田浩楷， 張 帥， 柳小龍， 張志偉， 趙莉藺山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 太谷 0080； 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害鼠害綜合治理研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 000； 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 009

擴(kuò)散型與繁殖型松材線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)字基因表達(dá)譜對(duì)比分析

田浩楷1,2， 張 帥3， 柳小龍1,2， 張志偉1*， 趙莉藺2*
1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 太谷 030801；2中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害鼠害綜合治理研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

【目的】松材線(xiàn)蟲(chóng)作為林業(yè)重大外來(lái)入侵種，擴(kuò)散型幼蟲(chóng)的形成對(duì)其傳播擴(kuò)散起著非常重要的作用，但擴(kuò)散蟲(chóng)態(tài)的形成與維持機(jī)制尚未闡明?！痉椒ā客ㄟ^(guò)構(gòu)建松材線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)，從滯育狀態(tài)的維持、化學(xué)感受、代謝途徑等方面分析松材線(xiàn)蟲(chóng)不同蟲(chóng)態(tài)的基因表達(dá)差異。【結(jié)果】參考松材線(xiàn)蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)，鑒定出2種擴(kuò)散型幼蟲(chóng)(LⅢ，LⅣ)和繁殖型幼蟲(chóng)(Ln)各有11184、8533和10781個(gè)基因。相對(duì)于繁殖型蟲(chóng)態(tài)，大多數(shù)基因在LⅣ中下調(diào)表達(dá)，該蟲(chóng)態(tài)中特異上調(diào)表達(dá)的基因有化感受體基因、核受體基因以及一些代謝相關(guān)基因。推測(cè)這可能與擴(kuò)散型線(xiàn)蟲(chóng)滯育狀態(tài)的維持相關(guān)，并在其生理功能如化學(xué)感受和媒介/寄主互作中發(fā)揮作用。GO和Pathway富集分析顯示，多數(shù)代謝相關(guān)通路在LⅣ中下調(diào)表達(dá)，而在LⅢ中的表達(dá)均活躍?！窘Y(jié)論】以上結(jié)果與LⅣ處于不進(jìn)食、總體代謝水平較低等生理狀態(tài)的表型相一致。

松材線(xiàn)蟲(chóng)； 擴(kuò)散型蟲(chóng)態(tài)； 數(shù)字基因表達(dá)譜； 差異表達(dá)基因

松材線(xiàn)蟲(chóng)Bursaphelenchusxylophilus(Steiner & Buhrer,1934) Nickle,1970是世界公認(rèn)的檢疫性有害生物，是松樹(shù)萎蔫病(pine wilt disease,PWD)的主要致病因子(Mamiya，1983)。該線(xiàn)蟲(chóng)在原產(chǎn)地北美并未造成大面積危害，但被引入亞洲和歐洲等國(guó)家后大規(guī)模暴發(fā)，短時(shí)間內(nèi)致大量松樹(shù)死亡，并不斷擴(kuò)散蔓延(詹開(kāi)瑞等，2013; Wingfieldetal.，1982)。

松材線(xiàn)蟲(chóng)的生活史分為2個(gè)周期：繁殖周期(propagative pathway)和擴(kuò)散周期(dispersal pathway)(Ishibashi & Kondo，1977)。每年夏季，松材線(xiàn)蟲(chóng)在樹(shù)體內(nèi)經(jīng)過(guò)卵、繁殖型1～4齡幼蟲(chóng)(L1-L4, Ln)發(fā)育為成蟲(chóng)。在環(huán)境不利的條件下，如低溫、干燥、種群密度過(guò)高等，松材線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)變?yōu)閿U(kuò)散型Ⅲ齡幼蟲(chóng)(dispersal third stage larva, LⅢ)；LⅢ在媒介天牛存在的情況下轉(zhuǎn)變?yōu)閿U(kuò)散型Ⅳ齡幼蟲(chóng)(dispersal fourth stage larva, LⅣ)。LⅢ和LⅣ均為滯育型蟲(chóng)態(tài)，有很強(qiáng)的抗逆性，它們即使不進(jìn)食也可以生存數(shù)月(Mamiya，1983； Zhaoetal.，2014)。

滯育型蟲(chóng)態(tài)在線(xiàn)蟲(chóng)中普遍存在(Hu，2007)。如模式線(xiàn)蟲(chóng)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)Caenorhabditiselegans(Maupas)，在環(huán)境適宜的條件下，由受精卵經(jīng)過(guò)L1-L44齡幼蟲(chóng)發(fā)育為成蟲(chóng)；而遇到食物缺乏、種群密度增大、溫度升高等不利環(huán)境條件時(shí)，C.elegans會(huì)形成一種滯育型蟲(chóng)態(tài)dauer。相對(duì)于繁殖型幼蟲(chóng)，dauer不再進(jìn)食且身體結(jié)構(gòu)特化，可以抵御干燥、高溫或食物短缺等外界不良環(huán)境條件(Cassada & Russell，1975； Golden & Riddle，1984; Riddleetal.，1981)；當(dāng)外界環(huán)境恢復(fù)時(shí)，dauer會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)4進(jìn)入繁殖周期。松材線(xiàn)蟲(chóng)與C.elegans相比，特殊之處在于其可以形成2種滯育蟲(chóng)態(tài)：LⅢ相當(dāng)于C.elegans的pre-dauer，LⅣ相當(dāng)于C.elegans的dauer；但是，C.elegans的pre-dauer不能長(zhǎng)期存在，松材線(xiàn)蟲(chóng)的LⅢ卻可以長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。LⅣ除抗逆性強(qiáng)以外，還擁有特化的功能，即可以準(zhǔn)確識(shí)別與定位松墨天牛MonochamusalternatusHope，以便被其攜帶并傳播擴(kuò)散，LⅢ則不能被攜帶(Zhaoetal.，2007，2013)。代謝方面，LⅢ仍然可以進(jìn)食，同時(shí)儲(chǔ)存大量脂肪粒；LⅣ不再進(jìn)食，靠分解LⅢ積累的脂類(lèi)物質(zhì)維持生命活動(dòng)或蛻皮轉(zhuǎn)變?yōu)槌上x(chóng)。

