吳林昊，錢宇，汪慧超，薛秀恒

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院,安徽農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥，230036)

ClassⅡ細(xì)菌素乳酸菌的篩選與定性及群體感應(yīng)系統(tǒng)鑒定

吳林昊，錢宇，汪慧超，薛秀恒*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院,安徽農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥，230036)

篩選具有ClassⅡ細(xì)菌素群體感應(yīng)系統(tǒng)廣譜抑菌作用的乳酸菌并進(jìn)行鑒定，為產(chǎn)ClassⅡ細(xì)菌素乳酸菌的研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。將排除過氧化氫和有機(jī)酸干擾作用的10株乳酸菌，經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理，采用牛津杯法篩選具有分泌細(xì)菌素廣譜抑菌效果的乳酸菌和最小抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其最小抑菌濃度，通過16S rDNA同源性分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)計(jì)合成乳桿菌ClassⅡ細(xì)菌素5個(gè)操縱子plnEFI、plnJKLR、plnGHSTUV、plnABCD和plnMNOP的特異性引物，PCR和電泳鑒定L-4分泌ClassⅡ細(xì)菌素基因群體感應(yīng)系統(tǒng)，通過UPLC和尿素-SDS-PAGE確定細(xì)菌素的分子質(zhì)量。L-4為可能具有廣譜抑菌作用革蘭氏陽性植物乳桿菌，它對(duì)指示菌產(chǎn)生的抑菌圈分別為(18.83±0.39) mm和(19.96±0.49) mm，最小抑菌濃度分別為55 μg/mL和57 μg/mL；L-4具有分泌Class Ⅱ細(xì)菌素群體感應(yīng)基因系統(tǒng)，能夠分泌分子質(zhì)量為10 ku蛋白類細(xì)菌素且符合ClassⅡ細(xì)菌素分子量大小范圍。L-4是1株具廣譜抑菌作用且能分泌10 ku Class Ⅱ細(xì)菌素的植物乳桿菌。

乳酸菌；細(xì)菌素；16S rDNA鑒定；系統(tǒng)進(jìn)化樹；Class Ⅱ細(xì)菌素群體感應(yīng)系統(tǒng)

乳酸菌能夠產(chǎn)生有機(jī)酸如乳酸、丁酸和乙酸等以及過氧化氫和細(xì)菌素等化合物，這些物質(zhì)不僅能保持食品的風(fēng)味和良好的組織狀態(tài)，還可以抑制腐敗菌和病原菌的生長(zhǎng)，從而防止腐敗并延長(zhǎng)食品的保藏期[1]。

根據(jù)細(xì)菌素分子量大小和化學(xué)結(jié)構(gòu)將其分為Ⅳ類：I類細(xì)菌素為羊毛硫細(xì)菌素，他們是經(jīng)過大量翻譯后修飾的核糖體合成的分子質(zhì)量小的多肽，長(zhǎng)度為19～25個(gè)氨基酸；Ⅱ類細(xì)菌素為小分子、熱穩(wěn)定的核糖體合成多肽；Ⅲ類細(xì)菌素為分子量大，對(duì)熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)；Ⅳ類細(xì)菌素為含有脂肪或者碳水化合物部分組成的復(fù)雜大分子。

在細(xì)菌素的應(yīng)用方面，目前僅有Nisin被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和美國食品藥品管理局所認(rèn)可，批量商業(yè)化生產(chǎn)，作為一種天然防腐劑被廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)[2]。但Nisin僅對(duì)蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、產(chǎn)氣莢膜桿菌(Clostridiumperfringens)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等革蘭氏陽性菌有抑制作用，對(duì)革蘭氏陰性菌沒有抑制作用。而Ⅱ類乳酸菌細(xì)菌素具有較好的理化性質(zhì)但且研究相對(duì)較少，前鑒定產(chǎn)Ⅱ類細(xì)菌素乳酸菌的步驟繁瑣、需要耗費(fèi)大量的人力、物力和時(shí)間。用于產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌生長(zhǎng)的天然培養(yǎng)基是非常復(fù)雜的，因?yàn)槿樗峋欠浅？量痰奈⑸?，它的生長(zhǎng)需要各種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等，這些營(yíng)養(yǎng)元素一般是通過大豆粉、酵母提取物、肉提取物等來供給。所有這些原料就組成了乳酸菌所需要的氨基酸來源的蛋白質(zhì)和肽,這些蛋白質(zhì)和肽與細(xì)菌素的分子量及性質(zhì)是極其相近的。因此導(dǎo)致乳酸菌細(xì)菌素分離純化步驟繁瑣、抑菌活性大量損失、細(xì)菌素回收率低、很難純化為純體。

