魏業(yè)東　黃嬛　李明娟　蔣小紅

摘 要：微小RNA（miRNA）是一段小型非編碼RNA序列，它調(diào)控著某些編碼細胞重要功能的基因的表達，比如細胞的增殖，分化和凋亡。某個特定的miRNA可能扮演著抑癌基因或者致癌基因的角色。這里，我們對miRNA在結(jié)腸癌中的潛在作用：作為結(jié)直腸癌早期診斷、預后和化療敏感性預測標志物的影響作一綜述。

關鍵詞：結(jié)腸癌 miRNA 診斷 預后 化療敏感性預測

在世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）在女性易發(fā)癌癥中排名第三，在男性中排名第二。每年大約超過一百萬人患結(jié)直腸癌并且超過五十萬人死于結(jié)直腸癌。結(jié)直腸癌的發(fā)生率有很大差異，主要取決于生活習慣，環(huán)境和基因等方面[1]。流行病學的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)造成結(jié)直腸癌的危險因素，主要包括年齡，家族史，腸炎。同時，也發(fā)現(xiàn)了一些可預防的因素，例如肥胖，過度飲酒，過度食肉，高膽固醇的飲食，吸煙，較低的社會地位以及久坐的生活方式。

預后取決于診斷時的癌癥分期。美國癌癥聯(lián)合會和國際抗癌聯(lián)盟的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期系統(tǒng)是目前首選的結(jié)直腸癌分期系統(tǒng)[2]。結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)會有90%的患者有5年生存期，相比于遠端轉(zhuǎn)移的發(fā)生，只有12%的患者有5年生存期。結(jié)直腸癌的早期癥狀并不明顯，結(jié)直腸癌的診斷很大程度上依賴于篩查[1]。在過去的近20年里，篩選手段的引進包括內(nèi)鏡檢查術，糞便潛血測試（fecal occult blood test， FOBT）和鋇餐灌胃都改良了結(jié)直腸癌的早期診斷，在很多國家，結(jié)直腸癌的發(fā)生率和死亡率都呈現(xiàn)出了降低的趨勢。不幸的是，只有不到40%的結(jié)直腸癌患者被及時診斷出了疾病。[3]另外，在接近50%的患者中，這種診斷是不夠的。內(nèi)鏡檢查術是有創(chuàng)傷的、昂貴的，而微創(chuàng)的、便宜的FOBT僅對47%-73%的患者敏感[1，2]，因此，開發(fā)準確的、微創(chuàng)的診斷和預后標志物是非常有必要的。

最近的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（miRNA）在結(jié)直腸癌的發(fā)展和治療的過程中發(fā)揮著至關重要的作用。本文重點講述miRNA在結(jié)直腸癌診斷和預后中的作用，以及在預測化療敏感性中的作用。

一、miRNA概況

1993年，命名為lin-4的第一個miRNA在秀麗新小桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)可檢索到的在線數(shù)據(jù)庫，2588個成熟的人類miRNAs已經(jīng)被成功建立。miRNAs是小分子（18-25個核苷酸）RNA聚合物，miRNAs的前體表達后被蛋白Dicer切割后形成成熟的miRNA結(jié)構(gòu)[4]。它們直接嵌入或者通過影響mRNA分子的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控人類超過30%的基因，最終來調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯。miRNA可以通過融入RNA誘導的沉默復合體（RISC）和綁定一個靶標mRNA分子來完成它的調(diào)控。miRNA影響mRNA的機制主要是通過綁定mRNA，導致mRNA的降解或者抑制其轉(zhuǎn)錄。如果miRNA和mRNA之間存在準確的堿基互補配對，mRNA就被降解，反之，mRNA就被沉默。其他的機制包括直接綁定DNA，表觀遺傳學中的甲基化，以及靶向mRNA綁定蛋白質(zhì)。一個單鏈的miRNA可以影響很多mRNA，然而一個單鏈的mRNA可以被很多miRNA影響 。

miRNA的作用是依賴于mRNA的功能并且二者相互作用的。因此，miRNA具有某些高級功能，比如減少腫瘤抑制劑的表達，促進細胞增殖和腫瘤形成。miRNA在腫瘤抑制功能上的減弱可能促進了腫瘤的形成。其他miRNA調(diào)控著細胞增殖和侵襲以及促進轉(zhuǎn)移。微小RNA的基因通常位于特定的基因組，這些基因組對于雜合性和擴增性的丟失異常敏感。自從人類發(fā)現(xiàn)miRNA和細胞的分化，凋亡以及增殖密切相關后，人們越來越多地關注miRNA與人類疾病的關系，比如結(jié)直腸癌。

