甄玉國,陳 雪,趙 巍,,張學峰,,王 濤,,王曉磊,楊平平,李立佳
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院,吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室,吉林長春 130118;2.長春博瑞飼料集團有限公司,吉林省飼料工程技術研究中心,吉林長春 130118;3.吉林農(nóng)業(yè)大學吉農(nóng)博瑞奶??萍佳邪l(fā)中心,吉林長春 130118;4.磐石市畜牧總站,吉林磐石 132300)
酵母培養(yǎng)物對肉仔雞生長性能及盲腸菌群的影響
甄玉國1,2,3*,陳 雪2,3,趙 巍1,2,3,張學峰1,2,3,王 濤1,2,3,王曉磊4,楊平平4,李立佳1
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院,吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室,吉林長春 130118;2.長春博瑞飼料集團有限公司,吉林省飼料工程技術研究中心,吉林長春 130118;3.吉林農(nóng)業(yè)大學吉農(nóng)博瑞奶??萍佳邪l(fā)中心,吉林長春 130118;4.磐石市畜牧總站,吉林磐石 132300)
研究在日糧中添加不同濃度的酵母培養(yǎng)物(YC)對肉仔雞生長性能和盲腸菌群的影響,選用360只7日齡AA肉仔雞,隨機分成6個處理組,即對照組、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% YC組,每組6個重復,每個重復10只雞。結(jié)果表明:日糧中添加YC對肉雞的采食量沒有顯著影響(P>0.05);與對照組相比,日糧中添加0.8%YC顯著提高了肉雞的平均日增重、飼料轉(zhuǎn)化率以及脂肪、鈣和磷的表觀利用率(P<0.05);在21日齡時,0.6%、0.8%、1.0%YC組瘤胃球菌屬和丙酸桿菌屬顯著高于對照組(P<0.05),添加YC后各組的擬桿菌屬均顯著高于對照組(P<0.05),0.4%、0.6%、0.8%、1.0%YC組雙歧桿菌顯著高于對照組(P<0.05),日糧中添加YC對腸桿菌科、梭菌目和鞘氨醇單胞菌沒有顯著影響(P>0.05);42日齡時,1.0%YC組瘤胃球菌屬顯著高于對照組(P<0.05),0.8%和1.0%YC組梭菌目菌群含量顯著高于對照組(P<0.05),0.4%、0.6%、0.8%YC組擬桿菌和雙歧桿菌顯著升高(P<0.05),但腸桿菌科數(shù)量減少(P<0.05);0.8%YC組顯著增加鞘氨醇單胞菌數(shù)數(shù)量(P<0.05);丙酸桿菌數(shù)沒有顯著變化(P>0.05)。因此,日糧中添加0.8%YC對肉雞的生長性能和免疫功能效果最佳,日糧中添加適宜的YC可以增加有益菌的數(shù)量,降低有害菌的數(shù)量。
酵母培養(yǎng)物;肉仔雞;生長性能;盲腸細菌
酵母培養(yǎng)物(Yeast Culture,YC)是一種成分復雜的微生態(tài)制劑,不僅含有酵母細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì),還含有發(fā)酵后形成的酵母細胞外代謝產(chǎn)物和未知的生長因子,目前已受到越來越多營養(yǎng)學家的關注[1]。許多研究表明,YC可以提高動物的生長性能,有效地調(diào)節(jié)家禽小腸和后腸中微生物的數(shù)量和比例[2-3]。動物的腸道菌群是一個復雜的微生態(tài)系統(tǒng),腸道微生物在營養(yǎng)代謝、生理和免疫過程中起重要作用,其中盲腸微生物種類繁多且數(shù)量大,因此盲腸成為了關注的熱點。由于傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)手段具有局限性,因此本試驗在前期PCR-DGGE測序的基礎上,運用RT-PCR技術對肉雞盲腸的瘤胃球菌屬、梭菌目、丙酸桿菌屬、雙歧桿菌屬及腸桿菌屬進行定量分析,比較在日糧中添加YC后盲腸細菌的數(shù)量變化情況。