本文通過篩選出1株具有廣譜抑菌作用并具有產(chǎn)Ⅱ類細(xì)菌素的乳酸菌，從菌株鑒定，菌株抑菌活性檢測(cè)及最終對(duì)該菌株分泌Ⅱ類細(xì)菌素分離純化進(jìn)行了研究。從而鑒別出1株具有廣譜抑菌作用、分泌Ⅱ類細(xì)菌的植物乳桿菌，從而在后續(xù)的研究中用于食品工業(yè)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：10株乳酸菌L-1、L-2、L-3、L-4、L-5、L-6、L-7、S-1、S-2、S-3，來源于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，于2014年平板畫線法分離純化，冷凍干燥法保藏菌種。指示菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，來自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室。

試劑：過氧化氫酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K，購自阿拉??；DNA提取試劑盒TAKARA MRS、LB購自國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

1.2 方法

株活化及保藏→牛津杯[8-12]法篩選產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌→產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定→乳酸菌DNA提取→16S rDNA同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建→特異性引物設(shè)計(jì)→群體感應(yīng)系統(tǒng)鑒定。

1.2.1 牛津杯法篩選具有抑菌作用[13-14]的乳酸菌

將目標(biāo)菌株與指示菌置于MRS液體培養(yǎng)基活化3次備用。將10 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注于直徑90 mm培養(yǎng)皿中凝固后作底層，每皿放入4個(gè)牛津杯，0.1 mL指示菌液(1×108CFU/mL)加入5 mL冷卻至45 ℃的LB培養(yǎng)基，使其凝固作為菌層。向牛津杯形成直徑10 mm圓孔孔洞內(nèi)加入待檢測(cè)抑菌活性菌液，接種量為1×106CFU/mL，適宜溫度下培養(yǎng)18 h后，測(cè)量抑菌圈直徑。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作為指示菌，挑選抑菌圈最大的乳酸菌株后續(xù)研究。

1.2.2 有機(jī)酸、過氧化氫抑菌作用

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株經(jīng)10 000 r/min、2 min離心取發(fā)酵上清液，2 mol/L NaOH溶液中和到pH為5.0后，牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)，并設(shè)pH為5.0的乙酸和乳酸、未調(diào)pH值的發(fā)酵上清液作為對(duì)照，檢測(cè)抑菌活性并測(cè)量其抑菌圈直徑。

將菌接種于MRS液體，10 000 r/min離心2 min，取過氧化氫酶溶液100 μL，加入0.9 mL pH為5.0的發(fā)酵上清液中使過氧化氫酶終濃度為50 U/mL，并設(shè)未加過氧化氫酶的pH為5.0發(fā)酵上清液和產(chǎn)細(xì)菌素菌株為對(duì)照，牛津杯法檢測(cè)抑菌活性。

1.2.3 抑菌物質(zhì)的蛋白酶水解作用

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株，調(diào)節(jié)pH為不同蛋白酶的最適作用pH，按1.0 mg/mL分別加入胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶，37 ℃下溫育1 h，將pH值調(diào)回到細(xì)菌素pH=5牛津杯抑菌試驗(yàn)，重復(fù)3次。發(fā)酵上清液作為對(duì)照，驗(yàn)證乳酸菌發(fā)酵上清液的抑菌活性是否為蛋白質(zhì)。

1.2.4 MIC試驗(yàn)

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株，利用96孔微量滴定板，分別測(cè)定上述牛津杯試驗(yàn)中發(fā)酵上清、無有機(jī)酸的發(fā)酵上清、無過氧化氫的發(fā)酵上清及蛋白酶處理的發(fā)酵上清對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度的變化。

