彭熙煒+閻卉芳+黃娟+朱嘉歡+徐昊+黃小平+鄧常清

摘要：目的 觀察黃芪和當(dāng)歸不同比例配伍對(duì)大鼠血管內(nèi)膜增生的影響，確立二者抗血管內(nèi)膜增生的有效配伍。方法 采用基線等比設(shè)計(jì)方法將SD大鼠分為5個(gè)黃芪-當(dāng)歸不同配比組、單用黃芪組、單用當(dāng)歸組、陽(yáng)性藥組和假手術(shù)組，采用球囊導(dǎo)管損傷大鼠血管內(nèi)皮造成胸腹主動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生模型，同時(shí)灌胃黃芪、當(dāng)歸不同比例配伍藥物，連續(xù)14 d，放血處死大鼠，取胸腹主動(dòng)脈，行Masson染色，形態(tài)計(jì)量學(xué)方法分析血管內(nèi)膜增生情況。結(jié)果 血管內(nèi)膜損傷后14 d，胸腹主動(dòng)脈內(nèi)膜面積（IA）、內(nèi)膜厚度（IT）、內(nèi)膜面積增生率（HRIA）、內(nèi)膜厚度增生率（HRIT）均增加。與模型組比較，單用當(dāng)歸組、芪歸1∶2組、芪歸1∶5組、芪歸1∶1組、芪歸5∶1組IA、IT、HRIA、HRIT均降低，且以芪歸1∶1組作用最強(qiáng)。單用黃芪組、芪歸2∶1組內(nèi)膜增生各指標(biāo)變化不明顯。結(jié)論 黃芪和當(dāng)歸在一定比例范圍配伍時(shí)具有抑制血管內(nèi)膜增生的作用，其中以黃芪∶當(dāng)歸=1∶1配伍比例抗血管內(nèi)膜增生的作用為佳。

關(guān)鍵詞：黃芪；當(dāng)歸；血管內(nèi)膜增生；配伍比例；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）06-0056-04

Abstract： Objective To observe the effects of different compatibility ratios of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix on vascular intimal hyperplasia； To ascertain the effective compatibility of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix for antagonizing vascular intimal hyperplasia. Methods SD rats were divided into different groups by baseline geometric design method： Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix different compatibility ratios groups， Astragali Radix group， Angelicae Sinensis Radixgroup， positive medicinegroup and sham-operation group. A model of intimal hyperplasia of thoracoabdominal aorta was established by balloon catheter injury in vascular endothelium of rats. Then the thoracoabdominal aorta was taken out after gavage of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix with different compatibility ratios for 14 days. Bloodletting was used to take thoracoabdominal aorta. Masson staining and Morphometric methods were used to analyze the intimal hyperplasia. Results IA， IT， HRIA and HRIT increased 14 day after intimal injury. Compared with the model group， IA， IT， HRIA and HRIT in Angelicae Sinensis Radix group， Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 1：2 group， Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 1：5 group， Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 1：1 group and Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 5：1 group were lower， and the effects of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 1：1 ratio were strongest. The effects on intimal hyperplasia in Astragali Radix group and Astragali Radix and Angelicae Sinensis 2：1 group had no significant differences compared with model group. Conclusion Astragali Radix and Angelicae Sinensis can inhibit vascular intimal hyperplasia in a certain compatibility ratios， and the effects of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 1：1 on intimal hyperplasia are the best.

Key words： Astragali Radix； Angelicae Sinensis； vascular intimal hyperplasia； compatibility ratio； ratsendprint

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（81473851）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2016B378）；中西結(jié)合臨床湖南省“十二五”重點(diǎn)開(kāi)放基金（ZXLCXK201504）；湖南省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2013年）；湖南省自然科學(xué)創(chuàng)新群體基金（2013年）

通訊作者：鄧常清，E-mail：dchangq@sohu.com

黃芪和當(dāng)歸是臨床常用的中藥藥對(duì)，二者配伍既可補(bǔ)氣生血，又能益氣活血，具有藥理多效性。研究表明，由黃芪和當(dāng)歸配伍組方具有促進(jìn)造血[1]、心血管保護(hù)作用[2]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[3]等功效。但二者以何比例配伍將產(chǎn)生不同的藥理效應(yīng)？在不同的病證應(yīng)如何配伍？上述問(wèn)題均未闡明。因此，我們基于中藥方劑配伍的理論，以黃芪和當(dāng)歸配伍益氣活血功效為基礎(chǔ)，以抗血管內(nèi)膜增生為切入點(diǎn)，探討黃芪和當(dāng)歸抗血管內(nèi)膜增生的配伍關(guān)系，以期為臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠135只，體質(zhì)量220～250 g，SPF級(jí)，8周齡，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，濕度45%～65%、室溫25 ℃，喂食標(biāo)準(zhǔn)詞料，自由攝食飲水。

