祁佳佳孫艷袁昌青姜文靜趙涵曹遠盼劉秋艷

1.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科；3.病理科，青島 266000

CD44和CD133在口腔潛在惡性病變和口腔鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義

祁佳佳1孫艷1袁昌青2姜文靜2趙涵3曹遠盼1劉秋艷1

1.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科；3.病理科，青島 266000

目的 探究腫瘤干細胞標(biāo)記物CD44和CD133在口腔正常黏膜、口腔潛在惡性病變（OPMD）及口腔鱗狀細胞癌（OSCC）中的表達情況及相互關(guān)系，評估其作為OPMD惡性轉(zhuǎn)化早期診斷指標(biāo)的臨床價值。方法 回顧性分析60例OPMD患者、60例OSCC患者及10例口腔黏膜正常者的臨床資料，采用免疫組織化學(xué)雙重染色技術(shù)檢測各組病理組織中CD44與CD133的表達，分析CD44和CD133表達之間的關(guān)系及其與各臨床因素之間的關(guān)系。結(jié)果 口腔正常黏膜、OPMD、OSCC三組中，CD44的陽性表達率分別為100.00%、96.67%、71.67%（P<0.05），CD133的陽性表達率分別為0.00%、35.00%、63.33%（P<0.05）。CD44與CD133二者間的表達具有相關(guān)性（P<0.05），且其表達又都與OSCC的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論 CD44和CD133作為評估OPMD惡性轉(zhuǎn)化潛能的指標(biāo)具有重要臨床價值。

CD44； CD133； 口腔潛在惡性病變； 口腔鱗狀細胞癌； 臨床意義

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC，以下鱗狀細胞癌簡稱鱗癌）是人頭頸部惡性腫瘤中最常見的病理類型之一，其死亡率約占世界癌癥死亡率的第六位[1]。目前，綜合序列治療仍是治療OSCC的首選，但并不能完全消滅癌細胞，治療后仍易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致OSCC預(yù)后并不樂觀。研究[2]表明發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者5年生存率僅為30%左右。OSCC常由口腔潛在惡性病變（oral potentially malignant disorder，OPMD）發(fā)展而來。OPMD由WHO于2005年提出，指病變的某些組織學(xué)異常增加了其癌變的可能性，并建議取消以前癌前病變及癌前狀態(tài)的區(qū)別，統(tǒng)稱為OPMD。常見的OPMD有口腔紅斑、口腔白斑、口腔扁平苔蘚等[3]。

近年來OSCC相關(guān)分子生物學(xué)研究表明口腔黏膜上皮癌變是一個多階段、多步驟、多因素改變的復(fù)雜病理過程[4]，目前臨床尚無有效的預(yù)防和阻斷方法。倘若能早期檢測OPMD的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化，將對降低OPMD癌變率和OSCC發(fā)病率具有重要意義。近年發(fā)展起來的腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）理論為解釋腫瘤難以治愈的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了新途徑。腫瘤干細胞最早在白血病中被發(fā)現(xiàn)[5]，迄今為止，已在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌等腫瘤中被發(fā)現(xiàn)和證實，且越來越多學(xué)者主張腫瘤干細胞標(biāo)記物聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤發(fā)病機制研究[6]。

本課題組前期研究從舌鱗癌細胞系中分離出的CD 44+/CD 133+的細胞亞群具有明顯的裸鼠致瘤能力、克隆形成能力以及侵襲和遷移能力，在舌鱗癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中起到了重要作用[7]。本研究欲采用回顧性分析研究方法從組織學(xué)層面上探究正常的口腔黏膜、OPMD、OSCC組織中腫瘤干細胞標(biāo)記物CD44和CD133的表達情況，統(tǒng)計分析其相互關(guān)系及與各臨床因素之間的關(guān)系，評估CD44和CD133在口腔黏膜組織癌變過程中的表達規(guī)律及其臨床意義；進一步評估其是否可以作為OPMD癌變潛能的檢測指標(biāo)，為OPMD和OSCC的預(yù)防與早期治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究回顧性分析2010年5月—2015年5月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診的60例OPMD患者、60例OSCC患者及10例口腔黏膜正常患者的臨床資料，主要包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、病變部位、鱗癌的臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。所有患者之前均未接受過任何的治療措施。其中60例OPMD患者包括口腔扁平苔蘚30例、口腔白斑30例；60例OSCC患者中包括高、中、低分化鱗癌各20例。

1.2 主要試劑

CD133鼠抗人單克隆抗體（M iltenyi Biotechnology公司，德國），CD44兔抗人多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology公司，美國），Polymer雙染試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