1.2.5 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌菌體的形態(tài)特征

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株在MRS固體培養(yǎng)基上平板四區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取大小適中單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。

1.2.6 乳酸菌菌株的菌種鑒定[15]

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取，參照細(xì)菌DNA提取試劑盒(德國 QIAGEN)說明書步驟進(jìn)行。

1.2.7 16S rDNA基因保守序列擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)中乳酸菌上、下游通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增16S rDNA基因[16]。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板DNA 2.0 μL，Mix(2×TaqDNA Polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP)12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性300 s；94 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸120 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸600 s。5 μL擴(kuò)增片段電泳觀察結(jié)果。

1.2.8 菌種鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株，PCR擴(kuò)增結(jié)果16S rDNA基因電泳檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。將菌株序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株序列比對(duì)，通過MEGA4軟件序列分析目的基因序列的同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.2.9 Class Ⅱ細(xì)菌素群體感應(yīng)系統(tǒng)的鑒定

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹同源性比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)乳桿菌ClassⅡ細(xì)菌素5個(gè)操縱子plnEFI、plnJKLR、plnGHUV、plnABCD和plnMNOP的特異性引物見表1。

反應(yīng)體系25 μL：2×TapPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物1.0 μL，DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，設(shè)置空白對(duì)照。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min； 94 ℃變性30 s，退火溫度采用各引物要求溫度、72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳在標(biāo)準(zhǔn)條件下檢測(cè)并送至上海生工測(cè)序比對(duì)。

表1 Class II細(xì)菌素特異性引物

續(xù)表1

名稱上游引物下游引物產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)退火溫度/℃plnkCTGTAAGCATTGCTAACCAATCACTGCTGACGCTGAAAAG141575plnLAGATGCCGCTCCGTAAAGTAGTGCATCGTATTTGCGTGTC26160plnRCCCATCACTAAGCCCTTGATGCTTGCTGGTAGCGCTTATT10159plnGTGCGGTTATCAGTATGTCAAAGCCTCGAAACAATTTCCCCC141575plnHTCTTACACGATCAAGGCAACTGTGCCACTTACCTGTTTC131585plnUCTCGGCCATGGTTATCAGTTGACATCCCATTGCGGTACTC66157plnVCGGAGAATGTTGCTGACTTGGAAGAAATTGCCGCGAATAA57157plnAGTAGGTGGAAAGAGTAGTGCGTAACAGTTTCTTTACCTGTTTAATTGC141595plnBTTCAGAGCAAGCCTAAATGACGCCACTGTAACACCATGAC111615plnCAGATGAAATTCGGCAGCAGTATAATCCAACGGTGCAATCC12160plnDTGAGGACAAACAGACTGGACGCATCGGAAAAATTGCGGATAC10158plnMTAAACAGGTAAAGCAGGTTGGAAGATAATCCTGACCAGACACC48157plnNCCGGGTTAGGTATCGAAATGCACTCGAAGTTCCCTCTGCT12159plnOGGCTGAAGGAGCATCAGTGTTTTGCAGTATCCGCCTTTCT22160plnPTTTGCAAGTGGTCTGCTTTGATTAATTGAGGGCGGGTAGG12160

1.2.10 ClassⅡ細(xì)菌素分子量測(cè)定

乳酸菌株37 ℃下靜置培養(yǎng)傳代至第3代，4 ℃、8 000 r/min離心10 min取上清液。細(xì)菌素初提液水系0.22 μm濾處理上清，超濾系統(tǒng)(50 ku)超濾細(xì)菌素，截取分子量1～50 ku的物質(zhì)，進(jìn)一步通過UPLC H-Class系統(tǒng)分離純化細(xì)菌素，檢測(cè)方法：C18柱，V(水)∶V(乙腈)∶V(乙酸)=95∶4∶1，流速為0.1 mL/min，紫外波長(zhǎng)218 mm，上樣量0.1 μL，采用Tricine-SDS-PAGE電泳來確定其分子質(zhì)量大小,并通過牛津杯法確定該細(xì)菌素的蛋白性質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抑菌物質(zhì)的乳酸菌篩選