在滯育蟲(chóng)態(tài)差異表達(dá)基因的挖掘方面，Jonesetal.(2001)通過(guò)基因表達(dá)系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE)技術(shù)鑒定出358個(gè)C.elegansdauer特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，其中，熱激蛋白hsp-12.6為高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。Wang & Kim (2003)利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了2430個(gè)在dauer蟲(chóng)態(tài)中差異表達(dá)的基因。松材線(xiàn)蟲(chóng)2種特有的擴(kuò)散型蟲(chóng)態(tài)(LⅢ和LⅣ)的形成除了受環(huán)境因素的調(diào)控外，還與其攜帶者產(chǎn)生的化學(xué)信號(hào)誘導(dǎo)有關(guān)(Zhaoetal.，2014)，推測(cè)其在轉(zhuǎn)型發(fā)育調(diào)控中與C.elegans存在差異。Kikuchietal.(2007)通過(guò)對(duì)比松材線(xiàn)蟲(chóng)Ln和LⅣ的EST譜發(fā)現(xiàn)了一些LⅣ特有的EST；但未涉及LⅢ，且基因分析主要側(cè)重于致病性方面。Yanetal.(2012)對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)BursaphelenchusmucronatusMamiya et Enda比較轉(zhuǎn)錄組的研究也是集中在2種線(xiàn)蟲(chóng)的致病性與解毒相關(guān)基因的對(duì)比分析方面。目前，有關(guān)松材線(xiàn)蟲(chóng)特有的2種擴(kuò)散型蟲(chóng)態(tài)的形成與維持機(jī)制的研究甚少。因此，本研究運(yùn)用數(shù)字基因表達(dá)譜分析技術(shù)，著重從滯育狀態(tài)的維持、化學(xué)感受、代謝途徑等方面分析松材線(xiàn)蟲(chóng)不同蟲(chóng)態(tài)的基因表達(dá)差異，為研究其擴(kuò)散型蟲(chóng)態(tài)的形成與維持機(jī)制提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試松材線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)源與培養(yǎng)方法

供試松材線(xiàn)蟲(chóng)均來(lái)源于浙江省富陽(yáng)市新登鎮(zhèn)馬鞍山。繁殖型線(xiàn)蟲(chóng)分離自采集的疫木，經(jīng)過(guò)分離鑒定后挑取目的蟲(chóng)態(tài)，使用常規(guī)PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基(Difco,BD)接種灰葡萄孢菌進(jìn)行進(jìn)一步增殖培養(yǎng)。LⅢ分離自采集的疫木，LⅣ分離自采集的松墨天牛成蟲(chóng)。

繁殖型線(xiàn)蟲(chóng)樣本制備：將混合齡期繁殖型線(xiàn)蟲(chóng)置于90 mm平板PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10 d，用滅菌ddH2O將線(xiàn)蟲(chóng)從培養(yǎng)基洗下，3000 r·min-1離心3 min，收集上清液。LⅢ樣本制備：把疫木砍成3～5 cm細(xì)木條，用貝爾曼漏斗法(baermann funnel technique)分離線(xiàn)蟲(chóng)(Baermann,1917)，鏡檢，去除非LⅢ線(xiàn)蟲(chóng)。LⅣ樣本制備：解剖初羽化天牛，置于35 mm培養(yǎng)皿中，加入滅菌ddH2O，浸泡30 min后，選取線(xiàn)蟲(chóng)量多的樣品進(jìn)行貝爾曼漏斗分離，鏡檢，去除非LⅣ線(xiàn)蟲(chóng)。采用蔗糖懸浮(sucrose flotation)離心方法去除真菌菌絲和其他雜質(zhì)，進(jìn)一步純化線(xiàn)蟲(chóng)(Freckmanetal.，1975)，離心，去除上清后將線(xiàn)蟲(chóng)用液氮速凍，2 h后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待用。

1.2 樣本RNA提取、建庫(kù)及基因表達(dá)譜測(cè)序

RNA提取使用RNeasy Micro Kit(Qiagen,德國(guó))試劑盒。RNA提取后，使用NanoDrop DN-1000(NanoDrop Technologies,美國(guó))檢測(cè)樣品質(zhì)量，選取質(zhì)量好的樣本進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。具體流程：先利用Oligo(dT)的磁珠(beads)富集總RNA中mRNA，并引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，采用4堿基識(shí)別酶NlaIII酶切雙鏈cDNA，鏈接Illumina adaptor1，利用MmeI酶切3′端CATG下游17 bp堿基，并在3′端鏈接Illumina adaptor2；再加入Primer GX1和Primer GX2進(jìn)行PCR擴(kuò)增；樣本擴(kuò)增后，通過(guò)6% TBE PAGE膠回收95堿基條帶，純化后通過(guò)Illumina基因表達(dá)測(cè)序法測(cè)序。

1.3 差異表達(dá)基因的篩選

利用泊松分布的算法篩選2個(gè)文庫(kù)間的差異表達(dá)基因，對(duì)差異檢驗(yàn)的P-value做多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過(guò)控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR) 決定P-value的域值。根據(jù)基因的表達(dá)量(TPM值)，計(jì)算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)(Fold)。差異表達(dá)基因的篩選條件：FDR≤0.001，Log2>1。FDR值越小，差異倍數(shù)越大，說(shuō)明表達(dá)水平差異越顯著。當(dāng)Log2Fold≥1時(shí)，表示該基因表達(dá)上調(diào)；當(dāng)Log2Fold≤-1時(shí)，表示表達(dá)下調(diào)；當(dāng)∣Log2Fold∣<1時(shí)，表示表達(dá)無(wú)差異(王海英等，2016； 姚敏磊等，2016)。

1.4 差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG通路分析

差異表達(dá)基因的GO (gene ontology)分析數(shù)據(jù)來(lái)自Gene ontology 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www. geneontology.org/)。用在線(xiàn)軟件Veen (http:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析。用KEGG數(shù)據(jù)提供的代謝通路信息進(jìn)行Pathway富集分析，當(dāng)Qvalue≤0.05時(shí)，表示差異表達(dá)基因在該通路中顯著富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