收集患者病理組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)雙重染色技術(shù)分別檢測各病理組織中CD44與CD133的表達情況。

組織切片的制作和檢測：所有蠟塊標(biāo)本均切片4張，厚度3 μm，貼于防脫片，60 ℃烘烤2 h備用。采用免疫組織化學(xué)雙重染色Elivison法，對標(biāo)本進行檢測。CD44采用試劑公司提供的OSCC陽性組織作為陽性對照，CD133采用試劑公司提供的大腸鱗癌陽性組織作為陽性對照。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照，對照組與實驗組切片在同一條件下同時進行久紅/二氨基聯(lián)苯胺（diam inobenzidine，DAB）雙重顯色，蘇木素復(fù)染細胞核。

用光學(xué)顯微鏡（×400）觀察組織標(biāo)本并計數(shù)陽性細胞，CD44陽性表達久紅著色呈紅色；CD133陽性表達DAB著色呈棕黃色。以細胞膜呈紅色，細胞漿呈棕黃色為CD 44與CD 133聯(lián)合表達的雙陽性細胞。免疫組織化學(xué)雙重染色的結(jié)果由2名不了解患者臨床資料的高年資病理科醫(yī)師獨立進行判讀，結(jié)果差異時由兩位醫(yī)師討論后獲得一致性，采用雙評分半定量積分法進行評分。在高倍鏡（×400）下隨機選擇5個高倍視野，每個視野平均觀察100個細胞， 根據(jù)陽性細胞比例的平均值分為4級：陰性記為0分，陽性細胞≤10%記為1分，11%~50%記為2分，51%~ 75%記為3分，陽性細胞≥76%記為4分。CD44染色強度無色記為0分，淡粉色記為1分，粉色記為2分，紅色記為3分，橘紅色記為4分；同理，CD133染色強度無色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，紅棕色記為3分，棕褐色記為4分（染色深淺需與背景著色相對比）。兩分數(shù)乘積0~3分記為（-），4~5分記為（+），6~7分記為（++），8分以上記為（+++），即陰性（-）、陽性（+）、（++）、（+++）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。組織標(biāo)本中CD44、CD133的表達強度比較采用秩和檢驗；CD44與CD133表達關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)；臨床資料中CD133、CD44表達強度比較采用卡方檢驗（CD133、CD44在不同病變部位的表達強度比較采用秩和檢驗）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

組織標(biāo)本中CD44陽性表達主要定位于細胞膜，久紅著色呈紅色；CD133陽性表達主要定位于細胞漿，DAB著色呈棕黃色；細胞膜呈紅色、細胞漿呈棕黃色為CD44與CD133聯(lián)合表達的雙陽性細胞。各組CD44與CD133的表達見圖1。

圖1 各組病理組織中CD44、CD133的表達Fig1 Expression of CD133 and CD44 in pathological tissue of every group

口腔正常黏膜、OPMD、OSCC三組中，CD44的陽性表達率分別為100.00%（10/10）、96.67%（58/60）、71.67%（43/60），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，表1）；CD133的陽性表達率分別為00.00%（0/10）、35.00%（21/60）、63.33%（38/ 60），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，表1）。

表1 各組CD44、CD133表達強度的比較Tab1 Expression of CD44 and CD133 in every group

CD44與CD133表達關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示，CD44與CD133表達具有關(guān)聯(lián)性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05，表2）。

CD44、CD133表達與臨床因素的相關(guān)性分析見表3。表3結(jié)果表明，CD44、CD133在患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史及病變部位的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），在鱗癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明，CD44、CD 133的表達與OSCC的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表2 CD44與CD133表達之間的關(guān)系Tab 2 Relationship between the expression of CD44 and CD133

表3 CD44、CD133表達與臨床因素的關(guān)系Tab 3 Correlation of CD44 and CD133 expression with clinical factors

