矯麗曼，紀(jì)純陽，楊成超

（遼寧省楊樹研究所，遼寧蓋州115213）

中荷64楊組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

矯麗曼，紀(jì)純陽，楊成超

（遼寧省楊樹研究所，遼寧蓋州115213）

以中荷64楊葉柄為外植體，通過對(duì)比試驗(yàn)確定中荷64楊組織快繁體系。結(jié)果表明：愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂5 g·L-1；不定芽分化與繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂5 g·L-1；生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂5 g·L-1，將組培苗進(jìn)行了移栽，成活率90%以上，為中荷64楊的推廣和應(yīng)用提供了保障。

中荷64楊；外植體；快繁

中荷64楊Populus×canadensis‘N3016’又名荷蘭3016楊，是由荷蘭森林及城市研究所選育出來的雌株，其母本為美洲黑楊，父本是歐洲黑楊。1982年由中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所引進(jìn)我國[1]。樹干通直飽滿，樹形美觀，速生性、抗寒性較強(qiáng)，在內(nèi)蒙古、新疆部分地區(qū)生長良好，在遼寧中南部廣泛栽培[2]。但其抗鹽堿能力稍差，從而限制了該品種的推廣應(yīng)用。本文建立了中荷64楊組織培養(yǎng)快速繁殖體系，為該楊樹品種的廣泛推廣、分子及抗性的研究提供了前期試驗(yàn)基礎(chǔ)，為獲得楊樹優(yōu)良新品種提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中荷64楊枝條采自遼寧省楊樹研究所錦州市金城苗圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌材料的獲得[3-4]

剪取1年生中荷64楊健壯枝條，長100 cm左右，放入裝有水的壇子中，于室內(nèi)進(jìn)行水培，2～3 d換1次水，保持水的清潔。待芽開放展葉后，剪取1 cm幼嫩葉柄，用流水沖洗干凈后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用70%酒精浸泡30 s進(jìn)行表面滅菌，期間輕輕搖晃三角瓶，無菌水沖洗3次，每次3 min，再用0.1%升汞滅菌5 min，期間輕輕搖晃三角瓶，最后用無菌水沖洗5次，每次3 min，瀝干水分后獲得無菌外植體。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)[5-6]

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA和2,4-D，蔗糖20 g·L-1、瓊脂5 g·L-1，將無菌外植體分別接種于不同的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)。每個(gè)處理接種15個(gè)葉柄。

1.2.3 不定芽的分化與繼代培養(yǎng)[7-9]

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA和NAA，添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂5 g·L-1，將愈傷組織分割成1 cm3的小塊轉(zhuǎn)入不同的不定芽分化培養(yǎng)基中分化與繼代培養(yǎng)。每個(gè)處理接種18塊愈傷組織。

1.2.4 不定芽的生根培養(yǎng)[10-11]

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的IBA，添加蔗糖20 g·L-1，瓊脂5 g·L-1，將長2 cm以上的不定芽從基部切下，接種于不同的培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)。每個(gè)處理接種21個(gè)不定芽。

1.2.5 培養(yǎng)條件[12]

以上培養(yǎng)基pH值均為5.6。培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，每天光照13 h。

1.2.6 組培生根苗的容器移栽[13]

移栽前打開三角瓶上的封口膜，煉苗1～2 d。選擇根系發(fā)達(dá)、苗高5 cm以上的組培苗，用溫水小心洗去附著在組培苗根部的培養(yǎng)基，剪去較長的根系，移栽到營養(yǎng)杯中，基質(zhì)為大田土、腐殖土、河沙按1∶1∶1比例混合，經(jīng)高壓滅菌后使用。

1.2.7 大田移栽

育苗地應(yīng)選擇疏松、排水透氣性良好，易于灌溉的壤土或沙壤土為好，移栽前進(jìn)行整地、做床，選擇苗高15 cm以上的容器生根苗進(jìn)行移栽。殖，體積膨大，呈扇面狀。通過篩選確定最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1，誘導(dǎo)48 h，誘導(dǎo)率100%，愈傷組織生長快，很大，呈嫩綠色（表1）。

圖1 葉柄膨大

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的篩選

2.1.1 愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)基的確定

接種2 d后，葉柄兩端膨大（圖1），葉柄逐漸腫脹伸長，6 d后葉柄表面形成淡黃色的愈傷組織（圖2）。培養(yǎng)4周左右挑選黃綠色、松脆的愈傷組織轉(zhuǎn)入該培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接后的愈傷組織不斷增

圖2 愈傷組織形成

表1 葉柄在不同培養(yǎng)基上的分化與繼代情況

2.1.2 不定芽分化與繼代培養(yǎng)基的確定

9 d后愈傷組織上分化出綠色的小芽點(diǎn)，15 d后分化出大量濃密的叢生芽（圖3）。培養(yǎng)4周后，將分化出的不定芽轉(zhuǎn)到該培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)其抽莖展葉。通過篩選確定最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+ 6-BA0.1 mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1，開始分化時(shí)間是11 d，平均分化芽15.8個(gè)，不定芽分化率100%，不定芽多且大，呈嫩綠色（表2）。

表2 不定芽在不同培養(yǎng)基上的分化與繼代情況

圖3 不定芽的分化培養(yǎng)

表3 不定芽在不同培養(yǎng)基上的生根情況

2.1.3 生根培養(yǎng)