經(jīng)過(guò)Illumina測(cè)序，去除純接頭及含N序列和拷貝數(shù)<2的標(biāo)簽后，得到高質(zhì)量測(cè)序標(biāo)簽(clean tags)。各蟲(chóng)態(tài)Clean tags統(tǒng)計(jì)如表1所示。

表1 線(xiàn)蟲(chóng)不同蟲(chóng)態(tài)clean tag數(shù)Table 1 Clean tags from different larval stages of B. xylophilus

測(cè)序飽和度曲線(xiàn)表明,當(dāng)測(cè)序tag數(shù)大于等于20×100 K(2 M)時(shí)，基因數(shù)已經(jīng)趨于飽合(圖1A)。clean tags在3個(gè)樣本中都大于3 M，表明表達(dá)譜測(cè)序的數(shù)據(jù)量較為充足。從檢測(cè)出的基因數(shù)量看，Ln和LⅢ接近，且都顯著高于LⅣ(約1.5倍)。這表明Ln和LⅢ基因表達(dá)比LⅣ活躍，因此有更多的轉(zhuǎn)錄本(transcripts)被檢測(cè)到。

clean tags拷貝數(shù)分布統(tǒng)計(jì)(圖1B)顯示，拷貝數(shù)大于100的高表達(dá)tags在3個(gè)樣本中占80%左右，數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；而拷貝數(shù)小于5的低表達(dá)tags種類(lèi)非常豐富，達(dá)到60%左右。這說(shuō)明少量種類(lèi)的豐度極高, 而大部分種類(lèi)的表達(dá)水平很低，該結(jié)果符合細(xì)胞中mRNA的顯著特征。因此，從整體上評(píng)估數(shù)據(jù)是正常的。

基于參考基因數(shù)據(jù)庫(kù)，產(chǎn)生參考基因總數(shù)15971個(gè)，其中，含有CATG序列的14144個(gè)(占88.56%)；同時(shí)產(chǎn)生70912個(gè)參考tag序列，可以map到單個(gè)基因的tag數(shù)為69278個(gè)(占97.7%)。各蟲(chóng)態(tài)檢測(cè)出的基因總數(shù)分別為L(zhǎng)n10781個(gè)、LⅢ11184個(gè)、LⅣ8533個(gè)，其中各有8531(占79.1%)、8846(占79.1%)、7049(占82.6%)個(gè)基因被注釋。這是EST分析結(jié)果的2倍以上，且比EST有更準(zhǔn)確的基因表達(dá)量信息(Kikuchietal.，2007)，有助于不同齡期線(xiàn)蟲(chóng)基因表達(dá)水平的比較。

2.2 差異表達(dá)基因總體統(tǒng)計(jì)

相對(duì)于Ln，LⅢ有1585個(gè)(占14.2%)基因上調(diào)表達(dá)，1440個(gè)(占12.9%)基因下調(diào)表達(dá)；相對(duì)于Ln，LⅣ有568個(gè)(占6.7%)基因上調(diào)表達(dá)，3723個(gè)(占43.6%)基因下調(diào)表達(dá)。這些數(shù)據(jù)顯示，LⅢ中上、下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量較少且相當(dāng)，而在LⅣ中僅少量基因的表達(dá)上調(diào)，約一半基因均下調(diào)表達(dá)。相對(duì)于Ln，LⅢ與LⅣ上、下調(diào)表達(dá)一致的基因分別為303和1262個(gè)；LⅣ下調(diào)而LⅢ上調(diào)的基因161個(gè)，主要包括熱激蛋白基因(heat shock protein，HSP)以及一些細(xì)胞色素P450基因(cytochrome P450,CYP)，可能與LⅢ抗逆性強(qiáng)相關(guān)；LⅣ上調(diào)而LⅢ下調(diào)的基因5個(gè)(圖2A)，其中包括annexin基因，該基因在C.elegans中與其咽部吞食作用有關(guān)(Rogersetal.，2001)，而在LⅣ中可能與其不再進(jìn)食的生理狀態(tài)有關(guān)。LⅣ相對(duì)于LⅢ，下調(diào)基因居多(上調(diào)298個(gè)，下調(diào)4115個(gè))。以上結(jié)果表明，LⅢ基因表達(dá)較為活躍，而絕大多數(shù)基因在LⅣ中下調(diào)表達(dá)，可能由于LⅣ不再進(jìn)食，僅依靠LⅢ階段積累的脂肪類(lèi)物質(zhì)提供營(yíng)養(yǎng)。GO分析顯示，相對(duì)于Ln，LⅢ與LⅣ差異表達(dá)的基因集中在生物過(guò)程和分子功能方面(圖2B)。

A：測(cè)序飽和度分析；B：clean tag拷貝數(shù)的分布。A: Analysis of sequencing saturation; B: Distribution of clean tags.圖1 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估Fig.1 Sequencing quality assessment

2.3 不同蟲(chóng)態(tài)的高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本分析

高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(abundantly represented transcripts)是生物體在特定發(fā)育階段內(nèi)表達(dá)量較高的基因，參與該階段主要生理機(jī)能的維持。在LⅢ中，HSP、FMRFamide神經(jīng)肽相關(guān)蛋白、精子主要蛋白(major sperm protein)、山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase)、層黏連蛋白受體(laminin receptor)等為表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)錄本(表2)。

在LⅣ中,高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本主要包括FMRFamide神經(jīng)肽相關(guān)蛋白、肌球蛋白(myosin)、脂肪酸延長(zhǎng)相關(guān)蛋白、胚胎發(fā)育晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant-like protein)以及一些功能未知的重要假定蛋白(hypothetical protein)(表3)。這些基因的功能集中在發(fā)育調(diào)節(jié)、神經(jīng)感受以及中間代謝方面，推測(cè)可能與LⅣ維持滯育狀態(tài)、感受外界環(huán)境和降低代謝率相關(guān)。

表2 LⅢ表達(dá)量最高的15種轉(zhuǎn)錄本Table 2 Most abundantly represented transcripts in LⅢ (top 15)

表3 LⅣ表達(dá)量最高的15種轉(zhuǎn)錄本Table 3 Most abundantly represented transcripts in LⅣ (top 15)