二、miRNA與早期診斷

當結(jié)直腸癌在最早期階段被診斷出來，患者就能接收到最成功的治療，尤其是診斷出結(jié)直腸癌并且在發(fā)生轉(zhuǎn)移之前，手術切除被認為是唯一有效的治療手段。對診斷早期結(jié)直腸癌最廣泛的方法是FOBT和結(jié)腸鏡檢查。盡管這些試驗已經(jīng)提高了結(jié)直腸癌的生存率，但是FOBT敏感性較低且結(jié)腸鏡費用昂貴、創(chuàng)傷大。另外，某些食物和藥物會導致FOBT的假陽性結(jié)果。近幾年的研究已經(jīng)表明，miRNA和結(jié)直腸癌之間存在著相關性。大量相關工作已經(jīng)顯示miRNA可以作為結(jié)直腸癌早期診斷可靠的、無創(chuàng)的、高敏感性的生物標志物。

胃腸道潰瘍時可觀察到炎性細胞連續(xù)不斷地釋放到腸腔內(nèi)，并且可以在糞便中檢測到。第一次在糞便中檢測miRNA的研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者的糞便中有高表達的miRNA，這個數(shù)據(jù)證明病人腫瘤組織樣本與miRNA有明顯的相關性? 。Ahmed等人最近研究了來自不同結(jié)直腸癌老鼠模型的腫瘤組織樣本，發(fā)現(xiàn)miR-135b涉及到一個復雜的反饋回路。分子通路的突變通常發(fā)生在涉及APC和PTEN/PI3K的結(jié)直腸癌中，這種突變會促進miR-135b的過表達，并且它本身會促進腫瘤的發(fā)生和進展。另外一個研究發(fā)現(xiàn)miR-135b在結(jié)直腸癌中表達量上升，而且癌旁組織和正常組織比也上升了。腸炎病人和健康對照組相比，用糞便樣品發(fā)現(xiàn)從腺瘤到癌miR-135b有增加的趨勢。同時發(fā)現(xiàn)手術切除結(jié)直腸癌或晚期腺瘤后糞便中的miR-135b含量顯著下降。糞便中miR-135b的敏感度在不同組織中是不同的，在結(jié)直腸癌中是78%，在晚期腺瘤中是73%，在普通腺瘤中是65%;這種特異性占68% 。

Koga等人發(fā)現(xiàn)糞便中miR-106a在提高FOBT敏感性方面也是很有意義的。他們從FOBT殘渣中提取糞便中的RNA去分析潛在的miRNA標志物，發(fā)現(xiàn)糞便中miR-106a的敏感性和特異性分別是34.2%和97.2%，而FOBT的特異性和敏感性分別是60.7%和98.1%。重要的是，糞便中miR-106a對FOBT結(jié)果的分析顯示敏感度和特異度分別是70.9%和96.3%。四分之一的假陰性的結(jié)直腸癌患者通過增加糞便中miR-106a分析后發(fā)現(xiàn)是真陽性，也就是說糞便中miR-106a分析大大加強了篩查試驗的敏感性。Koga等人通過他們的早期研究驗證了對FOBT殘渣的使用，他們發(fā)現(xiàn)FOBT殘渣在4℃放了5天后和之前相比分離的miR-106a的質(zhì)量和數(shù)量并沒有太大差異。