3 討論

OSCC是人頭頸部惡性腫瘤中最常見的類型之一，且預(yù)后較差[8]，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療成為提高OSCC患者生存率的關(guān)鍵。上皮異常增生被認為是OPMD發(fā)展為OSCC的高危因素，但某些OPMD，例如口腔扁平苔蘚，其組織學(xué)檢查常不伴有上皮異常增生，仍具有惡變潛能，其癌變率為1%~5.3%[9]。相較于傳統(tǒng)的組織病理學(xué)檢查，分子生物學(xué)檢查為早期檢測OPMD惡變潛能提供了新途徑。近年發(fā)展起來的腫瘤干細胞理論為解釋腫瘤難以治愈的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了新研究思路。大量研究[10-13]報道，CD44和CD133可作為腫瘤干細胞標(biāo)記物用于肺癌、大腸癌、頭頸部鱗癌等多種腫瘤生物學(xué)研究。本課題組前期研究[7]證明，人舌鱗癌細胞系中CD44+/CD133+細胞亞群在OSCC的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移中起到重要作用。本研究通過檢測CD 44和CD 133在正常口腔黏膜、OPMD和OSCC組織中的表達情況，統(tǒng)計分析二者之間的關(guān)系及其與各臨床因素間的相互關(guān)系，探究CD44和CD133在口腔黏膜組織癌變過程的表達規(guī)律和臨床意義，進一步評估二者作為檢測OPMD惡變潛能和早期診斷指標(biāo)的價值。

本研究結(jié)果顯示，CD44在正?？谇火つぶ芯钊?，同時還觀察到其在基底層和棘層深部著色最強，隨著向表層的移行，其著色逐漸變淡，角質(zhì)層無明顯著色。這說明CD44可能為上皮細胞的分化和向表層移動提供定向信號[14]。在OPMD和OSCC組織中， CD44表達強度逐漸降低（P<0.05），這說明在正?？谇火つぐ┳冞^程中，可能由于CD44表達降低，對上皮細胞分化和向表層移動的指導(dǎo)作用降低，使得上皮細胞出現(xiàn)異常分化和異常增殖，從而可能導(dǎo)致惡變率提高。同時研究[15]表明，口腔癌的發(fā)生與局部刺激因子造成基因損傷有關(guān)，故CD44扮演的角色還可能為：CD44介導(dǎo)上皮細胞間黏附，從而維持上皮結(jié)構(gòu)完整性，其表達降低，細胞間黏附作用降低，細胞間隙增大，組織更易受外界刺激損傷，惡變率隨之提高。

本實驗研究并未在正?？谇火つど掀ぶ邪l(fā)現(xiàn)有CD133表達。據(jù)已有研究[16]報道，包括口腔黏膜上皮在內(nèi)的多種正常組織均發(fā)現(xiàn)CD133表達。分析其原因可能為CD133在正?？谇火つど掀け磉_過少，而切片層面恰好無表達，或者本研究正常黏膜例數(shù)較少。在OPMD和OSCC中CD133表達逐漸增高。正?？谇火つど掀そM織主要由三種細胞成分組成，分別為口腔黏膜干細胞、短暫擴增細胞以及終末分化細胞。細胞的惡性轉(zhuǎn)化可能常常需要細胞內(nèi)多個基因突變的積累，鑒于終末分化細胞生命期較短，理論上無法完成惡性轉(zhuǎn)化所需要的基因突變積累，而口腔黏膜干細胞則恰與之相反，同時口腔黏膜干細胞CD133、sox2等表達較高[17]。雖然本研究結(jié)果并未在正?？谇火つど掀ぶ邪l(fā)現(xiàn)CD133表達，但正?？谇火つど掀ぶ锌赡苋源嬖谏贁?shù)CD 133+細胞，該CD133+細胞可能為口腔黏膜干細胞，具有較強的更新、分化及增殖能力，且有足夠時間及壽命來接受細胞惡性轉(zhuǎn)化所需的遺傳信息改變，故CD133+細胞越多，其接受遺傳信息改變機率越大，惡變機率可能越大。

CD44與CD133表達關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示，兩者存在一定關(guān)系。分析其關(guān)聯(lián)性：腫瘤干細胞與Wnt、MAPK、Notch等信號通路存在一定聯(lián)系[18]，其中Wnt信號通路在生物體發(fā)育過程中高度保守，通過參與細胞增殖、分化及凋亡等過程，對生物體的發(fā)育具有重要調(diào)控作用。CD133+細胞可以活化Wnt信號通路[19]，也有研究表明Wnt信號通路的活化可以促進細胞中CD133的表達。異常活化的Wnt信號通路能夠激發(fā)LEF/TCF/β-catenin級聯(lián)反應(yīng)使得其下游基因表達紊亂，其中就包括CD44[20]。這可能為CD44與CD133關(guān)聯(lián)性提供了合理的解釋，但二者在口腔黏膜癌變過程中的相互關(guān)系仍需進一步研究。

