李雪嵩 ， 董文龍 ， 王 羽 ， 張紅偉 ， 張喜慶 ， 馬紅霞 ， 高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118)

山羊源偽中間葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性檢測(cè)

李雪嵩 ， 董文龍 ， 王 羽 ， 張紅偉 ， 張喜慶 ， 馬紅霞 ， 高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118)

偽中間葡萄球菌是一種常見的致病菌，多引起寵物不同程度感染。2016年3月初，吉林省某羊場(chǎng)育肥羊出現(xiàn)零星死亡，病羊主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀。采集病羊呼吸系統(tǒng)各器官，以進(jìn)行細(xì)菌的分離、培養(yǎng)。分離菌株經(jīng)培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化試驗(yàn)及16S rDNA序列分析，確定為偽中間葡萄球菌，其對(duì)小鼠有致病性。對(duì)分離到的菌株通過微量稀釋法進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，結(jié)果顯示，對(duì)慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素耐藥；對(duì)阿米卡星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星敏感。

山羊 ； 偽中間葡萄球菌 ； 分離鑒定 ； MIC

Correspouding author:GAO Yun-hang

偽中間葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius，SP.)是2005年由Devriese等[1]發(fā)現(xiàn)并命名的，它是一種新的凝固酶陽性葡萄球菌，可引起寵物犬、貓等多種感染性疾病，如犬膿皮病、傷口感染、外耳道炎以及尿道感染等[2]。2016年3月初，吉林省某山羊場(chǎng)育肥羊發(fā)生以呼吸道癥狀為主的疾病，病羊出現(xiàn)零星死亡。作者從病死羊內(nèi)臟分離得到1株細(xì)菌，通過鑒定，確定為偽中間葡萄球菌。本研究對(duì)分離出的偽中間葡萄球菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以期對(duì)由該菌引起的疾病在臨床治療和用藥方面起到一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 病料來源 吉林省某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病山羊，剖檢取病變呼吸系統(tǒng)各器官，進(jìn)行病原微生物分離培養(yǎng)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 TSA固體培養(yǎng)基、胎牛血清、TSB液體培養(yǎng)。DNA Marker DL-2 000、10×Buffer、d NTP Mixtur、ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T vector、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、切膠回收試劑盒，購自寶生物工程(大連)服務(wù)有限公司?；前烽g甲氧嘧啶、頭孢氨芐、阿奇霉素、恩諾沙星、力霉素、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、氟苯尼考、阿莫西林、環(huán)丙沙星等12種抗菌藥物，均購自北京海洋醫(yī)藥化工生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16只健康體重30 g昆明系小鼠，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)里無菌分離病原菌，分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和TSA固體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)及菌落形態(tài)。

1.5 涂片鏡檢 用接種環(huán)挑取上述培養(yǎng)得到的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，隨后鏡檢。

1.6 生化鑒定 取上述的24 h純培養(yǎng)物分別接種到PYR、V-P、甘露醇、精氨酸、木糖、棉子糖、七葉苷、麥芽糖、蕈糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨醇培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果并記錄。試驗(yàn)結(jié)果參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行對(duì)比。

1.7 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 挑取純培養(yǎng)物的單個(gè)菌落，接種于TSB液體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)，37 ℃搖菌18～24 h。所得菌液分別接種8只健康實(shí)驗(yàn)小鼠，腹腔注射菌懸浮液0.2 mL/只。選用8只健康小鼠腹腔注射0.2 mL TSB液體培養(yǎng)基，作為陰性對(duì)照。觀察死亡情況，剖檢死亡小鼠，觀察病變，采集病料并進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.8 分離菌株16S rDNA基因序列測(cè)定 取1.6 mL培養(yǎng)菌液12 000 r/min離心10 min，收集菌體，按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)提取DNA，提取到的基因組作為16S rDNA基因PCR擴(kuò)增模板。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫查詢，用Primer6.0設(shè)計(jì)16S rDNA引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上游引物：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′；下游引物：5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′。反應(yīng)體系：DNA模板0.5 μL，10×Buffer 3.0 μL，dNTP 2.0 μL，Ex Taq 0.2 μL，上游引物 1 μL，取2.5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與0.4 μL 6×Loading Buffer(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)混合后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。隨后將得到的PCR產(chǎn)物切膠回收，連接，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，將純化質(zhì)粒直接送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

