姚明燕， 季清娥, 陳家驊福建農林大學植物保護學院，福建 福州 350002

實蠅腸桿菌科共生菌的研究進展

姚明燕， 季清娥*, 陳家驊
福建農林大學植物保護學院，福建 福州 350002

實蠅與體內微生物的共生關系是目前較受關注的研究課題。其中,腸桿菌科細菌是這些內共生微生物中的重要一類，廣泛存在于實蠅腸道和生殖系統(tǒng)中。研究證明,共生腸桿菌科細菌在參與實蠅的碳氮循環(huán)、營養(yǎng)代謝、生殖免疫及生物防治等方面都發(fā)揮著極大的作用。近年來，人們利用分子生物學技術已鑒定出部分實蠅內共生腸桿菌科細菌的類群，發(fā)現(xiàn)許多優(yōu)勢的益生腸桿菌種和代謝產物，它們能增強實蠅的健康，提高昆蟲不育技術的應用高效性。本文對實蠅共生腸桿菌科細菌的種類、分布和作用，以及它們在不育昆蟲技術中的應用進展作一綜述，這不僅有助于人們更深入地了解宿主與共生菌群落間的互作關系，而且對人類開發(fā)新型實蠅防治餌劑以及將此類共生益生菌應用于實蠅不育技術有重要意義。

腸桿菌科； 實蠅； 共生系統(tǒng)； 功能； 不育昆蟲技術

腸桿菌科Enterobacteriaceae細菌是一群革蘭氏陰性、具有高G+C含量(39%～59%)的細菌,分布廣，寄生于人、動物和植物，甚至在土壤或水中也能存活。腸桿菌科細菌在自然界中易于培養(yǎng)，繁殖快(20～30 min一代)，大部分能在無機氮培養(yǎng)基上生長。植食性實蠅類昆蟲(雙翅目:實蠅科)是重要的農業(yè)害蟲，危害作物種類多，嚴重影響農業(yè)生產和果蔬貿易,已被列為國家重要的經濟類檢疫性有害生物(柳麗君等，2011)。腸桿菌科細菌作為益生菌寄居在實蠅腸道內，能提高宿主對貧瘠食物的攝取，幫助消化食物成分，增強實蠅的健康體質，并能調控交配和生殖系統(tǒng)(柳麗君等，2011； 相輝和黃勇平，2008; 周洪英等，2015)。在實蠅的腸道中寄居著多樣性豐富的共生菌，其中,腸桿菌科細菌不但種類多，而且菌種的相對豐度高，是實蠅腸道中最重要的菌群(駱米娟等，2016； 柳麗君等，2011； 王洪秀等，2015； 張某等，2016； Aharonetal.,2013)。近年來，對實蠅共生腸桿菌科細菌的研究進展快，對其功能性的研究熱度更是不斷增加(王洪秀，2011； 王莉莉，2011； Augustinosetal.,2015； Beharetal.,2005； Hamdenetal.,2013; Kikuchietal.,2011)。本文綜述近年來有關實蠅體內的腸桿菌科細菌的研究，闡述了腸桿菌科細菌與實蠅間的互作以及在不育技術中的應用，以期為今后開發(fā)新型實蠅防治餌劑及研究實蠅不育技術提供參考。

