柏冬+王瑞海+劉麗梅

摘要：如何辨識(shí)有效成分是中藥新藥研究中的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題之一。中藥作用的整體性、組成成分的多樣性、作用靶點(diǎn)的復(fù)雜性以及成分間相互作用的難以預(yù)測(cè)性，使傳統(tǒng)藥效物質(zhì)研究方法的效率普遍不高。基于“定量組效關(guān)系”研究思想，多組分藥物的化學(xué)組成與其生物活性間同樣存在定量相關(guān)關(guān)系，組效學(xué)研究可幫助辨識(shí)中藥的有效成分。本文對(duì)目前組效研究中常用的方法和技術(shù)進(jìn)行綜述，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供借鑒。

關(guān)鍵詞：中藥組效；物質(zhì)基礎(chǔ)；藥效評(píng)價(jià)；多元統(tǒng)計(jì)；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；綜述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.035

中圖分類(lèi)號(hào)：R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）06-0126-05

Abstract： It is one of key scientific problems to identify the effective compounds in the study on new TCM. Because of the integrity of the effects of TCM， the diversity of constituents， the complexity of the targets and the unpredictability of the interaction among the components， the efficiency of the traditional efficacy substance research method is generally not high. Based on the research thought of quantitative composition-activity relationship， there are inevitable quantitative correlation between chemical compositions and its biological activity. The quantitative composition-activity relationship research is an effective method to detect the effective compounds. This article reviewed the common methods and technologies used in the quantitative composition-activity relationship research， with a purpose to provide some references for the study on basic effective components in TCM.

Key words： quantitative composition-activity relationship of TCM； basic effective components； evaluating pharmacological effect； multivariate statistics； neural network； review

中藥是一個(gè)多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜體系，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究一直是中藥現(xiàn)代化研究中的關(guān)鍵問(wèn)題[1]。目前基于還原論的活性成分追蹤分離方法仍是最常用的研究模式。該模式簡(jiǎn)化了研究對(duì)象，操作性好，取得了諸多成果，但該方法割裂了各組分間的關(guān)系，常出現(xiàn)組分越純、活性越差的結(jié)果[2]。

20世紀(jì)60年代提出的“定量構(gòu)效關(guān)系”將藥物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其生物活性之間的關(guān)系進(jìn)行了定量表達(dá)和描述。根據(jù)此研究思路，1999年，周立東[3]在天然藥物研究中提出了“定量組效關(guān)系”的概念，在進(jìn)行化學(xué)成分研究的同時(shí)進(jìn)行藥效學(xué)研究，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，建立藥物組成-效應(yīng)關(guān)系，從而尋

找中藥的藥效物質(zhì)[4]。利用該方法有可能尋找到“無(wú)明顯藥效的化合物定量配合而形成的有效藥物”[3]。本文對(duì)組效研究的常用方法和技術(shù)進(jìn)行綜述，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供借鑒。

1 組效研究常用方法

1.1 譜效學(xué)

譜效學(xué)是進(jìn)行中藥組效研究最常見(jiàn)的方法。中藥指紋圖譜具有整體、宏觀和模糊等特點(diǎn)，能較大程度反映中藥所含化學(xué)成分的種類(lèi)和含量，適合于中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論研究的需要[5]。譜效學(xué)研究在中藥指紋圖譜的研究基礎(chǔ)上，將標(biāo)示物質(zhì)群特征的色譜峰與藥效結(jié)果聯(lián)系起來(lái)[6]。譜效研究包括指紋圖譜的建立、藥效評(píng)價(jià)和譜效關(guān)系數(shù)據(jù)處理[7]。

目前，譜效關(guān)系的分析方法僅是單一色譜峰與藥效的相關(guān)分析結(jié)果，不能闡明中藥多成分共同作用的特點(diǎn)，且這種結(jié)果是在諸多未知成分共存的基礎(chǔ)上獲得的，如果將篩選出的若干組分或成分組合，藥效結(jié)果未必可以重現(xiàn)[8]。

1.2 中藥血清化學(xué)與血清藥理學(xué)

中藥口服后，在體內(nèi)經(jīng)過(guò)消化、吸收等過(guò)程，最終發(fā)揮藥效的成分存在于吸收入血的成分中，包括原型成分及其代謝產(chǎn)物[9]。有研究將含藥血清的藥效強(qiáng)度與血清指紋圖譜中色譜峰進(jìn)行比對(duì)，以此尋找中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[10-11]。該方法考慮了機(jī)體對(duì)藥物體內(nèi)代謝的影響，使得利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)藥效結(jié)果更符合中藥發(fā)揮藥效的實(shí)際情況[9]。

