趙世穎 ， 馬志軍 ， 馮金玲 ， 徐 陽(yáng) ， 徐美玉 ， 秦玉成 ， 吳德國(guó) ， 張國(guó)中1,

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 ， 北京朝陽(yáng)100101 ；3.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京朝陽(yáng)102629 ； 4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疫病診斷研究中心 ， 北京海淀100193 ；5.北京市平谷區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 ， 北京平谷101200)

1例雞傳染性鼻炎的診斷與分析

趙世穎1,2， 馬志軍3， 馮金玲4， 徐 陽(yáng)4， 徐美玉4， 秦玉成5， 吳德國(guó)2， 張國(guó)中1,4

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 ， 北京朝陽(yáng)100101 ；3.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京朝陽(yáng)102629 ； 4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疫病診斷研究中心 ， 北京海淀100193 ；5.北京市平谷區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 ， 北京平谷101200)

本研究對(duì)北京某雞場(chǎng)發(fā)生的1例雞傳染性鼻炎疑似病例進(jìn)行了診斷和分析。PCR檢測(cè)和測(cè)序分析結(jié)果顯示，該雞群存在副雞禽桿菌感染。分離菌株經(jīng)染色鏡檢、生化鑒定和致病性試驗(yàn)鑒定為副雞禽桿菌，將純培養(yǎng)獲得的菌株命名為PGSY株。血凝素基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，副雞禽桿菌PGSY株血凝素基因長(zhǎng)度為1 008 bp，與SD-1株的核苷酸同源性高達(dá)99%。但PGSY株血凝素基因序列較SD-1株缺失了30個(gè)堿基。遺傳進(jìn)化樹(shù)分析顯示，該菌株與國(guó)內(nèi)分離株SD-1屬于同一進(jìn)化分支。

副雞禽桿菌 ； 分離鑒定 ； 序列分析

雞傳染性鼻炎(Infectious Coryza)是由副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum)引起的一種急性呼吸道疾病。該病可導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋明顯下降，可并發(fā)感染其他疾病，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1987年，馮文達(dá)在北京首先分離到這一菌株[1]。近幾年雞傳染性鼻炎在我國(guó)又呈多發(fā)趨勢(shì)，且出現(xiàn)了新的流行特點(diǎn)[2]。該病的病原在2005年之前被稱(chēng)為副雞嗜血桿菌，后更名為副雞禽桿菌[3]。本研究對(duì)北京某雞場(chǎng)一例雞傳染性鼻炎疑似病例進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測(cè)與分析。

1 材料與方法

1.1 病料 來(lái)源于北京市某商品蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)，送檢病雞為165日齡。臨床表現(xiàn)發(fā)呆、拉綠色稀糞、打呼嚕、眼瞼腫脹，產(chǎn)蛋率從91%降到85%。無(wú)菌采集病雞眶下竇黏液用于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)與分析。

1.2 雞胚和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚和6周齡SPF雞，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基和主要試劑 羊血瓊脂培養(yǎng)基、半合成液體培養(yǎng)基、半合成固體培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室制備[4]。

1.4 PCR鑒定 以眶下竇分泌物提取的基因組DNA為模板，利用針對(duì)副雞禽桿菌血凝素基因的引物進(jìn)行檢測(cè)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物(5′-3′)：TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT，下游引物(5′-3′)：CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT。在滅菌的0.2 mL PCR管中加入3 μL模板cDNA，0.5 μL上游引物(20 μmol/L)，0.5 μL下游引物(20 μmol/L)，10 μL PCR Mix，6 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，65 ℃ 45 s，72 ℃30 s，循環(huán)30次，72 ℃10 min循環(huán)1次，擴(kuò)增500 bp的目的序列。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳。對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序分析。

1.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 用眶下竇內(nèi)容物劃線接種于羊血瓊脂平板，再用金黃色葡萄球菌做井字劃線，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h～48 h。挑取單個(gè)可疑菌落接種到半合成固體培養(yǎng)基上，在37 ℃厭氧環(huán)境進(jìn)行純培養(yǎng)48 h，有針尖大小菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。并挑取單個(gè)菌落接種于半合成液體培養(yǎng)基，于振蕩箱37 ℃培養(yǎng)震蕩48 h用于下一步鑒定。

1.6 生化試驗(yàn) 將振蕩培養(yǎng)的細(xì)菌懸液，接種于細(xì)菌生化微量鑒定管中，再在每只鑒定管中加入終濃度為40 μg/mL的NADH，置于5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。觀察細(xì)菌的生化特性，生化鑒定結(jié)果判定方法按照細(xì)菌生化微量鑒定管使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.7 致病性試驗(yàn) 將30只6周齡的SPF雞隨機(jī)分為2組。攻毒組15只雞經(jīng)眶下竇內(nèi)注射3.4×107CFU/0.2mL/只的菌液，對(duì)照組15只雞注射0.2 mL/只的液體培養(yǎng)基，攻毒后記錄發(fā)病情況[5-6]，并再次取眶下竇分泌物進(jìn)行PCR檢測(cè)和細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.8 血凝素基因測(cè)序分析 挑取單菌落按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取菌株DNA作為模板，采用盧冷軼設(shè)計(jì)的引物對(duì)[7]，來(lái)擴(kuò)增包含完整血凝素基因的DNA片段。反應(yīng)體系中加入3 μL模板cDNA，0.5 μL上游引物(20 μmol/L)，0.5 μL下游引物(20 μmol/L)，10 μL PCR Mix，6 μL ddH2O擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次，72 ℃ 10 min循環(huán)1次。取產(chǎn)物5 μL利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將純化回收后的產(chǎn)物與pMD18-T Easy載體連接，提取質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的其他的副雞禽桿菌血凝素基因核苷酸序列進(jìn)行比較分析。