1.1 酵母培養(yǎng)物 本試驗所用的YC是由吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院吉農(nóng)博瑞奶牛研發(fā)中心提供。YC由釀酒酵母菌種以糖蜜為主要碳源的培養(yǎng)基經(jīng)過10 L發(fā)酵罐發(fā)酵后獲得最大生物量,然后移入50 L發(fā)酵罐厭氧發(fā)酵24 h,最后加入木瓜蛋白酶發(fā)酵36 h使得酵母菌體破壁。其中菌體干重為48.45 g/L,酵母菌破壁率為55.48%,YC干重達到226 g/L。
1.2 試驗設計 選用360只預試至7日齡的AA肉仔雞,根據(jù)體重相近原則隨機分為6個處理組,每組6個重復,每個重復10只雞,自由采食、飲水,舍內(nèi)溫度在預試期維持在32~36℃,以后每周降低2℃,最后達到室溫。1~3日齡24 h光照,3日齡后逐漸遞減為自然光照,同時每天記錄采食量。對照組飼喂玉米-豆粕型粉料日糧配方參照趙巍[4],試驗組分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% YC (YC為濕重,干重分別為0.452‰ YC、0.904‰ YC、1.356‰ YC、1.808‰ YC、2.26‰ YC)。
1.3 生長性能測定 以重復為單位,分別在第7、14、21、28、35、42天早晨空腹稱重,計算各組平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和耗料增重比(F/G):
ADG=(末重-初始重)/(天數(shù)×雞只數(shù))
ADFI=(投料量-剩料量)/(天數(shù)×雞只數(shù))
F/G=ADFI/ADG
1.4 日糧營養(yǎng)物質(zhì)表觀利用率測定 在第15、36天,每個重復隨機挑出1只雞進行代謝試驗,預試4 d,在第19、40天起連續(xù)3 d進行全收糞,挑出糞便中皮屑、羽毛等雜質(zhì)后立即稱重,加入10%硫酸固氮后于-20℃保存。將3 d的混合糞樣在65℃烘箱中烘干、粉碎。測定干物質(zhì)(DM)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、鈣(Ca)、總磷(P)的消化利用率,其中DM測定參照GB/T 6435-2006(飼料中水分和其他揮發(fā)性物質(zhì)含量的測定),CP測定采用凱氏定氮法;EE測定采用索式提取法進行測定;Ca使用原子吸收法進行測定;P使用釩鉬酸銨顯色法進行測定。
1.5 盲腸菌群分析
1.5.1 盲腸DNA提取 在21、42日齡時每個重復隨機挑選2只雞宰殺,將一側(cè)盲腸結(jié)扎,在超凈臺中取出1 g左側(cè)盲腸食糜,加入PBS振蕩溶解后3 000 r/min低速反復離心取上清液,直到?jīng)]有大顆粒固體食糜為止。收集上清液于1.5 mL經(jīng)過高壓處理的EP管中,12 000 r/min離心10 min后棄上清,然后加入1 mL PBS洗滌沉淀,此過程反復進行,直到上清液澄清,沉淀為白色為宜。細菌總DNA的提取方法參照楊朝暉等[5]。將每4只肉雞盲腸提取的DNA混合,用于后續(xù)試驗。
根據(jù)前期試驗16S rDNA PCR-DGGE的測序結(jié)果,選擇表1中細菌種進行熒光定量PCR,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
以肉仔雞盲腸總DNA為模板,運用表1中的特異性引物進行常規(guī)PCR擴增,PCR反應體系(25 μL):1 μL DNA模板,1 μL引物(濃度10 μmol/L),2×Taq MasterMix 12.5 μL,用ddH2O補齊至25 μL。PCR擴增條件:95℃預變性2 min;95℃熱變性30 s,60℃30 s,72℃延伸30 s,35個循環(huán);72℃終延伸5 min。PCR反應結(jié)束后用1%瓊脂糖檢測,應用Axyprep DNA 凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物進行純化回收,具體操作參照試劑盒說明書。