該方法目前主要是利用體外細(xì)胞模型進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)，還有學(xué)者在體監(jiān)測(cè)體內(nèi)藥物成分和機(jī)體指標(biāo)變化，結(jié)果更為直接、可靠。吳環(huán)宇等[12]在研究黑順片血漿指紋圖譜與抗心衰作用的譜效關(guān)系時(shí)，利用UPLC-QTOF/MS建立了大鼠灌胃黑順片醇提物的血漿指紋圖譜，并連續(xù)監(jiān)測(cè)心衰大鼠的血壓和心率，再用偏最小二乘回歸法對(duì)黑順片入血成分指紋峰與藥效指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。endprint

賀福元等[11]提出進(jìn)行體內(nèi)血清指紋圖譜研究應(yīng)注意血樣采集時(shí)間。因?yàn)樗幬镌隗w內(nèi)代謝不同時(shí)間的原成分和代謝成分是不同的。

1.3 代謝組學(xué)方法

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特征。目前進(jìn)行組效研究時(shí)成分辨識(shí)難度大，單一活性評(píng)價(jià)不符合中藥多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。針對(duì)以上問(wèn)題，許海玉等[13]提出了基于代謝組學(xué)的中藥“組效關(guān)系”研究思路。即基于藥物代謝物組學(xué)進(jìn)行藥物成分辨識(shí)，基于代謝組學(xué)進(jìn)行藥效活性評(píng)價(jià)，基于系統(tǒng)建模進(jìn)行成分與藥效活性之間的關(guān)聯(lián)性分析。

代謝組是反映機(jī)體狀況的、在新陳代謝過(guò)程中出現(xiàn)的特定的小分子的集合，代謝組的變化可體現(xiàn)為藥效。中藥所表現(xiàn)出來(lái)的藥效強(qiáng)度通常較弱，對(duì)特定病證的療效優(yōu)勢(shì)不能通過(guò)多個(gè)“弱效應(yīng)”的簡(jiǎn)單加和來(lái)體現(xiàn)。通過(guò)代謝組學(xué)可以獲得疾病相應(yīng)的代謝標(biāo)志物群，不僅可以反映與疾病相關(guān)的代謝特征網(wǎng)絡(luò)體系，而且具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。代謝組學(xué)基于全局觀點(diǎn)的整體性研究方法，適用于中藥整體效應(yīng)評(píng)價(jià)[13]。藥物代謝組學(xué)是藥物進(jìn)入體內(nèi)隨時(shí)間和空間生物轉(zhuǎn)化的全過(guò)程以及這些過(guò)程中所有的代謝產(chǎn)物。代謝組學(xué)能夠檢測(cè)到成分組合變化造成代謝組的變化，代謝組與藥效活性具有關(guān)聯(lián)性，為分析“組效關(guān)系”提供了可能。但如何有效、高效地發(fā)現(xiàn)組學(xué)研究產(chǎn)生的巨量數(shù)據(jù)中隱含的有用信息是該方法的重點(diǎn)及難點(diǎn)[2]。

2 組效研究常用技術(shù)

中藥組效研究主要涉及組分研究、藥效評(píng)價(jià)和組效關(guān)系研究3個(gè)方面的技術(shù)。

2.1 組分研究

目前中藥組分常用的分析技術(shù)有色譜法和光譜法。色譜法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、薄層色譜法（TLC），以及不同方法的聯(lián)用技術(shù)如HPLC-MS、GC-MS等。對(duì)于色譜分析還包括不同檢測(cè)器的使用，例如液相檢測(cè)器有紫外、熒光、蒸發(fā)光散射等不同檢測(cè)器。光譜法有核磁共振、紅外等方法[14]。

HPLC適用于多數(shù)化合物的分析，使用最為廣泛。GC具有分離度高、靈敏度高、選擇性號(hào)及樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，主要用來(lái)分析樣品中揮發(fā)性成分[7]。高效毛細(xì)管電泳色譜由于其高分離效率、高速度、低消耗、無(wú)污染，已成為中藥指紋圖譜檢測(cè)的又一重要技術(shù)[15]。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)目前廣泛使用，不僅能檢測(cè)更多成分，建立響應(yīng)更強(qiáng)的指紋圖譜，還能實(shí)現(xiàn)化合物的定性，解決了大量譜效研究藥效相關(guān)色譜峰結(jié)構(gòu)不明的問(wèn)題[7]。目前常用的技術(shù)有HPLC-MS/MS、HPLC-Q-TOF-MS、UPLC-IT-TOFMS、UPLC-Q-TOF-MS等[16]。