6 d后，從無根苗基部長出粉紅色毛狀根（圖4），向四周輻射生長，根長0.5～2.0 cm，根較粗壯，同時(shí)苗也逐漸長高長壯。通過篩選確定最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.2 mg·L-1，開始生根時(shí)間是8 d，生根的不定芽數(shù)21個(gè)，平均生根數(shù)13.5個(gè)，生根率100%，不定芽根多、粗且長、基部有很多愈傷組織（表3）。

2.2 容器移栽

移栽時(shí)為使苗根均勻分布于營養(yǎng)杯中，并與土壤緊密接觸，將土裝到距營養(yǎng)杯口1 cm為好，利于保水。用遮陽網(wǎng)遮光保濕，在保證空氣相對(duì)濕度80%～95%的同時(shí)，還要保證土壤含水量70%左右，以免小苗根部腐爛死亡。遮陽時(shí)間應(yīng)視季節(jié)和天氣條件而定，短期遮陽后，小苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境[13]。

2.3 大田移栽

移栽前1周灌足底水，保證小苗移栽時(shí)水分的供應(yīng)，移栽時(shí)間為7、8月份，在陰天或傍晚進(jìn)行移栽，選擇苗高15 cm以上的容器生根苗移栽，去掉營養(yǎng)杯，帶營養(yǎng)土栽植于圃地中，栽后立即澆水。

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)中，生長素用來誘導(dǎo)細(xì)胞和根的分化，而細(xì)胞分裂素用來促進(jìn)細(xì)胞分化和不定芽的分化，對(duì)根的分化具有抑制作用[14]。

通過比較分析確立了中荷64楊組織培養(yǎng)最佳配方，愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂5 g·L-1，pH值5.6。不定芽分化與繼代培養(yǎng)基：MS+ 6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂5 g·L-1，pH值5.6。生根培養(yǎng)基：1/2MS+ IBA0.2 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂5 g·L-1，pH值5.6。

不定芽的分化培養(yǎng)采用了6-BA和NAA來誘導(dǎo)，不定芽的再生頻率較高，同時(shí)6-BA/NAA的比值對(duì)不定芽分化的影響也較大，當(dāng)6-BA/NAA≤10時(shí)，會(huì)促進(jìn)不定芽的分化；6-BA/NAA>10時(shí)，會(huì)抑制不定芽的分化。本研究選取的比值為5，有利于不定芽的分化，可以提高不定芽的分化率。生根培養(yǎng)基采用1/2MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中無機(jī)鹽減半會(huì)促進(jìn)不定根的發(fā)育，同時(shí)IBA的濃度也會(huì)影響根細(xì)胞的分化，低濃度適宜根細(xì)胞的分化，較高濃度的IBA會(huì)對(duì)根的分化產(chǎn)生脅迫，阻礙根的生成。

容器移栽生根苗，選擇的營養(yǎng)杯大小要適中，過小不利于根的伸展，過大杯內(nèi)裝土過多，含水量大，根易腐爛，同時(shí)大田土、腐殖土、河沙三者比例要適宜。栽培初期水分不宜過大，澆透水后，霧面噴灑即可。大田移栽時(shí)要選擇通風(fēng)良好的地塊，如果地表土不松軟，可以摻一些腐殖土。苗生長期要勤觀察，發(fā)現(xiàn)病蟲害要采取有效的措施及時(shí)防治。

［1］王勝東，楊志巖.遼寧楊樹［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2006.

［2］陳章水.楊樹栽培實(shí)用技術(shù)［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2005.

［3］趙鑫聞.甜楊葉片高頻植株再生體系的建立［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（34）：6-9.

［4］李開隆，靳春蓮，李明德.香楊的組織培養(yǎng)和植株再生［J］.植物生理學(xué)通訊，2009，45（3）：281.

［5］鄭進(jìn)，康薇，洪華珠.中嘉8號(hào)楊的組織培養(yǎng)和植株再生［J］.黃石理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23（5）：19-23.

［6］馮連榮.蓋楊葉片高頻植株再生體系的建立［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（1）：209-211.

［7］趙鑫聞，彭儒勝，趙繼梅.遼寧楊葉片高頻植株再生體系的建立［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（10）：13-16.

［8］孫宇飛，高秀華，趙彥修，等.歐美107楊組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)的建立［J］.山東師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，19（2）：85-87.

［9］張蕾，蘇曉華，張冰玉，等.京2楊組培條件的優(yōu)化與再生體系建立［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2007，20(6):787-793.

［10］陶延珍，李楓，李毅.箭桿楊組織培養(yǎng)再生體系的建立［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，36（3）：203-207.

［11］張冰玉，蘇曉華，鄭書星.山新楊葉片高頻植株再生體系建立及其遺傳穩(wěn)定性［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，30（3）：68-73.

［12］樊軍鋒，李玲，韓一凡，等.84K楊葉片外植體再生系統(tǒng)的建立［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，17（2）：33-36.

［13］李云.林果花菜組織培養(yǎng)快速育苗技術(shù)［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2001.

［14］劉青林，馬祎，鄭玉梅.花卉組織培養(yǎng)［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2003.

（責(zé)任編輯：張素清）

S722.37

A

1001-1714（2017）03-0030-04

2017-03-13

“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD060040104）。

矯麗曼（1981-），女，工程師，主要從事楊樹轉(zhuǎn)基因育種和森保等方面研究工作。E-mail：jiaoliman1025@163.com。