目前應用最多的結(jié)直腸癌血清標志物是癌胚抗原（CEA），但是在其他一些非癌環(huán)境中也檢測到它的表達量上升了，例如在腸炎，肝炎，肺炎和胰腺炎中。研究人員發(fā)現(xiàn)在血清和血漿中有miRNA的存在。它們被包裹在微泡和外泌體中，因此免疫了核糖核酸酶的降解 。它們在各種其他環(huán)境中也是穩(wěn)定的，比如低/高 PH ，反復凍融，還有長期存儲。

在很多最近的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌病人和健康人相比血漿中某些特殊的miRNA不是上調(diào)就是下調(diào)，同時它們對于診斷結(jié)直腸癌和腺瘤的作用也被發(fā)現(xiàn)。Kanaan等人 把8個血漿miRNA分為一組，另外3個血漿miRNA分為一組，以此精確地區(qū)分患有結(jié)直腸腺瘤的病人和不含結(jié)直腸腺瘤的病人。他們通過miRNA能夠從所有的結(jié)直腸癌分型中分清患有結(jié)直腸腺瘤的病人。Yong等人也發(fā)現(xiàn)了一組miRNA，其中含有3個miRNA，它們在結(jié)直腸癌患者中的表達量也上升了，這跟它們在各自結(jié)直腸癌組織樣本中的表達量有關。他們也解釋說，與對照組病人相比結(jié)直腸癌患者從早期到晚期這些miRNA在血漿中有一個上升趨勢。更進一步說，作為結(jié)直腸癌診斷的標志物，這3個miRNA具有80%的敏感度和84.4%的特異度。另外的20個miRNA不是上調(diào)就是下調(diào)，通過它們在血清水平的變化可以準確區(qū)分Ⅳ期結(jié)直腸癌患者和對照組病人。隨后的研究導致了最小二乘回歸模式的發(fā)展，它能夠基于Ⅳ期結(jié)直腸癌患者血清中的miRNA來準確分析病人處于Ⅰ期還是Ⅱ期 。Luo等人證明了9種血清中miRNA區(qū)分結(jié)直腸癌患者和對照組病人的作用。Gopalan等人發(fā)現(xiàn)miR-1288不僅和腫瘤的分期有關，還和胃腸道的位置有關;距離結(jié)腸位置越遠miR-1288的表達量越高。

在結(jié)直腸癌患者血清中miRNA的研究中，穩(wěn)定可靠的對照組對于實驗數(shù)據(jù)的準確性是至關重要的。Hu等人發(fā)現(xiàn)miR-1228在不同類型的癌癥病人中是穩(wěn)定表達的，其中包括結(jié)直腸癌以及結(jié)直腸癌的不同分期。因此，他們建議miR-1228是研究結(jié)直腸癌中miRNA最穩(wěn)定的內(nèi)參。

三、miRNA和預后

盡管結(jié)直腸癌的早期診斷使疾病的死亡率得到了降低，但是當患者被頻繁地診斷為晚期的時候人們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的預后是比較差的。目前對于結(jié)直腸癌的管理依賴于臨床和病理學因素，其中包括腫瘤的大?。═），淋巴結(jié)的擴散范圍（N），是否發(fā)生轉(zhuǎn)移（M），或者TNM分期，腫瘤邊緣，分化程度，淋巴管侵襲。越來越多的證據(jù)顯示分子標志物在評價預后和臨床治療上有著重要意義。很多研究論證了miRNA作為分子標志物的作用。

第一個建立miRNA和結(jié)直腸癌關系的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-200c和生存率之間存在著關聯(lián)。迄今為止，多項研究顯示無論miRNA的減少還是增加都和預后較差相關。Toiyama等人的研究發(fā)現(xiàn)Ⅳ期結(jié)直腸癌患者與Ⅰ-Ⅲ期結(jié)直腸癌患者相比，血清中miR-200c的含量有所增加，進一步發(fā)現(xiàn)miR-200c可以作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復發(fā)的預測因子。miR-200c也被發(fā)現(xiàn)可以作為結(jié)直腸癌獨立的預后指示器。另外一個研究也發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者與正常人相比血清中的miR-200c含量是上升的 。手術切除的結(jié)直腸癌患者和化療的結(jié)直腸癌患者血清中miR-200c的含量也進行了比較。具有良好預后的結(jié)直腸癌患者血清中miR-200c含量恢復到了正常水平，而結(jié)直腸癌復發(fā)或者轉(zhuǎn)移的患者血清中miR-200c的含量仍然較高或者是短暫降低后又很快升高。Hur等人[16]發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移瘤中miR-200c的含量比原發(fā)瘤要高。