1.2 藥物

黃芪、當(dāng)歸，湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供，并經(jīng)藥劑科左亞杰教授鑒定，黃芪為膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge的干燥根，當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。阿托伐他汀鈣片，浙江新東港藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20160803，10 mg/片。

1.3 主要試劑與儀器

Masson染色試劑盒，湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室配制。U-TV0.5XC-3雙目顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Motic Images Plus 2.0ML圖像采集系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司），MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北航公司），PL203電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），2.0 mm×15 mm Runjin醫(yī)用球囊導(dǎo)管、Runthrough導(dǎo)絲和醫(yī)用球囊擴(kuò)張壓力泵（日本泰爾茂株式會(huì)社）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備

依據(jù)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中黃芪用量為9～30 g、當(dāng)歸用量為6～12 g，取成人臨床常用量黃芪為20 g、當(dāng)歸為10 g，黃芪-當(dāng)歸配伍成人臨床常用量36 g（黃芪+當(dāng)歸），換算成大鼠等效劑量為黃芪2.17 g/kg、當(dāng)歸1.08 g/kg、黃芪-當(dāng)歸配伍3.9 g/kg。按不同配伍分別稱取藥材，以水熱回流法提取3次（第1次8倍量水，提取1 h；第2、3次6倍量水，提取1 h），合并3次提取液，過(guò)濾，60 ℃真空減壓濃縮得浸膏，配制藥物濃度為含原藥材黃芪0.22 g/mL、當(dāng)歸0.11 g/mL、黃芪-當(dāng)歸不同比例配伍0.39 g/mL。在藥液中加入0.1%苯甲酸鈉，分裝后置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩９辔笗r(shí)按大鼠每100 g體質(zhì)量灌胃1 mL藥液。

2.2 分組及給藥

大鼠采用基線等比設(shè)計(jì)方法[4]分組，每組8只。將芪歸比5∶1設(shè)為配比基線，黃芪和當(dāng)歸用量以16.6%向兩側(cè)遞增或遞減[5]：芪歸5∶1組（黃芪3.25 g/kg+當(dāng)歸0.65 g/kg）、芪歸2∶1組（黃芪2.6 g/kg+當(dāng)歸1.3 g/kg）、芪歸1∶1組（黃芪1.95 g/kg+當(dāng)歸1.95 g/kg）、芪歸1∶2組（黃芪1.3 g/kg+當(dāng)歸2.6 g/kg）、芪歸1∶5組（黃芪0.65 g/kg+當(dāng)歸3.25 g/kg）。另設(shè)單用黃芪組（2.17 g/kg）、單用當(dāng)歸組（1.08 g/kg）、陽(yáng)性藥組（阿托伐他汀10 mg/kg）。

2.3 造模

大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 mL/100 g），仰臥位固定。頸部剪毛及消毒后，取頸正中稍偏左位置切開(kāi)，分離出左頸總動(dòng)脈。結(jié)扎左頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉其近心端，隨后稍靠血管遠(yuǎn)心端做一V形切口。取出球囊導(dǎo)管，將導(dǎo)管球囊部在生理鹽水中洗凈，保持導(dǎo)絲尖端與球囊部尖端平齊，并用醫(yī)用縫線結(jié)扎固定導(dǎo)絲與球囊導(dǎo)管使其不能相互滑動(dòng)，將球囊擴(kuò)張壓力泵回抽使球囊內(nèi)呈負(fù)壓狀態(tài)，從切口插入后，松除動(dòng)脈夾，隨后繼續(xù)小心插入越過(guò)主動(dòng)脈弓至深度約6～7 cm處。用醫(yī)用球囊擴(kuò)張壓力泵加壓充盈球囊，加壓并保持壓力為8 bar，來(lái)回反復(fù)拖拉球囊導(dǎo)管至主動(dòng)脈弓處4次（球囊拖出至主動(dòng)脈弓再插入至6～7 cm處記為1次）。然后轉(zhuǎn)動(dòng)球囊導(dǎo)管180°后再進(jìn)行4次同樣操作。完成后將球囊擴(kuò)張壓力泵回抽至負(fù)壓狀態(tài)后撤出導(dǎo)管，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在傷口處撒適量慶大霉素縫合傷口。從造模當(dāng)日開(kāi)始，每日肌注青霉素20萬(wàn)U，連續(xù)3 d，以預(yù)防感染。術(shù)后第1日開(kāi)始分別灌胃不同藥液，連續(xù)14 d后檢測(cè)。