繁殖型線(xiàn)蟲(chóng)中，與LⅢ類(lèi)似，精子主要蛋白和山梨醇脫氫酶等基因表達(dá)量也很高。在線(xiàn)蟲(chóng)中，精子主要蛋白主要參與細(xì)胞質(zhì)骨架的裝配以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)功能。與擴(kuò)散型蟲(chóng)態(tài)不同的是，繁殖型線(xiàn)蟲(chóng)中，核糖體蛋白、在糖酵解途徑中的3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白如副肌球蛋白(paramyosin)、膠原蛋白(collagen)等表達(dá)量相對(duì)較高(表4)。這表明繁殖型線(xiàn)蟲(chóng)的細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂活動(dòng)及代謝水平高于擴(kuò)散型蟲(chóng)態(tài)。此外，在LⅣ和LⅢ中表達(dá)量高的基因如胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白和FMRFamide神經(jīng)肽等在Ln中的表達(dá)量均不高，表明此類(lèi)基因可能與擴(kuò)散型蟲(chóng)態(tài)滯育狀態(tài)的維持有關(guān)。

2.4 擴(kuò)散型線(xiàn)蟲(chóng)LⅣ中特異上調(diào)表達(dá)的基因

相對(duì)于Ln，LⅣ特異上調(diào)表達(dá)的基因有260個(gè)(圖2A)。表5是去除未成功注釋和注釋到未知功能蛋白或假定蛋白的基因，同時(shí)略去一些功能廣泛的蛋白激酶，按照表達(dá)量排序篩選出的前25個(gè)基因。

表4 Ln表達(dá)量最高的15種轉(zhuǎn)錄本Table 4 Most abundantly represented transcripts in Ln (top 15)

表5 LⅣ特異上調(diào)表達(dá)的部分基因Table 5 Selected genes specifically up-regulated in LⅣ

數(shù)據(jù)顯示，化感受體(serpentine receptor)基因在LⅣ中特異上調(diào)幅度較大，包括srsx-29、srsx-30、str-19、str-89、str-93、odr-10共6個(gè)相關(guān)基因，表明此類(lèi)基因可能與LⅣ蟲(chóng)態(tài)對(duì)外界化學(xué)信號(hào)更為敏感有關(guān)。在自然條件下，LⅣ通過(guò)有效識(shí)別媒介天牛釋放的化學(xué)信號(hào)而進(jìn)入天牛體內(nèi)，傳播擴(kuò)散至新的寄主松樹(shù)后選擇合適的時(shí)間從天牛體內(nèi)逸出，這些過(guò)程都需要化感受體基因的參與。

上調(diào)幅度較大的還有核受體(nuclear receptor)基因nhr-10和nhr-246。核受體基因一般直接調(diào)控下游效應(yīng)基因的表達(dá)，以啟動(dòng)特定的代謝或發(fā)育通路。這些核受體可能調(diào)控LⅣ特異的代謝或發(fā)育途徑。一些代謝酶類(lèi)也位列其中，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase)、羥基類(lèi)脂脫氫酶(17beta-hydroxysteroid dehydrogenase)、羥基丁酸脫氫酶(3-hydroxybutyrate dehydrogenase type 2)、二氫二醇聚合脫氫酶(dimeric dihydrodiol dehydrogenase)、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyl transferase)等。

2.5 擴(kuò)散型線(xiàn)蟲(chóng)代謝途徑分析

通過(guò)KEGG pathway的富集分析，著重篩選了不同蟲(chóng)態(tài)在三大代謝途徑中的差異基因，這些差異基因均為L(zhǎng)n、LⅢ和LⅣ表達(dá)譜中共同注釋到的轉(zhuǎn)錄本。

糖酵解途徑中，相對(duì)于Ln，LⅢ有2個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，4個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，其余基因表達(dá)無(wú)顯著差異。上調(diào)表達(dá)的基因有果糖—二磷酸醛縮酶(fructose-bisphosphate aldolase)和乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase)，下調(diào)表達(dá)的基因有葡萄糖激酶(glucokinase)、3-磷酸甘油醛脫氫酶等。而LⅣ在該途徑中大部分基因下調(diào)表達(dá)。這可能是由于LⅣ線(xiàn)蟲(chóng)需要的能量較少；但LⅢ糖酵解途徑仍然保持一定的活躍程度，維持著主要的能量輸出(圖3)。

A：糖酵解途徑中部分基因的表達(dá)差異；B：差異基因在糖酵解途徑中的分布。A: The differentially genes expression in glycolytic pathway; B: The distribution of differential genes in glycolytic pathway.1：葡萄糖激酶 Glucokinase； 2：葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶 Glucose-6-phosphate isomerase； 3：果糖-1,6-二磷酸酶 Fructose-1,6-bisphosphate aldolase (FBA)； 4：果糖—二磷酸醛縮酶 Fructose-bisphosphate aldolase； 5：3-磷酸甘油醛脫氫酶 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase； 6：磷酸甘油酸激酶 Phosphoglycerate kinase； 7：磷酸甘油變位酶 Phosphoglycerate mutase； 8：磷酸丙酮酸水合酶 Phosphopyruvate hydratase； 9：丙酮酸激酶 Pyruvate kinase； 10：乳酸脫氫酶連接酶 L-lactate dehydrogenase； 11：乙酰輔酶A連接酶 Acetate-CoA ligase； 12：醛脫氫酶 Aldehyde dehydrogenase (NAD+)。圖3 LⅢ、LⅣ相對(duì)于Ln糖酵解途徑基因表達(dá)變化Fig.3 Expression profiling of genes in glycolytic pathway of LⅢand LⅣ vs Ln

從三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA)來(lái)看，LⅢ相對(duì)于Ln有3個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，4個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)(圖4)。上、下調(diào)基因較少且數(shù)目相近，呈平衡狀態(tài)，且該通路的其他基因表達(dá)量無(wú)變化，表明松材線(xiàn)蟲(chóng)LⅢ有氧代謝仍比較旺盛。而LⅣ相對(duì)于Ln共有11個(gè)基因的表達(dá)量改變，其中，只有丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1組分的部分Tag表達(dá)量上調(diào)，其余基因全部下調(diào)表達(dá)(圖4)。這表明TCA循環(huán)通路的基因在LⅣ中的表達(dá)低于Ln和LⅢ。TCA是線(xiàn)粒體中能量代謝的主要通路，LⅣ有氧代謝水平降低，與其不進(jìn)食、不活躍的生理狀態(tài)相符。

