletal muscle repair.

Multifidus muscle; Damage respair; Inflammatory factor; Leukaemia inhibitory factor; Interleukin-17

國家自然科學(xué)基金面上項目(81574052)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院[鄒德輝(碩士研究生)、盧宗孝(碩士研究生)、晏珺(碩士研究生)、陳冬荔(碩士研究生)、張佳怡(碩士研究生)、許玥(碩士研究生)、陳玉佩(博士研究生)、白玉琢(博士研究生)、張莉]；廣東省第二中醫(yī)醫(yī)院(劉通)；北京大學(xué)第三醫(yī)院中醫(yī)科(霍則軍)

鄒德輝(1989- )，2014級在讀碩士研究生。研究方向：針灸臨床作用機制研究。E-mail:1198916301@qq.com

張莉(1958- )，女，博士，教授。研究方向：針灸臨床作用機制研究。E-mail:zhangli1572@sina.com

R245

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.012

2016-10-19)