2.4 血管內(nèi)膜增生指標(biāo)測(cè)定

采用我們以往建立的血管形態(tài)計(jì)量學(xué)方法[6]進(jìn)行檢測(cè)。將大鼠麻醉后放血處死，打開(kāi)腹腔和胸腔，截取胸腹主動(dòng)脈，洗凈，剝?nèi)パ芡饨Y(jié)締組織，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，每段血管間斷均勻切取8片后行Masson染色。切片脫蠟至水，蘇木素染色5 min，水洗，促藍(lán)；麗春紅酸性品紅液染色5～10 min；0.5%冰醋酸水溶液0.5～1 min，水洗；1%磷鉬酸水溶液分色3～5 min；0.5%冰醋酸水溶液30 s；1%亮綠水溶液10 s；0.5%冰醋酸水溶液中分色30 s，水洗；自然晾干封片。鏡下觀察，拍照，用Image-Proplus6.0圖像分析軟件測(cè)量中膜中線周長(zhǎng)、中膜面積（MA）、內(nèi)膜中線周長(zhǎng)、內(nèi)膜面積（IA），計(jì)算出中膜厚度（MT，MA÷中膜中線周長(zhǎng)），內(nèi)膜厚度（IT，IA÷內(nèi)膜中線周長(zhǎng)），內(nèi)膜面積增生比率[HRIA，IA÷（IA+MA）×100%]、內(nèi)膜厚度增生比率[HRIT，IT÷（IT+MT）×100%]。endprint

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，方差齊用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnet'T3檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)意義。應(yīng)用單因素模糊評(píng)判方法進(jìn)行分析。首先確定參評(píng)因素集X=（x1，x2，…，xm）和評(píng)判集Y=（y1，y2，…，ym），若貼近度Cj（Yj，X）為n個(gè)模糊集Y1，Y2，…，Yn與X貼近度中的最大者，則認(rèn)為Yj與X最貼近。

4 結(jié)果

4.1 黃芪和當(dāng)歸不同配伍比例對(duì)模型大鼠血管內(nèi)膜病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠血管內(nèi)膜內(nèi)彈力膜完整，呈單層，未見(jiàn)增生；模型組血管新生內(nèi)膜呈均一或不均一增厚，大量增生血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）存在，排列紊亂，管腔呈向心性或偏心性狹窄，內(nèi)膜增生明顯；單用黃芪組與芪歸2∶1組血管內(nèi)膜增生改變同模型組；單用當(dāng)歸組、芪歸1∶5、1∶2、1∶1、5∶1組和陽(yáng)性藥組血管內(nèi)膜呈增生性改變，但增生程度較模型組減輕。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.2 黃芪和當(dāng)歸不同配伍比例對(duì)模型大鼠血管內(nèi)膜增生指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組血管IA、IT、HRIA、HRIT均顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組、單用當(dāng)歸組及芪歸1∶1、1∶2、1∶5、5∶1組血管組織IA、IT、HRIA、HRIT均顯著減?。≒<0.05，P<0.01）；與陽(yáng)性藥組比較，單用當(dāng)歸組及芪歸1∶1、1∶2、1∶5、5∶1組IA、IT、HRIA、HRIT均無(wú)顯著差異（P>0.05），單用黃芪組及芪歸2：1組IA、IT、HRIA、HRIT顯著高于陽(yáng)性藥組（P<0.05，P<0.01）。芪歸1∶1組IA、IT、HRIA、HRIT降低最為顯著。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.3 單因素模糊評(píng)判結(jié)果

芪歸1∶1藥物組與陽(yáng)性藥組貼近度C值最高，療效較好，其中芪歸1∶1組最為顯著。單用黃芪組與芪歸2∶1組貼近度C值相同且在各藥物組中最低；單用當(dāng)歸組、芪歸1∶2組、芪歸1∶5組、芪歸5∶1組貼近度C值居中。表明單用黃芪組及芪歸2∶1組抗大鼠血管內(nèi)膜增生作用不明顯，單用當(dāng)歸組、芪歸1∶2組、芪歸1∶5組、芪歸5∶1組均可抗血管內(nèi)膜增生，其中芪歸1∶1組作用最強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表2。