將回收后的PCR產(chǎn)物與pMDTM18-T Vector連接并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中[7]。同時用Axyprep質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA,并測定濃度,換算成拷貝數(shù)[8]。
1.5.2 RT-PCR檢測 將標準品呈10倍梯度稀釋,每個梯度2個平行,制作標準曲線。每個試驗組混合后的3個DNA模板進行RT-PCR反應,每個DNA樣品2個平行。20 μL反應體系:SYBR Premix Ex Taq 10 μL;Forward Primer 0.8 μL;Reverse Primer 0.8 μL;ROX Reference Dye 0.4 μL;DNA template 2 μL;ddH2O 6 μL。反應條件:95℃ 30 s;95℃ 15 s,60℃ 30 s,40個循環(huán);95℃ 15 s,60℃60 s,95℃ 15 s。反應結(jié)束后,以CT值為縱坐標,基因拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標,計算二者的回歸方程y=kx+b。通過未知樣品的CT值,根據(jù)標準曲線的擬合方程,計算樣品中DNA的拷貝數(shù)。
1.6 統(tǒng)計分析 通過Excel表格對試驗數(shù)據(jù)進行整理,采用SPSS 17.0軟件對各測定指標進行統(tǒng)計分析,均值的多重比較用LSD和Duncan's法進行,YC添加的劑量反應關系用正交多項式進行線性、二次和三次的趨勢分析。
表1 Real-time PCR引物
2.1 YC對肉雞生長性能的影響 由表2可知,在試驗前期(8~21 d),與對照組相比,日糧中添加YC對肉仔雞的ADFI、ADG和F/G均沒有顯著影響(P>0.05);在試驗后期(22~42 d),日糧中添加YC后ADFI和ADG均高于對照組,且0.8%YC組與對照組相比ADG提高了10.21%,F(xiàn)/G降低了5.85%(P<0.05);在整個試驗期(8~42 d),日糧中添加YC對肉雞的ADFI沒有影響(P>0.05),但添加0.8%YC時飼料轉(zhuǎn)化率最高(P<0.05)。同時,日糧中YC的添加量與肉雞的生長性能并未出現(xiàn)劑量反應關系。
2.2 YC對肉雞日糧營養(yǎng)物質(zhì)表觀利用率的影 由表3可以看出,在21日齡時日糧中添加YC增加了EE(線性,P=0.01;二次,P<0.01;三次,P<0.01)、Ca(三次,P<0.01)的消化,EE的消化利用率分別比對照組提高了32.06%(P<0.05)、35.29%、40.65%、39.62%和35.77%(P<0.01),添加YC的各處理組間差異不顯著(P>0.05);0.8%YC組Ca的消化利用率顯著高于對照組、0.2%YC組和1.0%YC組(P<0.05);同時P的利用率也顯著高于對照組(P<0.05),其余各處理組間差異不顯著(P>0.05)。在42日齡時,日糧中添加YC后肉雞EE的利用率均高于對照組(二次,P<0.01;三次,P<0.01),添加0.4%YC時達到了顯著水平(P<0.05),添加0.6%和0.8%YC時達到了極顯著水平(P<0.01),0.8%YC組顯著高于0.2%YC組(P<0.05);添加YC并未影響Ca的表觀利用率,而影響了P(線性,P<0.01;二次,P<0.01;三次,P<0.01)的消化率,P在YC添加量為0.8%時達到最大值(P<0.05),當添加1.0%YC時有降低的趨勢;與對照組相比,日糧中添加YC對DM和CP的消化利用沒有顯著影響(P>0.05)。
表2 YC對肉雞生長性能的影響