1.9 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 將16S rDNA測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的相關(guān)核酸序列進(jìn)行Blast分析比對(duì)，并采用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.10 藥敏試驗(yàn) 選用獸醫(yī)臨床上較為常見的12種抗菌藥物，分別為強(qiáng)力霉素、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、氟苯尼考、阿莫西林、環(huán)丙沙星、磺胺間甲氧嘧啶、頭孢氨芐、阿奇霉素和恩諾沙星。采用微量稀釋法進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC值)的測(cè)定。結(jié)果參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)[3]的標(biāo)準(zhǔn)，判定其耐藥情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢。在TSA固體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)生長(zhǎng)出淡灰色、圓形、光滑、隆起、邊緣整齊的菌落(見中插彩版圖1)。

2.2 涂片鏡檢 在油鏡下觀察為革蘭陽性，球菌，單個(gè)或呈串狀排列(見中插彩版圖2)。

2.3 生化鑒定 生化試驗(yàn)結(jié)果表明， V-P、精氨酸、木糖、棉子糖、七葉苷、山梨醇為陰性反應(yīng)，而PYR、麥芽糖、蕈糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇為陽性反應(yīng)，此結(jié)果符合偽中間葡萄球菌的生化特性。

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 對(duì)照組死亡率為0%，試驗(yàn)組的死亡率為75%。剖檢死亡的小鼠并采集肺臟，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和生化試驗(yàn)，能夠得到與原分離菌株一致的病原菌。

2.5 16S rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果 以提取到的DNA為模版，利用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，得到的條帶大小約為1 500 bp，與預(yù)期大小相符，證明擴(kuò)增成功。

圖3 16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：SP. 16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物； P：表示對(duì)照菌株； N：表示陰性對(duì)照菌株

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列大小為1 512 bp，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析比對(duì)并與葡萄菌屬的其他種建立進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果顯示，該分離菌株與偽中間葡萄球菌(登錄號(hào)CP002439.2)同在一個(gè)分支，表明該分離菌株為偽中間葡萄球菌。

圖4 SP.株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 各種藥物的濃度測(cè)試范圍并分析MIC結(jié)果，根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，得出以下結(jié)果：如表1所示，本試驗(yàn)分離的偽中間葡萄球菌對(duì)慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素耐藥；對(duì)阿奇霉素處于中介；對(duì)阿米卡星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星敏感。

表1 藥敏試驗(yàn)判定結(jié)果與判定標(biāo)準(zhǔn)

