高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定豬肉中克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法學(xué)考察

郭麗娜 王蕾 金善玉

目的建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定豬肉中克侖特羅和沙丁胺醇含量的方法學(xué)考察。方法以克侖特羅-D9、沙丁胺醇-D3為內(nèi)標(biāo)物，選擇離子對為克侖特羅m/z 277→m/z 203；沙丁胺醇m/z 240→m/z 148；克侖特羅-D9 m/z 280→m/z 204；沙丁胺醇-D3 m/z 243→m/z 151。結(jié)果克侖特羅和沙丁胺醇的精密度和重復(fù)性良好、線性范圍分別為13．18～79．08 ng/ml，9．85～59．10 ng/ml且回收率良好。結(jié)論建立的方法準(zhǔn)確且靈敏度高，適用于克侖特羅和沙丁胺醇的殘留量測定。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；克侖特羅；沙丁胺醇；方法學(xué)

β-受體激動劑是一類具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、加速脂肪分解的興奮劑。近年來，被一些不法畜產(chǎn)品生產(chǎn)者用作“飼料添加劑”。人類長期食用含有此類添加劑的豬肉或其內(nèi)臟會產(chǎn)生心跳加快、心率失常、肌肉震顫等不良反應(yīng)[1]?？藖鎏亓_和沙丁胺醇已被我國列為禁用藥[2]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器 LC-2030c 3D高效液相色譜儀（日本島津）；LCMS-8040三重四級桿質(zhì)譜儀（日本島津）；高速冷凍離心機(jī)（上海力申）；SartoriusPB-10型pH酸度計(jì)（賽多利斯）；BT125D型電子天平（賽多利斯）。

1.1.2 試劑 甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、β-葡萄糖醛甙酶（CNW公司）、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品（批號100204-200702，純度99.50%，中國藥品生物制品檢定所）、鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品（批號11001，純度99.1%，中國計(jì)量科學(xué)研究院）、克侖特羅-D9（純度99.70%，進(jìn)口）、沙丁胺醇-D3（純度99.3%，進(jìn)口）。其他試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制 準(zhǔn)確稱取適量的沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制 分別吸取1.00 ml沙丁胺醇、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至100 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。

準(zhǔn)確吸取0.10、0.20、0.30、0.40、0.60 ml的克侖特羅和沙丁胺醇混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1 μg/ml)置于10 ml容量瓶中，分別加入濃度為1 μg/ml的克侖特羅-D9和沙丁胺醇-D3內(nèi)標(biāo)儲備溶液0.5 ml用甲醇定容至刻度。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品提取 稱取2 g樣品于50 ml離心管中，加8 ml乙酸鈉緩沖液，混勻，再加50 μl β-葡萄糖醛甙酶，混勻后，37℃水浴水解12 h。

加100 μl 100 ng/ml的內(nèi)標(biāo)工作液于待測樣品中。置于水平振蕩器振蕩，離心，取上清液加入0.1 mol/L高氯酸溶液5 ml，混勻，用高氯酸調(diào)節(jié)pH到1。離心后，將上清液轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中，用10 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH到11，加10 ml飽和氯化鈉溶液和10 ml異丙醇-乙酸乙酯（6+4）混合溶液，提取，離心。轉(zhuǎn)移全部有機(jī)相，用氮?dú)獯蹈?。? ml乙酸鈉緩沖液，超聲混勻后備用。

1.3.2 凈化 將上述殘?jiān)芤荷详栯x子交換小柱，依次用2 ml水、2 ml 2%甲酸水溶液和2 ml甲醇洗滌柱子并抽干，最后用2 ml的5%氨水甲醇溶液洗脫柱子上的待測成分，用氮?dú)獯蹈伞?/p>

準(zhǔn)確加入200μl 0.1%甲酸/水-甲醇溶液（95+5），混勻并轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，離心。