5 討論

黃芪味甘而薄，具補(bǔ)氣之功。當(dāng)歸味甘而重，故專能補(bǔ)血；其氣輕而辛，故又能行血，補(bǔ)中有動(dòng)，行中有補(bǔ)。黃芪和當(dāng)歸配伍應(yīng)用最有代表的是李東垣所創(chuàng)的當(dāng)歸補(bǔ)血湯，由黃芪一兩、當(dāng)歸二錢組成，芪歸比為5∶1。此后，黃芪與當(dāng)歸配伍比例復(fù)方有《血證論》《壽世保元》為2∶1，《醫(yī)學(xué)心悟》為8∶2，《外科理例》為6∶1，《東醫(yī)寶鑒》為5∶2，《產(chǎn)科心法》《醫(yī)部全錄》為10∶3。雖然其配伍比例不同，但均以治療氣虛發(fā)熱為主[7]。由于血管內(nèi)膜增生是動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后血管再狹窄的主要病理基礎(chǔ)，多屬于“血瘀”范疇。因此，合理的芪歸配伍可能對(duì)血管內(nèi)膜增生有防治作用。

本研究采用適用于效應(yīng)明確的中藥小復(fù)方（或藥對(duì)）配比優(yōu)化篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法基線等比增減法，以經(jīng)典的芪歸5∶1配伍為基線，采用向兩側(cè)遞增或遞減確定其不同的配伍比例范圍[5]。這種設(shè)計(jì)方法能較好地分析出藥物在不同劑量配伍下效應(yīng)的區(qū)別。并且采用了模糊綜合評(píng)判分析方法，進(jìn)一步明確了不同配伍之間的療效關(guān)系：?jiǎn)斡卯?dāng)歸及芪歸以1∶1、1∶2、1∶5、5∶1配伍均有抗血管內(nèi)膜增生的作用，且以芪歸1∶1配伍療效最佳，但單用黃芪及芪歸以2∶1配伍抗血管內(nèi)膜增生作用不顯著。說(shuō)明采用基線等比增減法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析能較好地評(píng)價(jià)藥物配伍效應(yīng)的差別。

血管內(nèi)膜增生的關(guān)鍵原因是VSMC過(guò)度增殖[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠動(dòng)脈球囊損傷后幾小時(shí)新生內(nèi)膜中即出現(xiàn)VSMC增殖，7 d后增殖的VSMC移行至內(nèi)膜，14 d后VSMC增加3～5倍，占增生內(nèi)膜細(xì)胞總數(shù)90%[9]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可使血管IA、IT、HRIA、HRIT顯著降低，提示其可抑制血管內(nèi)皮損傷后由于VSMC增殖導(dǎo)致的血管內(nèi)膜增生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在黃芪和當(dāng)歸配伍抗血管內(nèi)膜增生的作用中，當(dāng)歸的作用占主導(dǎo)地位，黃芪和當(dāng)歸在一定的比例范圍內(nèi)配伍時(shí)具有良好的抗血管內(nèi)膜增生作用，且以芪歸1∶1配伍比例效果最佳。提示臨床應(yīng)用黃芪和當(dāng)歸配伍治療血管增殖性病變時(shí)，應(yīng)選擇合理的配伍比例，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃麗萍，吳素芳，周俊，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)三種血虛模型小鼠作用的比較[J].中藥藥理與臨床，2011，27（5）：5-7.

[2] LI Y D， MA Y H， ZHAO J X， et al. Protection of ultra-filtration extract from Danggui Buxue Decoction on oxidative damage in cardiomyocytes of neonatal rats and its mechanism[J]. Chin J Integr Med，2011，17（11）：854-859.

[3] 秦臻，黃水清.當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能及其PI3K/Akt通路影響的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（9）：1320-1323.

[4] 商洪才，張伯禮，王永炎，等.一種適用于中藥小復(fù)方配比優(yōu)選設(shè)計(jì)方法的建立[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9（3）：1-3.

[5] 張龍，林珠燦，張睿卓，等.基于基線等比增減法的養(yǎng)心草配伍酸棗仁安神藥效的實(shí)驗(yàn)研究[J].海峽藥學(xué)，2015，27（1）：17-18.

[6] WU L， ZHANG W， LI H， et al. Inhibition of aortic intimal hyperplasia and cell cycle protein and extracellular matrix protein expressions by BuYang HuanWu Decoction[J]. J Ethnopharmacol，2009，125（3）：423-435.

[7] 范穎，陳信義.當(dāng)歸補(bǔ)血湯源流及配伍效用關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12（10）：62-65.

[8] CHENG K S， MIKHAILIDIS D P， HAMILTON G， et al. A review of the carotid and femoral intima-media thickness as an indicator of the presence of peripheral vascular disease and cardiovascular risk factors[J]. Cardiovascular research，2002，54（3）：528-538.

[9] BAE J H， BASSENGE E， KIM K Y， et al. Effects of low-dose atorvastatin on oascular responses in patients undergoing percutaneous coronary intervention with stenting[J]. J Cardiovasc Pharmacol Ther，2004，9（3）：185-192.

（收稿日期：2016-11-11；編輯：華強(qiáng)）endprint