張玉琴+孫承韜+李煌+徐偉+褚克丹+林羽

摘要：目的 觀察栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）興奮性毒性損傷的影響，并初步探討其作用機制。方法 采用谷氨酸誘導(dǎo)PC12興奮性毒性損傷造模。將細胞隨機分為正常組、谷氨酸組和栝樓桂枝顆粒低（200 μg/mL）、中（400 μg/mL）、高（800 μg/mL）劑量組，MTT法和LDH法檢測PC12活力；Caspase-3活性檢測法、Annexine V/PI雙染色法檢測細胞凋亡，Western blot和RT-PCR分別檢測Bcl-2、Bax蛋白和mRNA表達。結(jié)果 與谷氨酸組比較，MTT法栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12活力升高，LDH法栝樓桂枝顆粒各劑量組細胞活力降低；Annexine V/PI雙染色法栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12凋亡率降低；Caspase-3活性檢測法栝樓桂枝顆粒各劑量組Caspase-3活性降低；RT-PCR及Western blot檢測栝樓桂枝顆粒各劑量組Bax表達降低、Bcl-2表達升高。結(jié)論 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)PC12興奮性毒性損傷有一定的保護作用，其保護作用與其抗細胞凋亡作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：栝樓桂枝顆粒；谷氨酸；腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞；細胞凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.010

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）06-0039-05

Abstract： Objective To investigate the effects of Gualou Guizhi Granules on excitatory toxic damage of PC12 induced by glutamate； To primarily explore the involved protective mechanism of Gualou Guizhi Granules. Methods Excitatory toxic damage of PC12 induced by glutamate was used to establish models. Cells were divided into normal group， glutamate group， and Gualou Guizhi Granules low- （200 μg/mL）， medium- （400 μg/mL） and high-dose （800 μg/mL） groups. MTT and LDH assay methods were used to detect PC12 activity； Caspase-3 activity detection method and Annexine V/PI double staining method were used to detect cell apoptosis； Western blot and RT-PCR were used to detect Bcl-2， Bax protein and mRNA expression. Results Compared with glutamate group， MTT showed that all Gualou Guizhi Granules groups could improve PC12 activity， and LDH showed that cell activity in all Gualou Guizhi Granules groups decreased； Annexine V/PI double staining method showed that all Gualou Guizhi Granules groups could decrease the PC12 apoptosis； Caspase-3 activity detection method showed that all Gualou Guizhi Granules groups could decrease the activity of Caspase-3； Western blot and RT-PCR showed that all Gualou Guizhi Granules groups could reduce Bax expression and increase Bcl-2 expression. Conclusion Gualou Guizhi Granules have certain protective effects on excitatory toxic damage of PC12 induced by glutamate， which may be related to its anti-apoptotic activity.

Key words： Gualou Guizhi Granules； glutamate； PC12； cell apoptosis

隨著世界老齡化的加劇，腦卒中成為發(fā)展中國家

高致殘率、高死亡率、高發(fā)病率的一種疾病，給人類健康造成了巨大的威脅。栝樓桂枝顆粒（處方源于栝樓桂枝湯）為福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，臨床用于治療腦卒中后痙攣性偏癱。臨床觀察顯示，栝樓桂枝湯可明顯改善中風(fēng)后患者運動功能、痙攣狀態(tài)及日常生活活動能力[1]。體內(nèi)外研究也表明，栝樓桂枝湯具有抗氧化、抗炎及抗興奮性氨基酸毒性損傷的作用[2-7]。本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上，采用谷氨酸誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）興奮性毒性損傷為模型，觀察其對模型大鼠的影響，并初步探討其作用機制，為臨床應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞endprint

高分化大鼠PC12，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所。

1.2 藥物及制備

栝樓桂枝顆粒，福建省第二人民醫(yī)院藥劑科提供，無菌條件下用含1%胎牛血清1640培養(yǎng)基配制成1 mg/mL的母液，使用時稀釋成不同濃度的工作液。

1.3 主要試劑與儀器

谷氨酸，Sigma公司；噻唑藍（MTT），Sigma公司；Annexin V/PI凋亡試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司；Caspase-3 Assay Kit，Molecular Probes；兔抗大鼠Bcl-2、Bax和β-actin抗體，Cell Signalling公司；辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG，廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司；RevertAidTM First strand cDNA Synthsis Kit，F(xiàn)ermenta公司；Power SYBR? Green PCR Master Mix，Life Sciences公司。凝膠成像儀，美國伯樂公司；PCR擴增儀，美國伯樂公司；7900型熒光定量PCR儀，ABI公司。