1 實蠅共生腸桿菌科細菌的分布

腸桿菌科是實蠅類害蟲體內最重要的優(yōu)勢菌群，人們從各類實蠅的腸道或生殖系統(tǒng)內發(fā)現(xiàn)了大量的腸桿菌(表1)。Aharonetal. (2013)應用454焦凝酸測序技術對地中海實蠅Ceratitiscapitata(Wiedemann)的卵、幼蟲、蛹、1日齡實驗室成蟲、未知齡段的野生成蟲以及30日齡實驗室成蟲的整個體軀或腸道組織進行測序后，發(fā)現(xiàn)腸桿菌科細菌是各個樣品蟲源中豐度最高、多樣性最豐富的菌群，其中，腸桿菌屬Enterobacter、克雷伯氏菌屬Klebsiella、果膠桿菌屬Pectobacterium是最優(yōu)勢的代表菌屬。Wangetal. (2014)用16S rRNA基因的PCR-DGGE分析技術在3種橘小實蠅腸道中測得腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬Citobacter、腸球菌屬Enterococcus是可培養(yǎng)的優(yōu)勢屬種類。其他幾種實蠅消化道中腸桿菌科中的Klebisiella和Enterobacter也是優(yōu)勢菌群(Beharetal.,2008a； Boye & Hansen,2003； Drew & Lloyd,1991)。駱米娟等(2016)采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和16S rDNA(V6-V8)分子測序技術相結合的方法從南亞實蠅Bactroceratau(Walker)雌雄成蟲腸道中分離到腸桿菌科細菌群。研究顯示，實蠅腸道微生物群落多樣性及結構的改變受到多種因素的影響，如環(huán)境和食物條件的差異(王洪秀等，2015)、實蠅個體發(fā)育階段的不同(Aharonetal.,2013)、實蠅所處的地理條件和季節(jié)氣候也會引起腸道微生物的變化(Beharetal.,2013)，甚至實蠅的某些分子機制，如抗菌肽和活性氧這種天然免疫系統(tǒng)的存在都能直接或間接地調控腸道微生物群落，使菌種數(shù)量增加、減少或保持在一個相對穩(wěn)定的水平，以滿足宿主機體的健康需求(Douglas,2014)。盡管實蠅腸道微生物受到外在或內在因素的影響，其多樣性也發(fā)生變化，但是腸桿菌科細菌仍然是其腸道中最穩(wěn)定的菌群，即使是昆蟲不育技術(sterile insect technique, SIT)中使用的輻照條件也不會破壞腸桿菌科細菌寄居的優(yōu)勢地位，其中的聚團腸桿菌Enterobacter(Pantoea)agglomerans和肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae能在地中海實蠅的整個生活史中垂直傳遞2代(Lauzonetal.,2009)。

2 實蠅共生腸桿菌科細菌的作用

2.1 參與代謝，提供營養(yǎng)物質

氮素大量存在于自然界，在動物體內的含量有限卻又必不可少。共生腸桿菌科細菌補足宿主不能從瓜果、蔬菜等農作物中攝取必要氨基酸和礦物質。這些共生菌可能扮演著氮源、氨基酸以及維生素的角色。肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌Citrobacterfreundii、胡蘿卜果膠桿菌Pectobacteriumcarotovora和杓蘭果膠桿菌Pectobacteriumcypripedii經過微生物的可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)技術，從野生的地中海實蠅腸道中分離并成為相對豐度最高的潛在固氮微生物菌種，能夠在活體實蠅體內表達雙氮還原酶基因，并參與宿主固氮，增加氮元素含量(Beharetal.,2005)，參與碳、氮代謝，影響宿主健康(Beharetal.,2008a)。共生腸桿菌科細菌——歐文氏菌CandidatusErwiniadacicola在油橄欖實蠅B.oleae腸道內處于優(yōu)勢地位，能夠將非必要氨基酸通過相關的代謝機制轉變?yōu)樗拗魉璧陌被峄虻鞍?，從而提高雌蟲產卵量(Ben-Yosefetal.,2010,2014)。歐文氏菌在油橄欖實蠅幼蟲腸道中不僅作為營養(yǎng)資源寄居，而且能參與寄主水果油橄欖的二次代謝，與未成熟油橄欖中的橄欖苦苷(oleuropein)(一種存在寄主果實中，能削弱入侵實蠅體內主要氨基酸——賴氨酸的含量，此外可能作為不活躍的酶降低實蠅對飲食中蛋白的消化能力)發(fā)生中和作用，使油橄欖幼蟲克服寄主水果的化學阻力，更易寄生在未成熟的油橄欖果實中，完成正常的生長發(fā)育(Ben-Yosefetal.,2015)。還有研究表明,從蘋果繞實蠅Rhagoletispomonella(Walsh)腸道內分離出來的聚團腸桿菌，能將寄主植物含有的致死有毒物質根皮苷降解，使蘋果繞實蠅更易安全地寄生(Robacker & Lauzon,2002)。