脂肪酸代謝方面，LⅢ相比繁殖型線(xiàn)蟲(chóng)較為活躍，通路大多數(shù)基因上調(diào)表達(dá),包括脂肪酰CoA氧化酶(fatty acyl-CoA oxidase)、脂肪酰CoA脫氫酶(fatty acyl-CoA dehydrogenase)、3-羥基脂肪酰CoA脫氫酶(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)等。而在LⅣ中，僅脂肪酰CoA氧化酶上調(diào)表達(dá)，其余大多數(shù)基因都下調(diào)表達(dá)(圖5)。

A：TCA循環(huán)中部分基因的表達(dá)差異；B：差異基因在TCA循環(huán)中的分布。A： The differentially genes expression in TCA cycle; B: The distribution of differential genes in TCA cycle.1：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 Phosphoenolpyruvate carboxykinase； 2：丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2 Pyruvate dehydrogenase complex E2 component； 3：丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1 Pyruvate dehydrogenase complex E1 component； 4：二氫硫辛酰胺脫氫酶 Dihydrolipoamide dehydrogenase； 5：丙酮酸羧化酶 Pyruvate carboxylase； 6：蘋(píng)果酸脫氫酶 Malate dehydrogenase； 7：檸檬酸合酶 Citrate synthase； 8：順烏頭酸酶 Aconitase； 9：琥珀酸脫氫酶 Succinate dehydrogenase； 10：異檸檬酸脫氫酶 Isocitrate dehydrogenase；11：琥珀酰-CoA合成酶 Succinyl-CoA synthetase； 12：α-酮戊二酸脫氫酶 α-ketoglutarate dehydrogenase。圖4 LⅢ、LⅣ相對(duì)于Ln TCA循環(huán)基因表達(dá)變化Fig.4 Expression profiling of genes in TCA cycle of LⅢ and LⅣ vs Ln

A：脂肪酸代謝中部分基因的表達(dá)差異；B：差異基因在脂肪酸代謝通路中的分布。A： The differentially genes expression in fatty acid metabolism; B: The distribution of differential genes in the pathway of fatty acid metabolism.1：長(zhǎng)鏈脂肪酸-CoA連接酶 Long chain fatty acid-CoA ligase； 2：脂肪酰CoA氧化酶 Fattyacyl-CoA oxidase； 3：脂肪酰CoA脫氫酶 Fatty acyl-CoA dehydrogenase； 4：琥珀酸脫氫酶 Succinate dehydrogenase； 5：不飽和脂肪酰CoA水合酶 Unsaturated acyl-CoA hydratase； 6：3-羥基脂肪酰CoA脫氫酶 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase； 7：3-酮基脂肪酰硫解酶 3-ketoacyl-CoA thiolase； 8：十二氯烷烴輔酶A異構(gòu)酶 Dodecenoyl-CoA isomerase； 9：乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶 Acetyl-CoA C-acetyltransferase； 10：乙醇脫氫酶 Alcohol dehydrogenase。圖5 LⅢ、LⅣ相對(duì)于Ln脂肪酸代謝基因表達(dá)變化Fig.5 Expression profiling of genes in fatty acid metabolism of LⅢ and LⅣ vs Ln

3 討論與結(jié)論

本研究表明，相對(duì)于Ln而言，LⅢ基因表達(dá)仍較為活躍，而LⅣ大多數(shù)基因下調(diào)表達(dá)。LⅣ上調(diào)表達(dá)的基因主要集中于維持滯育狀態(tài)、提高對(duì)不良環(huán)境的耐受力和感受外界信號(hào)方面。從基因表達(dá)模式看，LⅣ更接近于C.elegans的dauer蟲(chóng)態(tài)，而LⅢ更接近一個(gè)正在轉(zhuǎn)變的狀態(tài)，對(duì)應(yīng)于C.elegans中L1轉(zhuǎn)變?yōu)閐auer的過(guò)程(Jonesetal.，2001； Wang & Kim，2003)。

不同于繁殖型線(xiàn)蟲(chóng)中細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的高表達(dá)，擴(kuò)散型線(xiàn)蟲(chóng)共有的高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本以及上調(diào)表達(dá)的基因則集中體現(xiàn)在滯育狀態(tài)的維持及對(duì)不良環(huán)境耐受力的提高等方面。在LⅢ和LⅣ表達(dá)譜的高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本中均檢測(cè)到了FMRFamide神經(jīng)肽相關(guān)蛋白；在LⅢ高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本中檢測(cè)到山梨醇脫氫酶；而山梨醇脫氫酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等在LⅣ中特異上調(diào)表達(dá)。此結(jié)果與Kikuchietal.(2007)通過(guò)EST研究發(fā)現(xiàn)的擴(kuò)散型線(xiàn)蟲(chóng)特異的高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本基本一致。其中，松材線(xiàn)蟲(chóng)中的FMRFamide神經(jīng)肽相關(guān)蛋白基因與C.elegans中的flp-16基因同源，flp-16基因在C.elegans中參與抑制咽部肌肉動(dòng)作電位的傳導(dǎo)(Rogersetal.，2001)。此基因在松材線(xiàn)蟲(chóng)LⅣ中大量表達(dá)，可能與其咽部活動(dòng)的抑制有關(guān)，這與LⅣ不再進(jìn)食和咽部食道球不活動(dòng)的表型相符。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在C.elegansdauer蟲(chóng)態(tài)中也上調(diào)表達(dá)，它與內(nèi)源或外源有毒代謝物質(zhì)的排出有關(guān)(Liuetal.，2004； McElweeetal.，2004)。另外，細(xì)胞色素P450、短鏈化合物脫氫酶/還原酶、UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等基因在C.elegans中也具有類(lèi)似的作用(McElweeetal.，2004)，這些基因在松材線(xiàn)蟲(chóng)LⅣ中同樣上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明此類(lèi)基因在LⅣ生理狀態(tài)的維持中可能起重要作用。綜上所述，松材線(xiàn)蟲(chóng)擴(kuò)散型蟲(chóng)態(tài)的高表達(dá)基因與C.elegansdauer蟲(chóng)態(tài)具有相似之處，進(jìn)一步體現(xiàn)了線(xiàn)蟲(chóng)滯育蟲(chóng)態(tài)的普遍性與一致性。