除以上方法外，毛曉麗等[17]利用紅外指紋圖譜研究了兩面針抗癌活性的譜效關(guān)系。周艷林等[18]用TLC-生物自顯影法導(dǎo)向分離菝葜中抗氧化活性成分。1H-NMR譜圖需要較少樣品，掃描時(shí)間短，容易獲得。鄭曉芬等基于1H-NMR指紋圖譜研究逍遙散乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物抗抑郁的譜效關(guān)系[19]。

中藥中各類(lèi)成分性質(zhì)差異大，僅一種檢測(cè)器或一種分析方法建立的指紋圖譜往往難以全面反映中藥的化學(xué)組成。李云飛等[20]提出了中藥“多維指紋圖譜”研究，即采用不同樣品預(yù)處理方法、不同儀器分析方法獲取多張指紋圖譜，以實(shí)現(xiàn)信息的互補(bǔ)，從而獲得較為完整的樣品化學(xué)信息。范驍輝等[21]提出了“多元指紋圖譜”概念，開(kāi)發(fā)了基于信息融合的多元指紋圖譜相似度計(jì)算方法，在分別建立丹參酚酸類(lèi)成分和三七皂苷類(lèi)成分的HPLC指紋圖譜的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了復(fù)方丹參滴丸多元HPLC指紋圖譜。Yi L等[22]利用多種檢測(cè)器串聯(lián)，分析了中藥復(fù)方“當(dāng)歸補(bǔ)血湯”中的黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)物質(zhì)。

不僅如此，中藥中各成分間含量相差懸殊，現(xiàn)有方法獲取的圖譜無(wú)法保證同時(shí)測(cè)得的各成分的準(zhǔn)確性、重復(fù)性及微量性。此外，指紋圖譜的共有峰均靠人為確定，在數(shù)據(jù)分析時(shí)響應(yīng)低、分離差的色譜峰往往被忽略。有學(xué)者提出從精確與模糊兩方面建立譜效關(guān)系。對(duì)于可以準(zhǔn)確定量的成分，探索含量與藥效的關(guān)系；對(duì)于不能準(zhǔn)確定量的化學(xué)成分，從有無(wú)的角度定性探討對(duì)藥效的影響[8]。

2.2 藥效評(píng)價(jià)

2.2.1 模型及評(píng)價(jià)指標(biāo) 目前用于中藥組效研究的藥效學(xué)評(píng)價(jià)方法涉及整體、器官、細(xì)胞和分子生物學(xué)等層次的研究，可分為在體病理動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)和離體器官/細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[14]。有學(xué)者認(rèn)為在體動(dòng)物模型可以體現(xiàn)中藥的整體調(diào)節(jié)作用，應(yīng)盡量選擇在體動(dòng)物模型[7，20]。

選擇的藥效指標(biāo)應(yīng)該能夠反映中藥功能主治，并具備快速、準(zhǔn)確、樣品用量小等特點(diǎn)[7，20]。中藥多具有多種藥效，有時(shí)會(huì)有相反的作用，選擇不同的藥效指標(biāo)，可能會(huì)獲得不同的結(jié)果，所以要選擇有針對(duì)性的指標(biāo)[16]。多數(shù)學(xué)者推薦采用多藥效指標(biāo)以更全面反映中藥的藥效，但要尋求多個(gè)指標(biāo)的同時(shí)最優(yōu)化，即構(gòu)成多目標(biāo)優(yōu)化問(wèn)題。目前多目標(biāo)優(yōu)化方法中較為常用的方法有權(quán)重系數(shù)法和第1、2代進(jìn)化算法[23]。

為了提高藥效檢測(cè)的通量，有學(xué)者提出可以探索建立基于體外細(xì)胞模型甚至計(jì)算模型的多指標(biāo)藥效檢測(cè)方法，并采用整體動(dòng)物模型對(duì)譜效關(guān)系辨識(shí)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證[7，20]。