2.2 具有潛在的引誘活性

共生腸桿菌科細菌能產生一些特殊的具有引誘活性的化學物質，將其作為引誘劑可完善甲基丁香酚、誘捕器和蛋白餌劑作用于實蠅的局限。研究表明，從蘋果繞實蠅(apple maggot fly,AMF)的腸道中分離出來的聚團腸桿菌能產生更多的吲哚、3-甲基丁醇、2,5-二甲基吡嗪，從墨西哥實蠅(Mexican fruit fly,MFF)分離的菌株能產生3-羥基丁酮，但只有吲哚對實蠅成蟲產生引誘活性，其他的化學物質則抑制吲哚的引誘活性(Robackeretal.,2004)。Shietal. (2012)利用從雌性橘小實蠅生殖系統(tǒng)中分離鑒定出對雌成蟲具有引誘活性的幾種腸桿菌科細菌：產酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca、肺炎克雷伯氏菌和土生拉烏爾菌Raoultellaterrigena。野外大籠實驗中，產酸克雷伯氏菌能引誘最多的雌成蟲。Wangetal. (2014)從3種不同途徑采集的橘小實蠅腸道中分離出具有引誘活性的腸桿菌科細菌，其中,加入陰溝腸桿菌Enterobactercloacae和弗氏檸檬酸桿菌Citrobacterfreundii的LB液體培養(yǎng)基比不加菌的LB液體培養(yǎng)基能引誘更多的橘小實蠅成蟲，且經過高壓滅菌的這2種菌株的菌懸液也比無菌對照引誘力強。Robackeretal.(2009)指出，氨類化學成分的存在可能是造成菌揮發(fā)產物具有強引誘力的原因。桃實蠅B.zonata的腸道中也能分離出具有引誘活性的陰溝腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌(Reddyetal.,2014)。

2.3 協(xié)助宿主防御有害微生物

地中海實蠅腸道中不僅寄居著大量且優(yōu)勢的腸桿菌科細菌，而且存在著常見而穩(wěn)定的假單胞菌屬Pseudomonas，采用新型的自殺式聚合酶限制PCR(SuPER-PCR)技術能檢測到致病菌綠膿假單胞菌Pseudomonasaeruginosa的存在。當實蠅食用、接種含有大量P.aeruginosa的飼料時，其壽命明顯縮短。但是當在飼料中加入杓蘭果膠桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、腸桿菌屬、產酸克雷伯氏菌、成團泛菌屬Pantoea任一種腸桿菌科細菌時，其壽命明顯延長。這說明腸桿菌科細菌的存在能夠抑制病原菌的生長發(fā)育，避免它們威脅宿主的健康(Beharetal.,2008b)。

3 實蠅內共生腸桿菌科細菌與昆蟲不育技術的聯(lián)系

3.1 實蠅防治技術

傳統(tǒng)防治實蠅的方法包括化學農藥、害蟲的綜合治理和生物防治。其中,化學農藥防治產生的3R問題給生態(tài)環(huán)境、天敵及人類健康帶來嚴重的威脅，為減少對生態(tài)系統(tǒng)的消極影響，開發(fā)新型害蟲防治技術已迫在眉睫。昆蟲不育技術(sterile insect technique, SIT)通過基因消除——RIDL(向田間釋放攜帶有顯性致死基因昆蟲)、生殖干擾和RNA干擾等不育技術手段，抑制害蟲蟲口的擴增或害蟲種群更替(Lsftwichetal.,2015)，因其對生態(tài)安全和環(huán)境友好，SIT越來越受到國內外農業(yè)部門和研究學者的重視，已成為防治實蠅的熱點。

3.2 SIT對實蠅腸道共生腸桿菌科細菌的影響

大量飼養(yǎng)高質量的不育雄蟲是保證SIT高效性的基礎(Dycketal.,2005)。但有研究表明,實驗室大量飼養(yǎng)的不育雄蟲在存活率、體質健康和競爭交配力方面都不及野生雄蟲，從而造成SIT應用的缺陷和低效性，這可能與實蠅人工飼料、實驗室飼養(yǎng)條件、SIT的輻照過程、運輸和釋放過程有關(Beharetal.,2008a; Ben-Yosefetal.,2010)。另外，SIT的輻照不育過程能破壞靶標地中海實蠅和墨西哥按實蠅的中腸組織、腸道微生物以及中腸蛋白酶等營養(yǎng)成分(Lauzon & Potter,2012)，降低地中海實蠅腸道中優(yōu)勢腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬的相對豐度，增加致病菌屬的相對豐度，如綠膿假單胞菌(Beharetal.,2008b; Ben-Amietal.,2010)，這種不平衡可能會削弱不育雄蟲在田間的競爭交配力。