1.9 分離株血凝素基因遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用MEGA4.0分析軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，將測(cè)定的序列與GenBank上下載的其他序列一起繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)[8]。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定 送檢病料與陽(yáng)性對(duì)照均在500 bp位置處出現(xiàn)了與預(yù)期大小相一致的DNA條帶，陰性對(duì)照未擴(kuò)增出任何片段，表明病雞存在副雞禽桿菌感染，如圖1所示。對(duì)陽(yáng)性樣品血凝素基因(hemagglutinin antigen gene)進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示與副雞禽桿菌同源性最高。

圖1 送檢病料PCR檢測(cè)結(jié)果

M:DNA Marker； P:陽(yáng)性對(duì)照； N:陰性對(duì)照； 1:送檢病料

2.2 細(xì)菌的分離和培養(yǎng) 在羊血瓊脂平板上厭氧培養(yǎng)48 h后，葡萄球菌周?chē)纬舍樇鈽哟笮〉木?，離葡萄球菌越近菌落越大，呈現(xiàn)“衛(wèi)星現(xiàn)象”，如圖2所示。在半合成固體培養(yǎng)基上，形成半透明、細(xì)小的露滴樣菌落，菌落圓潤(rùn)、光滑、邊緣整齊。

圖2 在羊血瓊脂平板上形成的“衛(wèi)星現(xiàn)象”

2.3 革蘭染色鏡檢 鏡檢發(fā)現(xiàn)該分離菌株為革蘭陰性短桿菌或球桿菌，呈現(xiàn)單個(gè)、成雙或短鏈的分散均勻排列，兩極濃染，符合副雞禽桿菌的染色特征。

2.4 生化鑒定 生化鑒定結(jié)果如表1所示，與副雞禽桿菌的生化特性相符。

表1 分離株的生化特性

+：生化試驗(yàn)陽(yáng)性，發(fā)酵糖，產(chǎn)酸；-：生化試驗(yàn)陰性，不發(fā)酵糖，不產(chǎn)酸

2.5 對(duì)雞的致病性 攻毒48 h后，攻毒組發(fā)病率為93.3%(14/15)；對(duì)照組雞只均無(wú)明顯癥狀。發(fā)病雞只全部出現(xiàn)眶下竇腫脹，其中92.9%(13/14)流鼻汁。攻毒后1～4 d發(fā)病雞眶下竇腫脹明顯，流鼻汁較多，到10 d癥狀消失，沒(méi)有出現(xiàn)死亡。攻毒組雞PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為53.3%(8/15)，并再次分離到了副雞禽桿菌。2.6 血凝素基因的序列測(cè)定與分析 分離株血凝素基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，與預(yù)期片段大小相符為1 100 bp。序列測(cè)定顯示，分離株的血凝素基因長(zhǎng)為1 008 bp，編碼335個(gè)氨基酸，命名為副雞禽桿菌PGSY株。將PGSY株的血凝素基因序列與NCBI下載的47個(gè)副雞禽桿菌血凝素基因序列進(jìn)行核苷酸序列同源性比對(duì)，同源性在93.4%到99.0%之間。PGSY株與國(guó)內(nèi)分離株SD-1、Tianjin的同源性最高達(dá)到99.0%，與A型參考株221(疫苗株)同源性為95.7%，與B型參考株0222同源性為95.7%，與C型參考株Modesto(疫苗株)同源性為94.4%，與印度分離株VRDCAvpgCCSZ的同源性最低為93.4%。

圖3 血凝素基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.7 核苷酸變異分析 PGSY株與SD-1有著很高的相似性，但其序列長(zhǎng)度有所不同，PGSY株核苷酸序列比已知的SD-1株缺失了30個(gè)堿基(即10個(gè)氨基酸位點(diǎn))，比A型參考株221缺失了27個(gè)堿基(圖4)。

圖4 血凝素基因核苷酸序列對(duì)比﹣：核苷酸缺失

2.8 血凝素基因遺傳進(jìn)化分析 PGSY株與兩個(gè)國(guó)內(nèi)分離株SD-1，Tianjin和印度分離株VRDCAvpgHC5SZ同屬一個(gè)新的進(jìn)化支，與參考株221(A型)、0222(B型)、Modesto(C型)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處于不同進(jìn)化分支，如圖5所示。