除了以上提到的2種藥效模型，目前也會(huì)用到一些化學(xué)方法評(píng)價(jià)藥效。如DPPH自由基法已成為國(guó)際上較為公認(rèn)的一種抗氧化活性測(cè)定方法，被頻繁地用于生物活性物質(zhì)的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)研究[24]。梁從蓮等[25]將不同批次的金銀花甲醇提取物加入DPPH溶液中考察不同樣品清除DPPH自由基的作用。除此之外，李紅艷等[26]通過(guò)酪氨酸酶抑制劑的篩選，明確了紅花中酪氨酸酶抑制劑成分?？拙S軍等[27]采用微量熱法研究了左金丸及類(lèi)方HPLC指紋圖譜與生物熱活性的“譜-效”關(guān)系。劉榮華等[28]研究了山楂葉HPLC指紋圖譜與其抗大鼠中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性之間的相互關(guān)系。雖然以上方法簡(jiǎn)單、速度快，符合高通量篩選的要求，但較難體現(xiàn)中醫(yī)的整體性特點(diǎn)。

姚衛(wèi)峰等[29]提出了“譜效整合指紋譜”法。通過(guò)離線或在線的活性檢測(cè)方法，構(gòu)建與中藥化學(xué)成分指紋峰相對(duì)應(yīng)的活性指紋譜。該方法能夠較好地反映中藥化學(xué)信息各自對(duì)應(yīng)的生物活性信息，如利用HPLC- DAD-CL聯(lián)用系統(tǒng)，建立了穩(wěn)定的H2O2、O2·?清除活性的在線分析技術(shù)平臺(tái)，測(cè)定了銀杏葉提取物清除DPPH自由基的活性指紋譜。韓彥琪等[30]采用UPLC-Q-TOF結(jié)合核因子-κB（NF-κB）熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)玫瑰花提取物中7個(gè)單體物質(zhì)可能為潛在的NF-κB抑制劑。該方法速度快，能獲得各色譜峰對(duì)應(yīng)化合物的藥效活性，但割裂了各成分之間的聯(lián)系。endprint

2.2.2 給藥劑量 在進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)時(shí)，特別是整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，給藥濃度與發(fā)揮藥效的物質(zhì)濃度不一定呈線性關(guān)系，而且藥物產(chǎn)生藥效的藥量區(qū)間也是未知的，故在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮藥量。鄢海燕等[31]研究發(fā)現(xiàn)，隨著給藥劑量由增加，瓜蔞薤白滴丸各共有峰與肌酸激酶的關(guān)聯(lián)度也逐漸增加，隨著給藥劑量的不同，發(fā)揮作用的化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)順序并不相同。目前研究中一般采用一個(gè)有效劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。陳紅鴿等[32]在研究不同粒度赤芍藥材抗肝纖維化作用的譜效關(guān)系時(shí)，首先摸索了樣品添加量，發(fā)現(xiàn)40%赤芍藥材提取液對(duì)肝星狀細(xì)胞LX-2增殖抑制效果最好。

還有學(xué)者研究了不同劑量藥物指紋圖譜，但該劑量與動(dòng)物灌胃給藥劑量之間相關(guān)度不大[33]。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 進(jìn)行組效研究時(shí)，多選擇產(chǎn)地、品種、提取部位或炮制方法等差異的藥材作為研究對(duì)象。符繼紅等[34]通過(guò)分析新疆3個(gè)不同品種的17批薰衣草精油樣品，研究了薰衣草精油化學(xué)組成與抑菌活性的相關(guān)性。

在進(jìn)行復(fù)方研究時(shí)，多將原方重新組合獲得多個(gè)不同的處方進(jìn)行研究[15]。常用的方法有拉丁超立方抽樣、正交設(shè)計(jì)法、均勻設(shè)計(jì)法等。許雯雯等[35]在進(jìn)行氣滯胃痛顆粒復(fù)方藥材抗炎活性譜效關(guān)系研究時(shí)，使用Isight軟件對(duì)各藥材量進(jìn)行拉丁超立方采樣，柴胡、甘草、延胡索、枳殼、香附均按0～10 g，白芍按0～15 g抽樣，進(jìn)行20次實(shí)驗(yàn)。何昱等[36]在進(jìn)行麻黃湯處方劑量的多目標(biāo)優(yōu)化研究時(shí)，將麻黃湯4個(gè)組方藥味麻黃、桂枝、苦杏仁、炙甘草進(jìn)行4因素4水平的L16（45）正交組合，組成各藥味用量配比不同的16個(gè)組方。楊鴻等[37]在進(jìn)行甘草總黃酮、銀杏葉提取物、淫羊藿總黃酮和黃芪總苷4個(gè)中藥組分不同配伍劑量體外清除DPPH和多環(huán)芳烴的研究時(shí)，采用均勻設(shè)計(jì)U12（124）進(jìn)行劑量配比關(guān)系研究。