此外，本研究OSCC組織分組結(jié)果顯示CD44和CD133在OSCC中的表達與OSCC的病理分級相關(guān)，分化程度越低，CD44和CD133表達越強（P<0.05）。惡性腫瘤的分化程度越低，往往惡性程度越高，患者的預(yù)后越差。這就提示CD44和CD133在評估OSCC的惡性程度和預(yù)后中具有重要意義。

在CD44、CD133與臨床各因素相關(guān)性分析中，其表達與患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史及病變部位均無相關(guān)性（P>0.05），與鱗癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性（P<0.05）。這說明可能口腔黏膜癌變形成腫瘤后，在進入血液和淋巴循環(huán)的腫瘤細胞中，CD44+腫瘤細胞相對于CD44-腫瘤細胞更易同質(zhì)黏附形成腫瘤微栓，也更易與血管和淋巴管內(nèi)皮細胞及基膜發(fā)生異質(zhì)黏附，使得腫瘤微栓更易定植[21]，而在這些定植的腫瘤微栓中CD133+腫瘤細胞具有更強的克隆形成能力，故CD44+/CD133+的腫瘤細胞具有更強的形成瘤體及腫瘤轉(zhuǎn)移灶的能力。

綜上，CD44、CD133在口腔正常黏膜向OPMD及OSCC的發(fā)展過程中均具有重要的意義，而CD133的表達率、表達范圍及數(shù)量上較CD44陽性細胞少，表達更顯腫瘤趨化性，在瘤體中的表達更加中心化，有更高的特異性，在口腔黏膜癌變發(fā)生發(fā)展過程中可能具有更重要的意義。二者的具體作用機制仍不清楚，亟待進一步研究。CD44和CD133作為早期檢測OPMD的指標(biāo)具有可行性。CD133作為口腔正常黏膜向OPMD及OSCC的發(fā)展過程中的一個關(guān)鍵分子，進一步深入研究其作用機制將為OPMD癌變的早期檢測、治療選擇、預(yù)后判斷提供具有重要價值的參考依據(jù)。

[1] Ravindran G, Devaraj H. Aberrant expression of CD133 and musashi-1 in preneoplastic and neoplastic human oral squamous epithelium and their correlation with clinicopathological factors[J]. Head Neck, 2012, 34(8):1129-1135.

[2] Abdulmajeed AA, Dalley AJ, Farah CS. Putative cancer stem cell marker expression in oral epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma[J]. J Oral Pathol Med, 2013, 42 (10):755-760.

[3] Yardimci G, Kutlubay Z, Engin B, et al. Precancerous lesions of oral mucosa[J]. World J Clin Cases , 2014, 2(12):866-872.

[4] Jessri M, Dalley AJ, Farah CS. MutSα and MutLα immunoexpression analysis in diagnostic grading of oral epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol, 2015, 119(1):74-82.

[5] Lapidot T, Sirard C, Vormoor J, et al. A cell initiating human acute myeloid leukaem ia after transplantation into SCID mice[J]. Nature, 1994, 367(6464):645-648.

[6] Shakib K, Schrattenholz A, Soskic V. Stem cells in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Br J Oral Maxillofac Surg, 2011, 49(7):503-506.

[7] Sun Y, Han J, Lu Y, et al. Biological characteristics of a cell subpopulation in tongue squamous cell carcinoma[J]. Oral Dis, 2012, 18(2):169-177.

[8] Price KA, Cohen EE. Current treatment options for metastatic head and neck cancer[J]. Curr Treat Options Oncol, 2012, 13(1):35-46.

[9] Sun L, Feng J, Ma L, et al. CD133 expression in oral lichen planus correlated with the risk for progression to oral squamous cell carcinoma[J]. Ann Diagn Pathol, 2013, 17(6):486-489.

[10] Liu W, Wu L, Shen XM, et al. Expression patterns of cancer stem cell markers ALDH1 and CD133 correlate with a high risk of malignant transformation of oral leukoplakia [J]. Int J Cancer, 2013, 132(4):868-874.

[11] Hsu HS, Huang PI, Chang YL, et al. CucurbitacinⅠinhibitstumorigenic ability and enhances radiochemosensitivity in nonsmall cell lung cancer-derived CD133-positive cells[J]. Cancer, 2011, 117(13):2970-2985.

[12] Zhang Q, Shi S, Yen Y, et al. A subpopulation of CD133+cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy[J]. Cancer Lett, 2010, 289(2):151-160.

[13] Damek-Poprawa M, Volgina A, Korostoff J, et al. Targeted inhibition of CD133+cells in oral cancer cell lines[J]. J Dent Res, 2011, 90(5):638-645.