3 討論

雞傳染性鼻炎是養(yǎng)雞生產(chǎn)中的一類(lèi)重要疫病，近年發(fā)生有增加的趨勢(shì)。由于大型養(yǎng)殖場(chǎng)都對(duì)該病進(jìn)行了免疫，所以容易誤診或延誤確診治療時(shí)間。該副雞禽桿菌分離株經(jīng)北京市農(nóng)林科學(xué)院鑒定血清型為A型，發(fā)病雞群免疫過(guò)某公司生產(chǎn)的雞傳染性鼻炎二價(jià)滅活疫苗(A型+C型)，但是雞群仍然發(fā)病。這種現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，養(yǎng)殖戶通常認(rèn)為是免疫程序操作不規(guī)范或疫苗質(zhì)量問(wèn)題所致，而忽視了菌株本身可能發(fā)生變異的原因，由于對(duì)該病原的研究并不全面，所以在防治過(guò)程中仍需進(jìn)一步探討。

圖5 血凝素基因序列進(jìn)化樹(shù)●：本研究分離株

本研究從免疫發(fā)病群分離到一株副雞禽桿菌，首次發(fā)現(xiàn)了核苷酸序列長(zhǎng)度為1 008 bp的副雞禽桿菌，命名為PGSY株。發(fā)病雞場(chǎng)所用二價(jià)滅活疫苗是用A型參考株221和C型參考株Modesto制成的，PGSY株的血凝素基因序列比221株和Modesto株分別缺失了27個(gè)堿基和18個(gè)堿基。分離株比B型參考株0222和我國(guó)最早分離的Hp8株(A型)也缺失了27個(gè)堿基。PGSY株與同源性最高的SD-1株血凝素基因序列的惟一區(qū)別是比其缺失了30個(gè)堿基(SD-1株為1 038個(gè)堿基[7])?？梢?jiàn)分離株序列出現(xiàn)了新特點(diǎn)，可能是導(dǎo)致免疫失敗的一個(gè)重要原因。

血凝素基因核苷酸序列同源性比較結(jié)果表明，PGSY株與國(guó)內(nèi)分離株SD-1具有最高的核苷酸同源性為99%。與疫苗株進(jìn)行比較分析，顯示PGSY株與221株(A型)的同源性為95.7%，與Modesto株(C型)的同源性為94.4%，同源性相對(duì)較低。遺傳進(jìn)化分析也表明，PGSY分離株與國(guó)內(nèi)分離株SD-1處于同一進(jìn)化分支，與221株和Modesto株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。總之，從分子水平上看，近年來(lái)副雞禽桿菌的流行菌株確實(shí)發(fā)生了一些新變化。養(yǎng)禽生產(chǎn)中應(yīng)該密切監(jiān)測(cè)副雞禽桿菌的發(fā)展變化和重視雞傳染性鼻炎的防控，今后研制與流行菌株匹配性更好的疫苗是合理控制該病的重要措施。

[1] 馮文達(dá)．北京雞傳染性鼻炎病原菌的分離鑒定[J]．微生物學(xué)通報(bào)，1987，5(8)：216-219．

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Diagnosis and Analysis of A case of Infectious Coryza

ZHAO Shi-ying1,2， MA Zhi-jun3, FENG Jin-ling4， XU Yang4， XU Mei-yu4， QIN Yu-cheng5，WU De-guo2， ZHANG Guo-zhong1,4

(1.College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China； 2.Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China； 3.Beijing center for animal disease control and prevention, Beijing 102629, China; 4.Diagnostis Center of Livestock and Poultry Epidenic Dieases, China Agricultural University, Beijing 100193, China； 5.Beijing Animal Health Supervision, Pinggu District, Beijing 101200, China)

In this study, a suspected case of infectious coryza were diagnosed and analyzed that occurred on a chicken farm in Beijing. The results of PCR detection and sequencing analysis showed that the chicken group had the infection of Avibacterium paragallinarum. The isolated strains were identified as Avibacterium paragallinarum by staining microscopic examination, biochemical identification and animal infection experimen. The strain was named as PGSY strain. By cloning the hemagglutinin gene of the isolates, the nucleotide sequence was determined and make sequence Alignment compared with the published strains. The results showed that Avibacterium paragallinarum PGSY strain’s hemagglutinin gene length is 1008bp, the nucleotide homology between the SD-1 strain was as high as 99%. However, compare with SD-1 strain, the sequence of hemagglutinin gene of PGSY strain missing 30 bp. Phylogenetic tree analysis showed that this strain and the strains of domestic isolates SD-1 belong to the same evolutionary branch.

Avibacterium paragallinarum ； Isolation and identification ； Sequence analysis

ZHANG Guo-zhong

2016-07-19

家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(BAIC04-2017)

趙世穎(1988-)，女，工程師，碩士，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理工作，E-mail：syzhao@genetics.ac.cn

張國(guó)中，E-mail：zhanggz@cau.edu.cn

S858.31

A

0529-6005(2017)05-0023-04