2 實驗方法

2.1 細胞增殖檢測

將對數(shù)期PC12接種至96孔板（2×104個/孔），將細胞隨機分為正常組、谷氨酸組和栝樓桂枝顆粒低、中、高劑量組，每組6孔，實驗重復(fù)3次。培養(yǎng)24 h后，栝樓桂枝顆粒低、中、高劑量組分別加入200、400、800 μg/mL栝樓桂枝顆粒藥液，24 h后加入谷氨酸（終濃度為15 mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，每孔加入10 ?L濃度為5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加100 ?L DMSO溶解甲瓚結(jié)晶，室溫震搖5 min，完全溶解后，于酶標儀570 nm處測定光密度（OD）。計算細胞存活率（實驗組OD值÷正常組OD值×100%）。

2.2 細胞活力檢測

分組、給藥方法同“2.1”項，24 h后加入谷氨酸（終濃度為15 mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，取細胞上清液，LDH法檢測PC12活力，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。于波長450 nm處測定OD值，計算細胞活力。細胞活力（U/L）=（測定管OD值-對照管OD值）÷（標準管OD值-空白管OD值）×標準品濃度（0.2 mmol/L）×1000。

2.3 細胞凋亡檢測

分組、給藥方法同“2.1”項，24 h后加入谷氨酸（終濃度為15 mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集細胞，向細胞沉淀中加入Binding Buffer 500 ?L，重懸細胞?；靹蚝螅尤? ?L Annexin V-FITC，混合均勻，加入5 ?L PI溶液，輕輕混合均勻，室溫下避光孵育15 min，1 h內(nèi)流式細胞儀分析細胞凋亡。

2.4 Caspase-3活性檢測

分組、給藥方法同“2.1”項，24 h后加入谷氨酸（終濃度為15 mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集細胞，加入50 ?L預(yù)冷的Cell Lysis Buffer，冰上孵育30 min，5000 r/min離心5 min，吸取上清液置于新的離心管，置于冰上待用，BCA法測定樣品蛋白含量。用Cell Lysis Buffer稀釋一定量的蛋白至50 ?L，加入96孔板，再加入50 ?L 2×底物工作液（含DTT 0.495 ?mol，Z-DEVD-R110 0.012 5 ?mol），室溫孵育30～60 min，待顏色發(fā)生明顯變化時，于酶標儀波長405 nm處測定OD值。計算蛋白含量標準化校正后A值[（測定孔OD值-無酶孔OD值）×待測樣品蛋白濃度]，以正常組Caspase-3活性為1，以每個樣本的校正A值除以正常組校正A值的商計算各組Caspase-3相對活性（處理組校正A值÷正常組校正A值）。

2.5 Bax、Bcl-2 mRNA表達檢測

2.5.1 總RNA提取 Trizol法提取總RNA，微量紫外分光光度計檢測A260、A280，取A260/A280在1.8～2.0樣品進行實驗，并計算總RNA濃度。

2.5.2 實時PCR檢測 根據(jù)濃度計算2 ?g樣本RNA體積，按照RevertAidTM First strand cDNA Synthsis Kit試劑盒說明書配制20 ?L的反轉(zhuǎn)錄體系。輕柔混勻，低速離心，于PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。各目的基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，目的基因引物序列見表1。按照試劑盒配制20 ?L的擴增體系：Power SYBR Green PCR Master Mix（2×）10 ?L，引物各2 ?L，cDNA 1 ?L，Nuclease-free water 1 ?L。Real-time PCR檢測以β-actin為內(nèi)參基因，計算谷氨酸組和給藥組相對于正常組目的基因的表達量，最終結(jié)果用相對表達量2-ΔΔct表示。

2.6 Bcl-2、Bax蛋白表達檢測

采用Western blot檢測。用含1%PMSF的蛋白裂解液提取蛋白，并按BCA蛋白測定說明書對每組蛋白含量進行測定，樣品經(jīng)12%凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，將膜與溶于封閉液中一抗4 ℃孵育過夜。將膜浸入二抗稀釋液，室溫孵浴1 h 洗滌，在暗室內(nèi)將ECL顯影液加到膜的蛋白面，靜置1 min，充分顯色后，曝光，凝膠成像儀顯影、拍照，應(yīng)用凝膠圖像分析軟件分析各目的蛋白相對表達量，β-actin為內(nèi)參基因，并計算目標蛋白與內(nèi)參的比值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗結(jié)果以—x±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)損傷PC12增殖的影響endprint

MTT法顯示，谷氨酸組較正常組PC12活力明顯下降（P<0.05），栝樓桂枝顆粒高、中劑量組PC12活力較谷氨酸組明顯升高（P<0.05），見圖1。LDH法顯示，谷氨酸組較正常組PC12活力明顯升高（P<0.05），栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12活力較谷氨酸組變化不明顯，見圖2。

4.2 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)損傷PC12凋亡的影響

與正常組比較，谷氨酸組PC12凋亡率升高；與谷氨酸組比較，栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12凋亡率降低，見圖3。

活性的影響

與正常組比較，谷氨酸組PC12 Caspase-3活性明顯升高（P<0.01）；與谷氨酸組比較，栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12 Caspase-3活性明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見表2。