3.3 實蠅腸道共生腸桿菌科益生菌能提高SIT的高效性

實蠅腸道中益生菌能增強宿主健康和交配能力，聚團腸桿菌、成團泛菌Pantoeaagglomerans和肺炎克雷伯氏菌，能提高地中海實蠅的性表現(xiàn)力(Lauzon & Potter,2012)，而食用接種有產酸克雷伯氏菌飼料的地中海實蠅，不但性表現(xiàn)力提高，而且當寄主處于饑餓壓力下時，其壽命也明顯延長(Gavrieletal.,2011)。更多關于腸桿菌科細菌應用于SIT實蠅的案例見表2。

大部分腸桿菌科細菌既是實蠅腸道中的優(yōu)勢菌也是益生菌，其中，腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬的開發(fā)應用研究最多，但在油橄欖實蠅的益生菌飼料的開發(fā)應用實驗中，在不加入酵母的人工飼料里接種假單胞菌科細菌——惡臭假單胞菌Pseudomonasputida，能顯著提高實驗室喂養(yǎng)的油橄欖實蠅雌蟲的產卵率。此研究表明，除歐文氏菌屬、腸桿菌屬能作為增強SIT油橄欖實蠅的益生菌資源，惡臭假單胞菌也可被定義為益生菌中的一員(Estesetal.,2012； Sacchettietal.,2014)。

實蠅內生腸桿菌科細菌作為益生菌影響SIT實蠅的體質健康或生殖表現(xiàn)力時，實蠅種類、實驗室飼養(yǎng)的條件以及人工飼料的選擇都會影響益生菌的應用效果。將產酸克雷伯氏菌作為益生菌被接種富含蛋白的人工飼料中，用這種飼料喂養(yǎng)南亞實蠅B.Tau，南亞實蠅雌蟲的產卵率提高不明顯(Khanetal.,2014)。而在昆士蘭實蠅B.tryoni的成蟲飼料中接種產酸克雷伯氏菌和肺炎克雷伯氏菌，實蠅產生成熟的卵母細胞和卵粒的數(shù)量與不加入益生菌的對照飼料比較，測定的指標數(shù)量并未增加(Meatsetal.,2009)。

表1 實蠅生殖系統(tǒng)及腸道內已鑒定的共生腸桿菌科細菌Table 1 The identified symbiotic enterobacteriaceae in the reproductive system and gut of fruit flies

表2 腸桿菌科細菌應用于增強SIT實蠅的健康或性表現(xiàn)力Table 2 Enterobacteriaceae applied for enhancing fitness or sexual performance of fruit flies mass-reared for use in sterile insect releases

3.4 實蠅內共生的腸桿菌科細菌與沃爾巴克氏菌體Wolbachiapipentis在SIT中的不同應用形式

實蠅科害蟲體內寄居著廣泛而大量的共生腸桿菌科細菌，與沃爾巴克氏菌體相比，它們在實蠅種類的分布范圍、相對豐度的高低以及體外分離培養(yǎng)的難易程度方面都占有絕對優(yōu)勢。腸桿菌科細菌在寄主的營養(yǎng)消化、生長發(fā)育、生殖代謝方面發(fā)揮著積極的作用，通過調控它們在SIT實蠅體內相對豐度的不平衡，可以增強宿主的體質健康，提高性表現(xiàn)力。而沃爾巴克氏菌體屬于α-變形菌綱，既是兼性好氧型，也是一種母系遺傳的細胞內共生細菌。相關研究指出，沃爾巴克氏菌體并不是在所有實蠅科物種體內都存在，而是以較低的盛行率存在于熱帶和溫帶地區(qū)的實蠅科物種體內(Martinezetal.,2012; Raphaeletetal.,2014)。澳大利亞實蠅科體內沃爾巴克氏菌體的水平傳遞機制受到本地實蠅物種的差異、實蠅與生態(tài)系統(tǒng)的相互作用、實蠅共享的寄主植物和寄生蜂種類等因素影響(Morrowetal.,2014)。沃爾巴克氏菌體一般通過誘導宿主細胞質不親和(cytoplasmic incompatibility， CI)調控寄主的生殖活動，當感染了沃爾巴克氏菌體的櫻桃繞實蠅RhagoletiscerasiL.雄蟲與未被感染的雌蟲或被非同種沃爾巴克氏菌體感染的雌蟲交配時，會發(fā)生細胞質不親和現(xiàn)象，這種現(xiàn)象會致死雜交產生的胚胎，導致不育(Riegler & Stauffer,2002)。利用從櫻桃繞實蠅體內分離出的沃爾巴克氏菌體感染地中海實蠅，并建立感染沃爾巴克氏菌體品系，該菌體能誘導寄主產生細胞質不親和現(xiàn)象。釋放這些浸染Wolbachia的蟲源，與實驗室飼喂的正常蟲源交配，能完全成功地抑制其種群的發(fā)展(Zabalouetal.,2004)。SIT的輻照過程對靶標實蠅體內共生的微生物造成不同程度的傷害，大部分腸桿菌科作為益生菌被SIT實蠅食用后，可以通過補足宿主體內腸桿菌群的相對豐度，打破它們寄居的不平衡性，積極調控寄主的健康和在田間性交配的表現(xiàn)力，從而提高SIT的高效性。而沃爾巴克氏菌體可以通過顯微注射技術注入到SIT靶標實蠅體內，誘導寄主不育，調控宿主的生殖，最后釋放感染了沃爾巴克氏菌體的實驗種群到田間，從而抑制目標種群發(fā)展。沃爾巴克氏菌體與腸桿菌科細菌都為SIT實蠅防治技術做出貢獻，其防治機制各有千秋，但都達到綠色、環(huán)保和生態(tài)防治害蟲實蠅的目的。