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，該羊場(chǎng)育肥羊發(fā)病的主要原因是感染了偽中間葡萄球菌，從而引起了系列呼吸系統(tǒng)癥狀。通過臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室診斷，排除了病毒感染和寄生蟲感染所導(dǎo)致死亡的可能。通過16S rDNA基因分析以及生化特性可以將分離菌株鑒定為偽中間葡萄球菌。偽中間葡萄球菌作為一類重要的動(dòng)物性細(xì)菌病的病原菌，在國內(nèi)外已發(fā)表的文獻(xiàn)中，未見從山羊體內(nèi)分離得到過的報(bào)道，本研究首次從羊體內(nèi)分離得到偽中間葡萄球菌，表明在這種跨物種傳播趨勢(shì)愈演愈烈的情況下，獸醫(yī)臨床不可忽視病原微生物的跨物種傳播及變異將對(duì)養(yǎng)殖業(yè)帶來的潛在威脅[4]。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離菌對(duì)阿莫西林和頭孢氨芐表現(xiàn)為耐藥，而阿莫西林和頭孢氨芐皆屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，抗菌譜與青霉素相同[5]，對(duì)革蘭陽性球菌和桿菌作用強(qiáng)，所以認(rèn)為該養(yǎng)殖場(chǎng)在平時(shí)飼養(yǎng)中對(duì)羊常用青霉素類抗生素，從而使分離菌株對(duì)阿莫西林和頭孢氨芐耐藥。對(duì)阿米卡星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星敏感，可選擇敏感藥物進(jìn)行治療。對(duì)偽中間葡萄球菌治療較困難，其原因是對(duì)抗生素的耐藥范圍逐漸增大。Microbiol等人在2012年發(fā)表了相關(guān)研究，表明偽中間葡萄球菌對(duì)9種抗生素耐藥，這9種藥多為氨基糖苷類[6]，這也與本文所得結(jié)果相近。當(dāng)然通過藥敏試驗(yàn)所選擇的敏感類藥物在臨床應(yīng)用中也未必取得較好療效，因?yàn)榫唧w治療過程中存在太多的不確定性，要采取科學(xué)合理的治療手段才能取得好的療效[7]。

對(duì)于本病的治療，最重要的就是改善飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格實(shí)行獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督體系，提高動(dòng)物體的抵抗力能有效的預(yù)防本病傳染，加強(qiáng)圈舍環(huán)境衛(wèi)生，提高飼養(yǎng)員防控意識(shí)，完善肉羊繁殖過程中的飼養(yǎng)程序，以獲取更高的總經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

[1] Devriese L A, Vancanneyt M, Baele M,etal.Staphylococcuspseudintermediussp. nov., a coagulase-positive specieces from animals[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2005, 55: 1569-1573.

[2] 韓濤, 張曉, 吳欣,等. 貂感染偽中間葡萄球菌的診斷及藥敏試驗(yàn)[J]. 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2014, 18(1):11-14.

[3] 廖延雄. 《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》與《伯杰氏分類細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1992(4)：59.

[4] 董文龍, 王琦, 王巍,等. 山羊源犢牛摩拉菌的分離與鑒定[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2016，46(2):198-202.

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[7] 裴志花, 孫小寧, 王開. 1株羊肺源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2014, 41(6): 220-223.

Isolation,Identification and Drug Resistance ofStaphylococcus

pseudintermediusIsolated from Goat

(Animal Science and Technology College, Jilin Agriculture University, Jilin 130118, China)

Staphylococcuspseudintermediusis a common pathogenic bacterium which causes different extent infection in pets. At the beginning of March in 2016, a small number of goat deaths appeared in Jilin province, and the respiratory symptom was the main symptom of the diseased goat. Each organs of the respiratory system were collected from diseased goats for bacterial isolation and cultivation. According to the analysis of the isolated bacteria by characteristics, staining microscopy, biochemical experiment, and 16S rDNA sequence, the bacteria was identified to beStaphylococcuspseudintermediusand was highly pathogenic to mice. Drug sensitivity was performed with the isolated strains through the micro-dilution method. The isolated strains were tested with the method of micro-dilution to identify their sensitivity to medicine, and the results showed that they Were to Cerant to gentamicin, streptomycin, erythromycin, amoxicillin, sulfamonomethoxine, enrofloxacin and doxycyclin and sensitive to amikacin, florfenicol, ciprofloxacin and chloramphenicol.

Goat ;Staphylococcuspseudintermedius; Isolation and identification ; MIC

2016-11-10

吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(2015-24);吉林省動(dòng)物疾病防治研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(20111820); 國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAK19B005)

李雪嵩(1994-)，男(蒙古族)，碩士生，主要從事動(dòng)物疫病防治工作，E-mail：372238174@qq.com

高云航，E-mail：gaoyunhang@163.com

S858.27

A

0529-6005(2017)05-0098-03