另外一個可能成為預后標志物的miRNA是miR-21。在6種不同的癌癥中，miR-21出現(xiàn)了上調(diào)，當然這其中就包括結(jié)直腸癌。以前的研究顯示miR-21高表達的腫瘤組織樣本是與淋巴結(jié)和遠端轉(zhuǎn)移有關的;它也和結(jié)直腸癌的臨床分期有關。另有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者血清中miR-21的含量是上升的 。另外，通過血清中miR-21可以精確地區(qū)分健康對照組的腺瘤和結(jié)直腸癌患者的惡性腫瘤。血清中上調(diào)的miR-21也跟腫瘤大小，遠端轉(zhuǎn)移，生存質(zhì)量有關，可以單獨作為結(jié)直腸癌預后的標志物。Schetter等人基于一個84個美國結(jié)直腸癌患者的群體和一個113個中國結(jié)直腸癌患者的群體得出，miR-21表達量上升和結(jié)直腸癌預后有明顯的關系。miR-21表達量上升必然有一個糟糕的預后，并且對于癌癥分期和臨床結(jié)果是獨立的。隨后的研究是針對不同種族的病人，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21可以作為一種預后生物標志物，而且是不分種族的。

Kjaer-Frifeldt等人在Ⅱ期結(jié)直腸癌病人中針對miR-21能否作為預后指示器使用做了另外一項群體研究。作者認為miR-21可以和分期分型的傳統(tǒng)手段相結(jié)合。他們的觀點是miR-21高表達的病人更容易從輔助化療中獲益。然而，Oue等人發(fā)現(xiàn)，在一個Ⅱ期結(jié)直腸癌的日本患者群體中，miR-21的高表達和較差的輔助化療相關。筆者認為并不是miR-21的低表達就意味著輔助化療效果好。

很多其他miRNA相繼被發(fā)現(xiàn)也是潛在的預后生物標志物。以下的miRNA，至少有一項研究發(fā)現(xiàn)它們是和預后相關的：miR-378 ，miR-126 ，miR-224 ，miR-429 ，miR-182[31]，miR-32 ， miR-214 ，miR-182 ，miR-92a ，miR-124，miR-30b，miR-625 ，miR-155和miR-210 ，miR-215 ，miR-130b ， miR-148 和miR-16 。RNAⅢ核酸內(nèi)切酶中以Dicer最為出名，它參與miRNA的形成，并且它的表達是和預后差相關的 。Iliou等人發(fā)現(xiàn)，Dicer功能的損傷導致了調(diào)控CD44和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的miRNA下調(diào)。筆者也發(fā)現(xiàn)這種改變加強了腫瘤的發(fā)生和肝轉(zhuǎn)移。

四、miRNA和化療敏感性

除了作為診斷和預后的生物標志物之外，有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA可以作為結(jié)直腸癌對化療敏感性的標志物。病人對化療的反應是不同的，其中的機制非常復雜，目前并沒有闡述清楚。miRNA對于化療敏感性的預測可以使結(jié)直腸癌患者得到更加個性化的治療。

以前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-21的表達是和預后差以及5-氟尿嘧啶的治療反應有關。這也就意味著miR-21的表達量的上升和5-氟尿嘧啶有著密切的關系。5-氟尿嘧啶治療結(jié)直腸癌促使腫瘤細胞中miR-21的含量上升，或許這是克服藥物細胞毒性的一種方式。最近，Deng等人發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細胞中miR-21的被迫過表達增加了5-氟尿嘧啶的耐藥性，隨著miR-21的敲除這種作用被反轉(zhuǎn)了。這也同時證明了姜黃素和二氟姜黃素（CDF）逆轉(zhuǎn)5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑聯(lián)合用藥治療結(jié)直腸癌耐藥 。有研究顯示，當細胞被5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑處理時，CDF可以抑制細胞的生長，同時發(fā)現(xiàn)miR-21的下調(diào)。筆者認為CDF導致了miR-21表達量的下降繼而增加了5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑治療的敏感性。