4 小結與展望

腸桿菌科細菌廣泛分布在不同的實蠅種群體內，是實蠅體內共生微生物種群中相對豐度最高、物種多樣性最多的菌群。無論是從實蠅腸道還是生殖系統(tǒng)內分離出來的腸桿菌科細菌，其物種組成沒有明顯差異。腸桿菌科細菌在長期進化過程中不斷完善與宿主的共生互作關系，近年來對此類共生菌的開發(fā)應用更是受到國內外相關學者的關注。

腸桿菌科細菌在寄主的營養(yǎng)、生殖、代謝、免疫以及抵抗外來病原菌入侵方面都發(fā)揮了重要的作用，特別是益生菌被開發(fā)應用于實蠅的生物防治，完善并提高了SIT的高效和經濟性。

雖然實蠅內共生腸桿菌科細菌在現(xiàn)階段的研究已擴展到具體菌種的功能性驗證方面，但還有幾方面問題將成為此類共生菌科的研究熱點。實蠅內生腸桿菌科細菌是否還有其他益生菌菌種可開發(fā)用于提高SIT？不同的實蠅種類、生長環(huán)境、飼喂條件以及寄主植物如何影響腸桿菌科益生菌的選擇？腸桿菌科細菌和沃爾巴克氏菌體能否同時作用于SIT靶標實蠅以提高防治效率，其作用機制又是什么？腸桿菌科細菌對實蠅種群遺傳的影響及機制又是什么？腸桿菌科特定益生菌菌種的基因改造，以及將改造的基因導入宿主體內，其與宿主的互作及生物學或生態(tài)學方面的表現(xiàn)有待進一步深入的研究。

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(責任編輯:郭瑩)

Advance on the study of symbiotic enterobacteria in fruit flies

YAO Mingyan， JI Qing′e*, CHEN Jiahua
CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China

The symbiotic relationship between fruit flies and microorganisms has been a research focus at present. The Enterobacteriaceae are an especially important family of these symbiotic microorganisms, widely found in the gut and reproductive system of fruit flies. They play important roles in the carbon-nitrogen cycle, nutrition, metabolism, and reproductive immunity of their fruit fly hosts. Numerous enterobacteria have been identified by molecular techniques, and several metabolic products of enterobacteria enhance fitness. These findings can improve the efficiency of sterile insect technique (SIT). So, research on symbiotic enterobacteria is helpful not only to understand the interaction between fruit flies and symbionts, but also to exploit new control techniques of tephritid pests.

Enterobacteriaceae; fruit fly; symbiotic system; function; sterile insect technique

2016-06-16 接受日期(Accepted)： 2016-08-03

FAO/ IAEA CRP (16035)

姚明燕， 女， 碩士研究生。 研究方向: 農業(yè)昆蟲與害蟲防治。 E-mail: 15705911594@163.com

*通訊作者(Author for correspondence), E-mail: jiqinge@yeah.net

10. 3969/j.issn.2095-1787.2017.02.001