4.4 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)損傷PC12 Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

與正常組比較，谷氨酸組PC12 Bcl-2基因表達降低、Bax基因表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與谷氨酸組比較，栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12 Bax基因表達降低、Bcl-2基因表達升高，栝樓桂枝顆粒高劑量組差異明顯（P<0.05）。結(jié)果見圖4。

4.5 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)損傷PC12 Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

與正常組比較，谷氨酸組PC12 Bcl-2、Bax蛋白表達明顯降低（P<0.01）；與谷氨酸組比較，栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12 Bax、Bcl-2蛋白表達增強，栝樓桂枝顆粒高劑量組差異明顯（P<0.01）。結(jié)果見圖5。

5 討論

栝樓桂枝顆粒處方來源于張仲景《金匱要略》，由天花粉、白芍、桂枝、甘草、生姜、大棗6味藥組成。方中天花粉清熱生津而潤燥養(yǎng)筋、舒緩筋脈；同時以桂枝湯為基礎(chǔ)方，剛?cè)嵯酀?，開闔相佐，發(fā)汗解肌、溫經(jīng)通脈、助陽化氣、散寒止痛。諸藥配伍，結(jié)構(gòu)嚴謹，邪正兼顧，陰陽并補，氣血雙調(diào)，柔潤筋脈，緩痙之急，能夠解肌和營、生津柔筋，臨床用于治療腦卒中后痙攣性偏癱。

腦卒中發(fā)生機制是一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)過程，其中谷氨酸誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生興奮性或氧化應(yīng)激損傷的過程包括多種信號傳導(dǎo)途徑的參與，其機制比較復(fù)雜。研究表明，抗凋亡蛋白Bcl-2基因家族和Caspase蛋白酶家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用[8]。Bcl-2是一種抗凋亡的基因，Bcl-2過度表達可有效降低神經(jīng)元的損傷，其原因可能與線粒體膜的穩(wěn)定與完整有關(guān)[9]。當無凋亡因素存在時，它和Bax共同維持細胞膜的完整性，抑制線粒體凋亡。受到凋亡刺激時，Bcl-2與Bax生成二聚體釋放Bax，導(dǎo)致細胞凋亡。因此，Bcl-2/Bax比值對于細胞凋亡至關(guān)重要[10]。富蘇等[11]發(fā)現(xiàn)通絡(luò)化痰膠囊能下調(diào)缺血半暗帶Bax表達，促進Bcl-2表達，減少細胞凋亡水平，促進腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)功能的恢復(fù)。本實驗通過Western Blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達，發(fā)現(xiàn)栝樓桂枝顆粒能上調(diào)Bcl-2的表達，提高Bcl-2/Bax比值，表明栝樓桂枝顆?？善鸬娇沟蛲龅淖饔?，且RT-PCR的結(jié)果進一步驗證了其抗凋亡作用。

作為半胱氨酸蛋白酶家族中一員，Caspase-3在凋亡細胞死亡級聯(lián)過程中起著重要作用[12]。它是凋亡細胞通路中的下游蛋白，可以一定的氨基酸序列剪接成多種活性的關(guān)鍵蛋白，在哺乳動物細胞凋亡過程中起著重要作用[13]。無論是fas配體途徑活化Caspase-8，還是線粒體途徑過程中活化Caspase-9，都能導(dǎo)致Caspase-3激活，引起Caspase-3級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡[14]。體內(nèi)研究結(jié)果表明，高濃度谷氨酸能夠激活細胞內(nèi)Caspase-3蛋白的表達，參與谷氨酸誘導(dǎo)的PC12凋亡[15]。

Caspase-3可以催化底物Z-DEVD-R110分解出R110，發(fā)出熒光，一旦Caspase-3發(fā)生剪切，就可以使無熒光的底物產(chǎn)生熒光，且Caspase-3的活性與熒光呈正相關(guān)。本實驗結(jié)果表明，谷氨酸處理細胞后，Caspase-3相對活性顯著升高，表示細胞發(fā)生凋亡。而加入栝樓桂枝顆粒后，Caspase-3相對活性顯著降低，凋亡通路受到抑制，表明栝樓桂枝顆粒能抑制谷氨酸引起的細胞凋亡，起到一定的保護作用。

綜上，栝樓桂枝顆粒能降低PC12 Caspase-3活性，提高Bcl-2/Bax比值，對谷氨酸誘導(dǎo)PC12損傷有保護作用，其機制可能與抗細胞凋亡有關(guān)。但這只是部分調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因研究，具體是否通過調(diào)節(jié)炎癥因子等其他途徑實現(xiàn)其保護作用，有待進一步研究其多層次、多基因的神經(jīng)保護作用。

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（收稿日期：2016-09-19）

（修回日期：2016-10-13；編輯：華強）endprint