在松材線(xiàn)蟲(chóng)LⅣ特異上調(diào)表達(dá)的基因中，上調(diào)表達(dá)最顯著的是一些化感受體基因，這些化感受體都屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)家族；而在C.elegansdauer蟲(chóng)態(tài)顯著上調(diào)的基因中未見(jiàn)這些感受體(Jonesetal.，2001； Wang & Kim，2003)。這表明作為植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)，松材線(xiàn)蟲(chóng)LⅣ與自由生活的C.elegansdauer蟲(chóng)態(tài)在化學(xué)感受方面存在差異。Kimetal.(2009)研究表明，2個(gè)多次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(srbc-64和srbc-66)相應(yīng)的突變體在dauer誘導(dǎo)信息素存在的條件下不能形成滯育蟲(chóng)態(tài)，從而證明該受體參與C.elegans對(duì)dauer信息素(C6、C7、C9)的響應(yīng)。這表明化感受體參與了線(xiàn)蟲(chóng)的轉(zhuǎn)型發(fā)育。此外，化感受體的表達(dá)具有時(shí)間與空間差異性(Bargmann，2006； Chenetal.，2005; Thomasetal.，2005，2008)。上調(diào)顯著的6個(gè)化感受體基因中，2個(gè)屬于srsx家族(srsx-29、srsx-30)，3個(gè)屬于str家族(str-19、str-89、str-93)，1個(gè)屬于odr家族(odr-10)。這些基因中除了odr-10被證明在C.elegans中感受雙乙酰(Senguptaetal.，1996)外，其他基因的具體功能尚不清楚。在松材線(xiàn)蟲(chóng)中這些基因可能與LⅣ對(duì)外界化學(xué)信號(hào)的感受相關(guān)。本研究的前期工作證實(shí)了松材線(xiàn)蟲(chóng)LⅢ向天牛蛹室的聚集、LⅢ到LⅣ的轉(zhuǎn)變以及LⅣ識(shí)別與定位初羽化的媒介天牛并向其氣管系統(tǒng)遷移等過(guò)程都受到化學(xué)信號(hào)的介導(dǎo)(Zhaoetal.，2013，2014)。當(dāng)松材線(xiàn)蟲(chóng)被天牛攜帶轉(zhuǎn)移至新的寄主后，需要在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)逸出天牛體內(nèi)，此過(guò)程可能也需要感受特定的化學(xué)信號(hào)。有研究顯示，健康松樹(shù)產(chǎn)生的β-香葉烯(β-myrcene)可以促進(jìn)線(xiàn)蟲(chóng)逸出天牛體內(nèi)(Enda & Ikeda，1983； Ishikawaetal.，1986； Stamps & Linit，1998)。Burnell & O′Halloran (2004)研究表明，昆蟲(chóng)寄生性線(xiàn)蟲(chóng)Heterorhabditisbacteriophora的化學(xué)感受譜在其擴(kuò)散型蟲(chóng)態(tài)形成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)性的變化，體現(xiàn)在對(duì)細(xì)菌代謝物敏感性的降低和對(duì)長(zhǎng)鏈醇及昆蟲(chóng)特異揮發(fā)物敏感性的增加。總之，線(xiàn)蟲(chóng)需要特定的化感受體去感受這些化學(xué)信號(hào)。因此推測(cè)，松材線(xiàn)蟲(chóng)LⅣ中特異上調(diào)表達(dá)的化感受體，對(duì)其準(zhǔn)確地進(jìn)出媒介天牛并進(jìn)一步傳播擴(kuò)散起重要作用；但具體的感應(yīng)機(jī)制有待深入研究。

代謝相關(guān)基因分析表明，松材線(xiàn)蟲(chóng)LⅣ的總體代謝水平低于Ln，與C.elegansdauer蟲(chóng)態(tài)總體代謝率的降低相符(Houthoofdetal.，2002; O′Riordan & Burnell，1989； Vanfleteren & De Vreese，1996)。這是由糖酵解、氧化磷酸化、TCA循環(huán)、糖異生等代謝途徑中的酶活性下降所致(O′Riordan & Burnell，1989)。芯片和SAGE研究發(fā)現(xiàn)，甘油三酯在C.elegansdauer蟲(chóng)態(tài)中被轉(zhuǎn)變?yōu)樘?Holt & Riddle，2003； Jonesetal.，2001； McElweeetal.，2004; Wang & Kim，2003)，表明該蟲(chóng)態(tài)可以利用脂類(lèi)物質(zhì)為自身提供能量。但是，在松材線(xiàn)蟲(chóng)表達(dá)譜中，相對(duì)于繁殖型蟲(chóng)態(tài)，擴(kuò)散型LⅣ在三大代謝通路中的大部分基因下調(diào)表達(dá)，只有個(gè)別基因上調(diào)表達(dá)，推測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)LⅣ的基礎(chǔ)代謝低于C.elegansdauer蟲(chóng)態(tài)，兩者的代謝與維持機(jī)制有所差異，具體的差別有待深入研究。另外，松材線(xiàn)蟲(chóng)LⅢ和LⅣ中山梨醇脫氫酶基因的表達(dá)量均上調(diào)，與該基因在C.elegansdauer蟲(chóng)態(tài)中的表達(dá)相一致。該酶在果糖到山梨醇的可逆氧化還原反應(yīng)過(guò)程中起催化作用(Holt & Riddle，2003)，可能參與無(wú)氧狀態(tài)下的乙醇發(fā)酵(ethanol fermentation)過(guò)程(Hu，2007; McElweeetal.，2006)。推測(cè)此基因在松材線(xiàn)蟲(chóng)中具有類(lèi)似作用，可能是為適應(yīng)不良的環(huán)境條件而啟動(dòng)的特殊代謝方式。LⅢ在脂肪酸β-氧化/脂肪酸合成代謝途徑中相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明此發(fā)育階段在大量積累脂質(zhì)，為轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)Ⅳ做準(zhǔn)備。