10株乳酸菌分別命名：L-1、L-2、L-3、L-4、L-5、L-6、L-7、S-1、S-2、S-3。經(jīng)牛津杯法篩選后，圖1、圖2和圖3表明，這10株菌對(duì)2株指示菌均具有良好抑菌效果。

圖1 十株乳酸菌對(duì)大腸桿菌抑菌效果Fig.1 The antimicrobial effect of 10 strains of lactic acid bacteria against E.coli

圖2 十株乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果Fig.2 The antimicrobial effect of 10 strains of lactic acid bacteria against S.aureus

圖3 十株乳酸菌的抑菌效果Fig.3 The antibacterial effect of the 10 strains of lactic acid bacteria

2.2 有機(jī)酸抑菌試驗(yàn)[18]

乳酸菌發(fā)酵液對(duì)指示菌抑制作用，可能是代謝合成的細(xì)菌素或酸性末端產(chǎn)物如乙酸、乳酸及其他有機(jī)酸作用的結(jié)果。圖4說明，pH=5的L-4發(fā)酵上清液與發(fā)酵原液抑菌效果相近，與發(fā)酵上清液pH值相同的乳酸、乙酸實(shí)驗(yàn)組對(duì)2種指示菌的抑菌效果明顯較小，這說明在排除酸性末端產(chǎn)物的抑菌干擾后，發(fā)酵液中還存在其他抑菌活性物質(zhì)，L-4的發(fā)酵上清液產(chǎn)生的主要抑菌物質(zhì)并非有機(jī)酸。

圖4 排除有機(jī)酸抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of antibacterial by supernatant without organic acid

2.3 過氧化氫抑菌試驗(yàn)

乳酸菌代謝過程中的過氧化氫也可抑制指示菌生長(zhǎng)。過氧化氫酶處理發(fā)酵上清，以未經(jīng)過氧化氫酶處理的乳酸菌原液、發(fā)酵上清液為對(duì)照，結(jié)果見圖5。圖5可以看出，L-4菌株發(fā)酵液經(jīng)過氧化氫酶處理后，抑菌圈直徑與發(fā)酵上清原液、細(xì)菌原液的抑菌圈直徑相比變化不大，活性下降了9.5%，從而可以證明L-4菌株發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)不完全是過氧化氫，有其他抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌起抑制作用。

圖5 過氧化氫酶處理后的抑菌活性Fig.5 Results of antibacterial after treated with catalase

2.4 細(xì)菌素的蛋白酶敏感性試驗(yàn)

為確定抑菌物質(zhì)是否具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K對(duì)發(fā)酵液處理。從圖6可以看出，發(fā)酵液經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后，抑菌圈直徑顯著減小，經(jīng)胰蛋白酶處理后活性分別下降58.9%、61.4%，經(jīng)胃蛋白酶處理后活性分別下降62.1%、61.3%，蛋白酶K處理后活性分別下降63.4%、66.9%?？梢娨志镔|(zhì)對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K敏感。初步確定這種抑菌物質(zhì)具有蛋白性質(zhì)，是一種細(xì)菌素。

圖6 胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of antibacterial after treated with trypsin，pepsin and proteinase K

2.5 MIC試驗(yàn)

MIC試驗(yàn)結(jié)果與牛津杯抑菌試驗(yàn)結(jié)果相符，L-4未經(jīng)處理的發(fā)酵上清(圖7-A)最小抑菌濃度為36、37 μg/mL;與發(fā)酵上清液經(jīng)過排除有機(jī)酸(圖7-B)、過氧化氫(圖7-C)，蛋白酶(圖7-D)處理后的抑菌作用相比，最小抑菌濃度分別為45、48、55和57 μg/mL。L-4最小抑菌濃度均有所上升，抑菌活性均有所減小，蛋白酶處理后L-4發(fā)酵上清液(圖7-D)基本無抑菌作用，說明發(fā)酵上清液中起主要抑菌作用的是L-4分泌的蛋白類細(xì)菌素。