1.4 測定條件及過程

1.4.1 測定條件 柱溫：30 ℃；流速：0.2 ml/min；離子源：電噴霧（ESI），正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。流動相：A：0.1%甲酸/水，B：0.1%甲酸/乙腈。

1.4.2 測定過程 將樣品和標(biāo)準(zhǔn)使用液注入儀器，以其標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量子離子的保留時間為依據(jù)，用內(nèi)標(biāo)法求出樣液中被測物質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍

由標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，克侖特羅的濃度在13.18～79.08 ng/ml范圍，呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.981 6x+0.028 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4；沙丁胺醇的濃度在9.85～59.10 ng/ml范圍，呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=1.114 9x-0.015 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9。

2.2 檢出限

將克侖特羅和沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋，以信噪比為3：1或2：1時相應(yīng)濃度作為檢出限。計(jì)算得出克侖特羅和沙丁胺醇的檢出限分別為0.036 μg/kg、0.015 μg/kg。

2.3 精密度

將同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，每次2 μl，測定其峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值，計(jì)算克侖特羅和沙丁胺醇峰面積比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.9%、2.1%，表明精密度良好。

2.4 重復(fù)性

稱取2.0 g試樣6份，精密加入濃度為1 μg/ml的克侖特羅-D9和沙丁胺醇-D3內(nèi)標(biāo)儲備溶液0.01 ml，余下過程同1.3。由表1可見，使用該方法測定克侖特羅和沙丁胺醇的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，表明重復(fù)性良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

稱取1.0 g試樣6份，加入不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液及內(nèi)標(biāo)儲備液，余下制備及測定過程同1.3及1.4。克侖特羅的回收率在105.16%～109.77%，RSD為1.7%；沙丁胺醇的回收率在102.87%～107.38%，RSD為1.9%。表明方法可行。

3 討論

畜產(chǎn)品中β-受體激動劑的殘留會使食用者產(chǎn)生蓄積中毒，嚴(yán)重危害國內(nèi)的食品安全。目前，針對克侖特羅的殘留檢測方法主要有高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[3]、氣相色譜法[4]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]和ELISA法[6]等；而對沙丁胺醇的殘留檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[7]、高效液相色譜法[8]和ELISA法[9]等。本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對豬肉中克侖特羅和沙丁胺醇?xì)埩袅康耐瑫r測定進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果證明該方法簡便、準(zhǔn)確，適用于β-受體激動劑的殘留量測定。

表1 克侖特羅和沙丁胺醇的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（單位：μg/kg）

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[3] 吳澤君，龍凌云，郭世明． 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究豬毛發(fā)中克侖特羅和萊克多巴胺的殘留及代謝規(guī)律[J]． 中國獸藥雜志，2010，44（8）：22-26．

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The Methodology of HPLC-Ms Method for Simultaneous Determination of Clenbuterol and Salbutamol in Pork

GUO Li'na WANG Lei JIN Shanyu The Physical Chemistry of Food Off i ce, Yanbian Institute for Food and Drug Control, Yanji Jilin 133000, China

ObjectiveTo develop a HPLC-Ms method for simultaneous determination of clenbuterol and salbutamol in pork.MethodsClenbuterol-D9 and Salbutamol-D3 were used as internal standard and the ion pair for Clenbuterol m/z 277 → m/z 203; Salbutamol m/z 240 → m/ z 148; Clenbuterol-D9 m/z 280 → m/z 204; Salbutamol-D3 m/z 243 →m/Z 151.ResultsThe precision and reproducibility of clenbuterol and salbutamol were good, the linear range was 13.18 to 79.08 ng/ml, 9.85 to 59.10 ng/ml and the recovery rate was good.ConclusionThis method is accurate and sensitive and it is suitable for the determination of the amount of Salbutamol and Clenbuterol residues.

high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; clenbuterol; salbutamol; methodology

S859．84

A

1674-9316（2017）11-0012-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．11．006

延邊州食品藥品檢驗(yàn)所食品理化室，吉林 延吉 133000

金善玉