總之，在生理狀態(tài)的維持、對(duì)不良環(huán)境的耐受以及基礎(chǔ)代謝率降低等方面，松材線(xiàn)蟲(chóng)擴(kuò)散型蟲(chóng)態(tài)的基因表達(dá)模式與模式線(xiàn)蟲(chóng)C.elegansdauer蟲(chóng)態(tài)類(lèi)似；但是，作為植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)，松材線(xiàn)蟲(chóng)在傳播擴(kuò)散過(guò)程中又有媒介昆蟲(chóng)的參與，使其基因表達(dá)模式變得更加復(fù)雜和特殊。

王海英， 魏廣兵， 劉影霞， 杜貝貝， 岳玲， 黃濤， 王立鵬， 徐世清， 司馬楊虎， 2016. 基于數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)分析異煙肼誘導(dǎo)家蠶脂肪體損傷的差異表達(dá)基因. 蠶業(yè)科學(xué)， 42(3)： 404-414.

姚敏磊， 張璟曜， 周汐， 韓少懷， 謝鳳斌， 朱月林， 蓋鈞鎰， 楊守萍， 2016. 大豆響應(yīng)低磷脅迫的數(shù)字基因表達(dá)譜分析. 大豆科學(xué)， 35(2)： 213-221.

詹開(kāi)瑞， 游源淺， 張曉燕， 陳艷， 2013. 甲酸乙酯對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的熏蒸效果. 生物安全學(xué)報(bào)， 22(2)： 127-131.

BAERMANN G, 1917. Eine einfache methode zur auffindung von ankylostomum (nematoden) larven in Erdproben.GeneeskundigTijdschriftvoorNederlandsch-IndieBatavia, 57: 131-137.

BARGMANN C I, 2006.ChemosensationinC.elegans. (2006-10-25)[2016-11-02]. https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19746/.

BURNELL A M, O′HALLORAN D M, 2004. Chemoreceptor genes: what can we learn fromCaenorhabditiselegansand how can we apply this information to studies on other nematodes?NematologyMonographs&Perspectives, 2: 707-714.CASSADA R C, RUSSELL R L, 1975. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematodeCaenorhabditiselegans.DevelopmentalBiology, 46(2): 326-342.CHEN N S, PAI S, ZHAO Z Y, MAH A, NEWBURY R, JOHNSEN R C, ALTUN Z, MOERMAN D G, BAILLIE D L, STEIN L D, 2005. Identification of a nematode chemosensory gene family.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 102(1): 146-151.

ENDA N, IKEDA T, 1983. Role of volatiles of a pine tree as emerging stimulants for attracting the pine wood nematode from the pine sawyer.Transactionsofthe94thAnnualMeetingJapaneseForestrySociety, 94: 479-480.

FRECKMAN D W, MANKAU R, FERRIS H, 1975. Nematode community structure in desert soils — nematode recovery.JournalofNematology, 7(4): 343-346.GOLDEN J W, RIDDLE D L, 1984. TheCaenorhabditiselegansdauer larva: developmental effects of pheromone, food, and temperature.DevelopmentalBiology, 102(2): 368-378.HOLT S J, RIDDLE D L, 2003. SAGE surveysC.eleganscarbohydrate metabolism: evidence for an anaerobic shift in the long-lived dauer larva.MechanismsofAgeingandDevelopment, 124(7): 779-800.

HOUTHOOFD K, BRAECKMAN B P, LENAERTS I, BRYS K, DE VREESE A, VAN EYGEN S, VANFLETEREN J R, 2002. Ageing is reversed, and metabolism is reset to young levels in recovering dauer larvae ofC.elegans.ExperimentalGerontology, 37(8): 1015-1021.

HU P J, 2007.Dauer. (2007-08-08)[2016-10-06]. https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK116082/.ISHIBASHI N, KONDO E, 1977. Occurrence and survival of the dispersal forms of pine wood nematode,Bursaphelenchuslignicolus.AppliedEntomologyandZoology, 12(4): 293-302.ISHIKAWA M, SHUTO Y, WATANABE H, 1986. Beta-myrcene, a potent attractant component of pine wood for the pine wood nematode,Bursaphelenchusxylophilus.AgriculturalandBiologicalChemistry, 50(7): 1863-1866.

JONES S J M, RIDDLE D L, POUZYREV A T, VELCULESCU V E, HILLIER L, EDDY S R, STRICKLIN S L, BAILLIE D L, WATERSTON R, MARRA M A, 2001. Changes in gene expression associated with developmental arrest and longevity inCaenorhabditiselegans.GenomeResearch, 11(8): 1346-1352.

KIKUCHI T, AIKAWA T, KOSAKA H, PRITCHARD L, OGURA N, JONES J T, 2007. Expressed sequence tag (EST) analysis of the pine wood nematodeBursaphelenchusxylophilusandB.mucronatus.MolecularandBiochemicalParasitology, 155(1): 9-17.KIM K, SATO K, SHIBUYA M, ZEIGER D M, BUTCHER R A, RAGAINS J R, CLARDY J, TOUHARA K, SENGUPTA P, 2009. Two chemoreceptors mediate developmental effects of dauer pheromone inC.elegans.Science, 326: 994-998.LIU T, ZIMMERMAN K K, PATTERSON G I, 2004. Regulation of signaling genes by TGF-beta during entry into dauer diapause inC.elegans.BMCDevelopmentalBiology, 4(1): 1.MAMIYA Y, 1983. Pathology of the pine wilt disease caused byBursaphelenchusxylophilus.AnnualReviewofPhytopathology, 21(1): 201-220.

MCELWEE J J, SCHUSTER E, BLANC E, THOMAS J H, GEMS D, 2004. Shared transcriptional signature inCaenorhabditiselegansdauer larvae and long-lived daf-2 mutants implicates detoxification system in longevity assurance.JournalofBiologicalChemistry, 279: 44533-44543.