除此之外，也有使用不同廠家、不同提取方法制備的樣品進(jìn)行研究[15]。梁建娣等[38]依次用氯仿、乙酸乙醋、乙醇、水作為提取溶劑提取少毛北前胡，建立相應(yīng)的HPLC指紋圖譜，并比較各提取物鎮(zhèn)咳活性。

2.3 組效關(guān)系研究

目前定量組效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理主要借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。其最大的特征就是將多變量分析方法引入化學(xué)研究，通過(guò)解析化學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)，最大限度地獲取有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)的化學(xué)信息及其他信息[39-40]。常見(jiàn)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可分為多元統(tǒng)計(jì)分析和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

多元統(tǒng)計(jì)分析能夠在多個(gè)對(duì)象和多個(gè)指標(biāo)互相關(guān)聯(lián)的情況下分析它們的統(tǒng)計(jì)規(guī)律，目前應(yīng)用于研究中藥組效關(guān)系的多元統(tǒng)計(jì)分析方法有回歸分析[41]、相關(guān)分析[42]、主成分分析[43]、偏最小二乘分析[44]、灰色關(guān)聯(lián)度分析[45]等。由于中藥成分與藥效之間的關(guān)系復(fù)雜多變，并不一定能用統(tǒng)計(jì)關(guān)系完全表達(dá)，多元統(tǒng)計(jì)分析理論基礎(chǔ)在一定程度上制約了模型的精確性和穩(wěn)定性，削弱了統(tǒng)計(jì)分析的泛化能力[40]。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種模擬大腦功能的信息處理系統(tǒng)，它主要借鑒了人腦神經(jīng)系統(tǒng)處理信息的過(guò)程，以數(shù)學(xué)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為理論基礎(chǔ)，由多個(gè)非常簡(jiǎn)單的處理單元按某種方式相互連接形成計(jì)算系統(tǒng)，具有學(xué)習(xí)、記憶、聯(lián)想和計(jì)算功能。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能夠有效地對(duì)模型不確定的數(shù)據(jù)進(jìn)行大規(guī)模非線性自適應(yīng)信息處理，自動(dòng)調(diào)節(jié)不同類(lèi)型的非線性響應(yīng)，更加適用于復(fù)雜的非線性的數(shù)學(xué)處理。近年來(lái)，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)已被廣泛應(yīng)用于中藥組效關(guān)系研究中[40]。方法有BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)誤差反向傳播[46]、變結(jié)構(gòu)多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[47]、徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[48]、支持向量回歸機(jī)[36]等。雖然，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)適用于復(fù)雜的中藥組效關(guān)系研究，且大部分模型預(yù)測(cè)精度優(yōu)于統(tǒng)計(jì)分析模型。但以上各方法都具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，且神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是高度非線性的大型系統(tǒng)，不可能完全闡明中藥中各組分與其藥效之間的作用關(guān)系，故尚需進(jìn)一步完善[36]。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，組效研究體現(xiàn)了中藥整體性的特征，適于進(jìn)行中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。但目前的研究手段尚存在許多問(wèn)題。在組分檢測(cè)方面，對(duì)于中藥中的大極性成分，如多糖、蛋白類(lèi)成分尚無(wú)較好的檢測(cè)方法，而現(xiàn)有大量研究證明這類(lèi)成分具有重要的藥效作用。在藥效評(píng)價(jià)方面，尚無(wú)合適的藥效模型和合適的藥效指標(biāo)可以全面體現(xiàn)中醫(yī)證候的特點(diǎn)。常用的體外細(xì)胞模型等適合高通量篩選的方法，無(wú)法全面體現(xiàn)中醫(yī)證候的特點(diǎn)。在組效關(guān)系方面，大部分研究無(wú)法回溯，利用得到的結(jié)果進(jìn)行組分配比得到可以反映原方的組分群。所以，對(duì)于組效研究還有大量的工作需要探索。

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（收稿日期：2016-03-16）

（修回日期：2016-06-14；編輯：向宇雁）endprint