圖7 MIC試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Results of MIC

2.6 乳酸菌形態(tài)觀察

圖8為革蘭氏染色鏡檢結(jié)果，L-4為革蘭氏陽性棒狀乳桿菌。

圖8 L-4革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.8 Microscopic examination resuLts of Gram staining

2.7 同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

乳酸菌L-4基因組經(jīng)16S rRNA基因PCR 擴(kuò)增后，其條帶大小為1 500 bp。經(jīng)上海生工測(cè)序比對(duì)基因序列為1 409 bp。菌株L-4的16S rDNA基因序列與GenBank比對(duì)結(jié)果表明，菌株L-4與其他植物乳桿菌有較高同源性。為比較菌株L-4與其菌種之間親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位，使用生物信息學(xué)軟件Clustal X和MEGA 4.0 中的鄰接法進(jìn)行序列同源性比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[19-20]，結(jié)果如圖9所示。從圖9可以看出，菌株L-4與植物乳桿菌有親緣關(guān)系，相似性達(dá)到98%。使用DNAMAN軟件比對(duì)同一菌屬符合上述結(jié)果，說明菌株L-4在分類學(xué)地位上歸屬于乳桿菌屬，為植物乳桿菌。

圖9 L-4菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 The phylogenetic trees of L-4注：水平距離與虛擬的進(jìn)化變化成正比，樹上的分支數(shù)是驗(yàn)證信譽(yù)度。

2.8 ClassⅡ細(xì)菌素基因分析

ClassⅡ類細(xì)菌素5操縱子plnEFI，plnJKLR，plnGHUV，plnABC和plnMNOPPCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖10。植物乳桿菌WCFS1具有ClassⅡ細(xì)菌素5操縱子基因，根據(jù)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，設(shè)計(jì)出5個(gè)操縱子的特異引物并通過電泳測(cè)序結(jié)果比對(duì)序列。說明L-4與WCFS1具有相似的ClassⅡ細(xì)菌素群體感應(yīng)系統(tǒng)，且每個(gè)基因的表達(dá)量不一樣導(dǎo)致電泳條帶明暗程度不一，因?yàn)槿后w系統(tǒng)中不同基因操縱子表達(dá)調(diào)控的功能作用不一樣，由于相互之間有協(xié)同與滯后作用導(dǎo)致基因的表達(dá)量不一樣。

M-100 bp DNA梯度分子marker圖10 群體感應(yīng)基因表達(dá)結(jié)果Fig.10 The quorum sensing gene expression

2.9 ClassⅡ細(xì)菌素分子質(zhì)量確定

將L-4發(fā)酵上清液通過超濾系統(tǒng)截留下1～50 ku的小分子蛋白后，UPLC檢測(cè)結(jié)果如圖11所示，分別收集圖中A、B、C、D后，經(jīng)過Tricine-SDS-PAGE，結(jié)果顯示發(fā)酵上清液(圖12-A)中含有多種蛋白分子條帶，說明L-4分泌的細(xì)菌素中含有多種小分子蛋白，并且有2條條帶小于10 ku的小分子蛋白；圖12-B主要含有20 ku蛋白類物質(zhì)，還含有30～40 ku蛋白，可能是因?yàn)樵谑占疉峰蛋白物質(zhì)拖尾導(dǎo)致參入其他蛋白；圖12-C主要含有10 ku蛋白類物質(zhì)；圖11-D峰無條帶。牛津杯法顯示峰C的具有抑菌活性，對(duì)兩株指示菌的抑菌直徑分別為(7.13±0.23) mm和(6.61±0.17) mm經(jīng)蛋白酶處理后無抑菌性，說明收集的圖11峰C是均有抑菌作用分子質(zhì)量為10 ku蛋白類物質(zhì)。