MCELWEE J J, SCHUSTER E, BLANC E, THORNTON J, GEMS D, 2006. Diapause-associated metabolic traits reiterated in long-lived daf-2 mutants in the nematodeCaenorhabditiselegans.MechanismsofAgeingandDevelopment, 127(12): 922-936.

O′RIORDAN V B, BURNELL A M, 1989. Intermediary metabolism in the dauer larva of the nematodeCaenorhabditiselegans: 1. glycolysis, gluconeogenesis, oxidative-phosphorylation and the tricarboxylic-acid cycle.ComparativeBiochemistryandPhysiologyB—Biochemistry&MolecularBiology, 92(2): 233-238.

RIDDLE D L, SWANSON M M, ALBERT P S, 1981. Interacting genes in nematode dauer larva formation.Nature, 290: 668-671.ROGERS C M, FRANKS C J, WALKER R J, BURKE J F, HOLDEN-DYE L, 2001. Regulation of the pharynx ofCaenorhabditiselegansby 5-HT, octopamine, and FMRFamide-like neuropeptides.JournalofNeurobiology, 49(3): 235-244.SENGUPTA P, CHOU J H, BARGMANN C I, 1996. odr-10 encodes a seven transmembrane domain olfactory receptor required for responses to the odorant diacetyl.Cell, 84(6): 899-909.STAMPS W, LINIT M, 1998. Chemotactic response of propagative and dispersal forms of the pinewood nematodeBursaphelenchusxylophilusto beetle and pine derived compounds.FundamentalandAppliedNematology, 21(3): 243-250.THOMAS J H, KELLEY J L, ROBERTSON H M, LY K, SWANSON W J, 2005. Adaptive evolution in the SRZ chemoreceptor families ofCaenorhabditiselegansandCaenorhabditisbriggsae.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 102(12): 4476-4481.

THOMAS J H, ROBERTSON H M, 2008. TheCaenorhabditischemoreceptor gene families.BMCBiology, 6(1): 42.

VANFLETEREN J R, DE VREESE A, 1996. Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematodeCaenorhabditiselegans.JournalofExperimentalZoology, 274(2): 93-100.

WANG J, KIM S K, 2003. Global analysis of dauer gene expression inCaenorhabditiselegans.Development, 130(8): 1621-1634.

WINGFIELD M J, BLANCHETTE R A, NICHOLLS T H, ROBBINS K, 1982. The pine wood nematode: a comparison of the situation in the United-states and Japan.CanadianJournalofForestResearch—RevueCanadienneDeRechercheForestiere, 12(1): 71-75.YAN X, CHENG X Y, WANG Y S, LUO J, MAO Z C, FERRIS V R, XIE B Y, 2012. Comparative transcriptomics of two pathogenic pinewood nematodes yields insights into parasitic adaptation to life on pine hosts.Gene, 505(1): 81-90.ZHAO L, MOTA M, VIEIRA P, BUTCHER R A, SUN J, 2014. Interspecific communication between pinewood nematode, its insect vector, and associated microbes.TrendsinParasitology, 30(6): 299-308.

ZHAO L, WEI W, LIU X, KANG L, SUN J, 2007. A novel rapid sampling method for pinewood nematode,Bursaphelenchusxylophilus(Nematoda : Parasitaphelenchidae).CanadianJournalofForestResearch—RevueCanadienneDeRechercheForestiere, 37(10): 1867-1872.

ZHAO L, ZHANG S, WER W, HAO H, ZHANG B, BUTCHER R A, SUN J, 2013. Chemical signals synchronize the life cycles of a plant-parasitic nematode and its vector beetle.CurrentBiology, 23(20): 2038-2043.

(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Comparative analysis of dispersal and propagative larval stages in the pinewood nematode (Bursaphelenchusxylophilus) based on a digital gene expression library

TIAN Haokai1,2, ZHANG Shuai3, LIU Xiaolong1,2, ZHANG Zhiwei1*, ZHAO Lilin2*
1CollegeofForestry,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu,Shanxi030801,China；2StateKeyLaboratoryofIntegratedManagementofPestInsectsandRodents，InstituteofZoology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100101，China;3StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China

【Aim】 The formation of the dispersal larva plays an important role in the transmission and spreading of pinewood nematode (Bursaphelenchusxylophilus) which is a major alien invasive pests of forest worldwide. However, its mechanism about formation and maintenance remains unclear. 【Method】 In this study, digital gene expression (DGE) libraries of two dispersal larvae [3rd instar (LⅢ), and 4th instar (LⅣ)] and of the propagative larva (Ln) were constructed to analyze the differences of gene expression of different developmental stages from aspects of maintenance of diapause, chemoreception and metabolic pathways. 【Result】 A total of 11184, 8533, 10781 genes were found for LⅢ, LⅣand Lnaccording to reference genome, respectively. Compared with Ln, most of the genes in LⅣwere down-regulated, and some genes, including chemoreceptor genes, nuclear hormone receptors and other metabolism related genes were up-regulated. The probable function of these genes is in regulating diapause stages, chemosensation and vector/host interaction in the dispersing larva. Gene ontology and pathway clustering analysis showed that most metabolic pathway in LⅣwere down-regulated. However, genes related to metabolic pathways in LⅢexpressed vigorously. 【Conclusion】 This results are consistent with phenotype of the physiological status of LⅣ, which does not feed and has low level of overall metabolism.

pinewood nematode; dispersal larva; digital gene expression; differential gene expression

2016-12-11 接受日期(Accepted)： 2017-01-20

林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201204501)； 國(guó)家自然科學(xué)基金(31572272,31272323)； 中國(guó)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目(KSCX2-EW-J-2)； 中國(guó)科學(xué)院前沿科學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目(QYZDB-SSW-SMC014)； 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃: 2014AA020529)

田浩楷， 男， 碩士研究生。 研究方向： 森林保護(hù)學(xué)。 E-mail： tianhaokai2013@163.com

*通信作者(Author for correspondence): 張志偉， E-mail: nmgzhiwei@163.com； 趙莉藺， E-mail: zhaoll@ioz.ac.cn

10. 3969/j.issn.2095-1787.2017.02.002