另有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其他miRNA的表達與化療試劑敏感性有關。例如，miR-153的上調(diào)與增加奧沙利鉑和順鉑在體內(nèi)、體外的耐藥性有關。另外，miR-19a在晚期耐藥結(jié)直腸癌患者血清中上調(diào)，利用這一點可以區(qū)分對奧沙利鉑耐藥的病人和敏感的病人。Kjersem等人[51]發(fā)現(xiàn)了3個miRNA（miR106a，miR-130b，miR-484），它們的上調(diào)與5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑的耐藥有關。有趣的是，耐藥性的產(chǎn)生與無進展生存期和總生存率無關。

其他miRNA的下調(diào)也與化療耐藥相關。在與正常標本比較的過程中發(fā)現(xiàn)，miR-129[52]和miR-15b與結(jié)直腸癌對5-氟尿嘧啶耐藥有關。miR-129轉(zhuǎn)染進入細胞增強了5-氟尿嘧啶的細胞毒性。miR-1915在多藥耐藥中也是至關重要的。在多種癌細胞中，Bcl-2的過表達已經(jīng)被普遍認為是耐藥性產(chǎn)生的標志，包括結(jié)直腸癌。Xu等人發(fā)現(xiàn)在多藥耐藥的結(jié)直腸癌細胞中伴隨著miR-1915的下調(diào)和Bcl-2的過表達。通過轉(zhuǎn)染miR-1915，他們發(fā)現(xiàn)miR-1915表達量的增加導致了Bcl-2蛋白水平的減少，進一步通過調(diào)控凋亡通路敏感化細胞對多種藥物的治療。

He等人[55]最近的研究論證了miRNA對“瓦博格效應”和化療耐藥的影響?！巴卟└裥本褪侵溉藗冇^察到，相比于正常細胞，癌細胞利用糖酵解比利用氧化磷酸化更多。研究發(fā)現(xiàn)miR-122直接靶向于糖酵解酶丙酮酸酯激酶M2（PKM2），因此，miR-122可以增強5-氟尿嘧啶在結(jié)直腸癌細胞中的耐藥性。5-氟尿嘧啶的耐藥是和糖酵解糖代謝的增加有關的，這個過程是通過葡萄糖消耗的增加，乳酸釋放和PKM2，乳酸脫氫酶，GLUT-1葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子表達量增加。有意思的是，miR-122的過表達抑制PKM2，顯著提高了5-氟尿嘧啶在耐藥細胞中的細胞毒性。

五、結(jié)語和展望

miRNA的發(fā)現(xiàn)在科學界引起了巨大反響并且miRNA在結(jié)直腸癌領域的機制研究仍在繼續(xù)。無疑，miRNA在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中都起了重要作用。很多研究報道m(xù)iRNA與腫瘤的診斷，預后和化療敏感性都有著密切關系。研究顯示，miRNA可以作為結(jié)直腸癌早期診斷的標志物及在結(jié)直腸癌各個階段的指導用藥。進一步的研究必然會驗證這些發(fā)現(xiàn)，最重要的是，確定這些結(jié)論是否能夠為臨床治療提供有效的信息。另外，研究發(fā)現(xiàn)miRNA具有潛在的治療作用。未來更多的研究將會探索miRNA對結(jié)直腸癌的治療策略，例如miRNA傳遞進入細胞的機制，加強miRNA與mRNA的綁定和內(nèi)源性miRNA的綁定。未來的研究必然會更透徹的理解miRNA的生物學機制，提高miRNA在結(jié)直腸癌診斷，預后和化療敏感性上的精確度。

參考文獻

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作者簡介

魏業(yè)東（1991.7—），男，籍貫，山東省淄博市，研究生在讀，研究方向：腫瘤藥理學。

通訊作者

蔣小紅（1976.12—），女，籍貫，浙江省嘉興市，本科，醫(yī)學實驗中心主任，高級實驗師，研究方向：腫瘤藥理學。