圖11 UPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.11 Results of UPLC

圖12 蛋白電泳結(jié)果Fig.12 Results of protein electrophoresis

3 結(jié)論

由于乳酸菌菌種繁多，傳統(tǒng)的鑒定方法比較繁瑣、低效，存在一定的缺陷。近來許多研究人員將眼光放在了分子水平上，從環(huán)境微生態(tài)系統(tǒng)中直接分離提取16S rRNA或DNA并進(jìn)行序列分析。16S rRNA是原核生物糖體小亞單位上的一個(gè)RNA分子，分子質(zhì)量約為0.6×106u，由1 500多個(gè)核苷酸組成。16S rRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)非常保守，而決定其一級(jí)結(jié)構(gòu)的16S rRNA基因序列也非常保守。隨著16S rRNA基因庫的建立，可以發(fā)現(xiàn)同屆或同種微生物16S rDNA序列之間保持很高的同源性。這種同源性與物種間的親緣關(guān)系有著密切的對(duì)應(yīng)關(guān)系。一般來講，在種這個(gè)分類等級(jí)上，如果2個(gè)分類單位區(qū)間的16S rRNA序列同源性大于95%，則認(rèn)為它們屬于同一個(gè)屬[21]。

本文以分子鑒定為主，理化鑒定為輔，分子鑒定和理化鑒定相結(jié)合來鑒定篩選出的產(chǎn)細(xì)菌素的L-4乳酸菌。革蘭氏染色顯微鏡檢結(jié)果說明，L-4菌為革蘭氏棒狀乳桿菌；牛津杯法排酸、排過氧化氫抑菌，細(xì)菌素蛋白酶敏感性試驗(yàn)和MIC試驗(yàn)，確定該菌株所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)是蛋白類細(xì)菌素；后經(jīng)16S rDNA 序列分析和同源性比對(duì)，綜合鑒定L-4菌為革蘭氏陽性棒狀植物乳桿菌。通過PCR基因表達(dá)鑒定，該菌株含有分泌Ⅱ類細(xì)菌素的群體感應(yīng)系統(tǒng)，超濾系統(tǒng)、UPLC和蛋白電泳鑒定顯示L-4分泌的細(xì)菌素中的確含有10 ku小分子蛋白Ⅱ類細(xì)菌素。

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Identification and screening of Class II bacteriocins of lactic acid bacteria and quorum sensing system

WU Lin-hao, QIAN Yu, WANG Hui-chao, XUE Xiu-heng*

(Engineering Laboratory of Agricultural Products Processing of Anhui, Shool of Tea and Food Science & Technology, Anhui Agriculture University, Hefei 230036,China)

The lactic acid bacteria with broad-spectrum antimicrobial effect of Class II bacteriocin quorum sensing system were screened and identified. After exclusion of hydrogen peroxide and organic acid interference and treatment with trypsin， pepsin and proteinase K， lactic acid bacteria secreting bacteriocin with broad-spectrum antibacterial effect was screened by Oxford cup method. The minimal inhibitory concentration was detected by assay on minimal inhibitory activity. Phylogenetic tree was constructed based on 16S rDNA homology analysis. The primers specific for five operon plnEFI, plnJKLR, plnGHSTUV, plnABCD, and plnMNOP of the class II bacteriocins were designed. Class II bacteriocin genes of quorum sensing system were identified by PCR and electrophoresis. The molecular size of bacteriocin was determined by UPLC and urea-sds-page. L-4 was a kind of gram positive bacteria with broad spectrum antimicrobial activity. The diameters of inhibition zones for indicator bacteria were (18.83±0.39) mm and (19.96±0.49) mm, with the minimal inhibitory concentrations of 55.68 μg/mL and 57.31 μg/mL. L-4 had Class II bacteriocin gene of quorum sensing system. It could secrete a bacteriocin with molecular weight of 10 ku in the molecular range of Class II bacteriocin. L-4 was a strain ofLactobacillusplantarumsecreting 10 ku of Class II bacteriocin with broad-spectrum antimicrobial activity.

lactic acid bacteria; bacteriocin;16S rDNA identification; phylogenetic tree; Class II bacteriocin quorum sensing system

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704003

碩士研究生(薛秀恒教授為通訊作者，E-mail:358896335@qq.com)。

2016-09-29，改回日期：2017-01-03