[14] Calenic B, Paun IA, van Staden RI, et al. Novel method for proliferation of oral keratinocyte stem cells[J]. J Periodont Res, 2014, 49(6):711-718.

[15] Felthaus O, Ettl T, Gosau M, et al. Cancer stem cell-like cells from a single cell of oral squamous carcinoma cell lines[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 407(1):28-33.

[16] 農(nóng)曉琳, 徐銘竹, 李昊, 等. CXCR4、CD44、CD133表達在舌鱗狀細胞癌患者生存分析中的價值[J]. 中國腫瘤臨床, 2013, 40(14):832-837.

Nong XL, Xu MZ, Li H, et al. Survival analysis of tongue squamous cell carcinoma with CXCR4, CD44 and CD133 expression[J]. Chin J Clin Oncol, 2013, 40 (14):832-837.

[17] 陳萬濤. 口腔頜面-頭頸部腫瘤生物學(xué)[M]. 上海: 上海交通大學(xué)出版社, 2015:53-57.

Chen WT. Oncobiology of head and neck carcinomas[M]. Shanghai: Shanghai Jiaotong University Press, 2015:53-57.

[18] de Sousa e Melo F, Vermeulen L. Wnt signaling in cancer stem cell biology[J]. Cancers, 2016, 8(7):60.

[19] Barcelos LS, Duplaa C, K r?nkel N, et al. Human CD133+progenitor cells promote the healing of diabetic ischem ic ulcers by paracrine stimulation of angiogenesis and activation of Wnt signaling[J]. Circ Res, 2009, 104(9):1095-1102.

[20] Yi XJ, Zhao YH, Xiao LX, et al. Abrrant Wnt/β-catenin signaling and elevated expression of stem cell proteins are associated with osteosarcoma side population cells of high tumorrigenicity[J]. Mol Med Rep, 2015, 12(4):5042-5048. [21] Pontes HA, Pontes FS, Silva BS, et al. Extranodal nasal NK/T-cell lymphoma: a rare oral presentation and FASN, CD44 and GLUT-1 expression[J]. Braz Dent J, 2013, 24 (3):284-288.

（本文編輯 李彩）

Clinical significance of CD44 and CD133 expression in oral potentially malignant disorder and oral squamous cell carcinoma

Qi Jiajia1, Sun Yan1, Yuan Changqing2, Jiang Wenjing2, Zhao Han3, Cao Yuanpan1, Liu Qiuyan1. (1. School

of Stomatology, Qingdao University, Qingdao 266000, China; 2. Dept. of Stomatology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, China; 3. Dept. of Pathology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, China)

Supported by: Shandong Graduate Education Innovation Program (SDYY11184). Correspondence: Yuan Changqing, E-mail: ycq613@163.com.

ObjectiveThis study aims to investigate the expression and relationship of CD44 and CD133 in normal oral mucosa, oral potentially malignant disorder (OPMD), and oral squamous cell carcinoma (OSCC). This work also analyzes the relationship between such expression and clinical factors. This study intends to evaluate the clinical value of using CD44 and CD133 as indices to evaluate the carcinogenic potential of OPMD.MethodsClinical data from 60 patients with OPMD, 60 patients with OSCC, and 10 cases of normal oral mucosa were analyzed. Double immunohistochemical analysis was applied to investigate the expression of CD44 and CD133 in paraffin sections of normal oral mucosa, OPMD, and OSCC tissues. Subsequently, the relationships between such expression and clinical factors were analyzed.ResultsThe positive rates of CD44 expression in the normal oral mucosa, OPMD, and OSCC tissues were 100.00%, 96.67%, and 71.67% (P<0.05), respectively. Meanwhile, the positive rates of CD133 expression in the normal oral mucosa, OPMD, and OSCC tissues were 0.00%, 35.00%, and 63.33% (P<0.05), respectively. The expression of CD44 and CD133 was found to be correlated (P<0.05). Such expression was related to the clinical stages and lymphatic metastasis of OSCC (P<0.05).ConclusionCD44 and CD133 can be used individually as clinical indices to evaluate the carcinogenic potential of OPMD.

CD44; CD133; oral potentially malignant disorder; oral squamous cell carcinoma; clinical significance

R 781.2

A

10.7518/hxkq.2017.03.015

2016-08-11；

2016-12-09

山東省研究生教育創(chuàng)新計劃（SDYY11184）

祁佳佳，碩士，E-mail：qq136057080@163.com

袁昌青，副教授，碩士，E-mail：ycq613@163.com