表3 YC對肉雞營養(yǎng)物質(zhì)表觀利用率的影響
2.3 常規(guī)PCR對特異性引物驗證 以盲腸DNA為模板,利用不同引物對目的片段進行擴增,1%瓊脂糖驗證結(jié)果如圖1所示。試驗所應用的引物均有特異的擴增區(qū)域,目的條帶清晰可見,特異性較好,可以進行后續(xù)的試驗。
圖1 7種引物常規(guī)PCR結(jié)果
2.4 各菌屬Real-time PCR標準曲線 由表4可知,各標準品的稀釋梯度與CT值建立了良好的線性關系,且Slope在-3.0~-3.6之間,由此可見,試驗設計的7種特異性引物、反應條件及標準品的制備均符合了熒光定量PCR的要求,因此通過未知樣品的CT值,根據(jù)標準曲線的擬合方程,計算未知樣品中DNA的拷貝數(shù)。
2.5 飼喂不同濃度YC后不同細菌拷貝數(shù)的對數(shù)值 如表5所示,在21日齡時,與對照組相比,各處理組腸桿菌科、鞘氨醇單胞菌的菌群數(shù)量相對穩(wěn)定,并未達到顯著水平 (P>0.05);日糧中添加YC后,增加了盲腸中瘤胃球菌屬和丙酸桿菌屬的數(shù)量,且2種菌屬的變化趨勢相似(線性,P<0.01;二次,P<0.01;三次,P<0.01),且0.6%、0.8%和1.0%YC組瘤胃球菌屬和丙酸桿菌屬均顯著高于對照組(P<0.05);YC組梭菌目細菌數(shù)量呈現(xiàn)線性變化趨勢(P=0.01),且0.8%和1.0%YC組顯著高于對照組(P<0.05);YC組擬桿菌屬的數(shù)量均顯著高于對照組(線性,P<0.01;二次,P=0.01;三次,P<0.01);添加YC后各處理組雙歧桿菌數(shù)均高于對照組(線性,P<0.01;二次,P<0.01;三次,P<0.01),且0.4%、0.6%、0.8%和1.0%YC組達到顯著水平(P<0.05)。
42日齡時,隨著YC添加量的增加,肉雞盲腸中瘤胃球菌屬細菌數(shù)呈線性增加(P=0.02),且1.0%YC組達到顯著水平(P<0.05);0.4%、0.6%和0.8%YC組擬桿菌和雙歧桿菌呈二次(P<0.01)、三次(P<0.01)曲線趨勢顯著升高(P<0.05),但腸桿菌科數(shù)量顯著降低(P>0.05);與對照組相比,日糧中添加YC后盲腸鞘氨醇單胞菌數(shù)均升高,且0.8%YC組達到顯著水平(P<0.05);日糧中添加YC后對盲腸中梭菌目和丙酸桿菌數(shù)沒有顯著影響(P>0.05)。
表4 各菌屬Real-time PCR標準曲線
3.1 YC對肉雞生長性能的影響 國內(nèi)外大量研究表明,YC可以增加肉雞的采食量,提高日增重改善其生長性能[9-10]。本試驗中添加YC對肉仔雞前期的生長性能沒有影響,與Gao等[11]的添加YC提高了22~42日齡和整個試驗期ADG和飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)的研究結(jié)果不同。Zhang等[12]研究指出,在0~5周齡肉雞日糧中添加酵母細胞壁可以提高其增重,但對采食量沒有顯著影響。Reisinger等[13]研究表明,添加1 kg/t酵母抽提物(YD)可提高14~35日齡和1~35日齡的ADG。在本研究中,YC的添加量與肉雞的生長性能沒有明顯的劑量反應關系,但添加1.0%YC后,肉雞的ADG和FCR不如添加0.8%YC效果好,這可能是由于高劑量的YC促進了肉仔雞的免疫功能,而機體在免疫功能升高的過程會消耗飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)和能量,使得飼料用于生長的營養(yǎng)物質(zhì)部分降低,最終導致FCR下降。Shen等[14]關于YC對斷奶仔豬的研究結(jié)果與本文相似。日糧中添加YC可提高粗蛋白、鈣和磷的表觀利用率,這可能是由于YC中含有較高活性的植酸酶,可分解飼料中的有機磷,從而促進肉仔雞對于日糧中磷的消化利用。
3.2 YC對肉雞盲腸菌群定植的影響 在本研究中,日糧中添加不同濃度的YC均不同程度地促進了梭菌目、瘤胃球菌、擬桿菌、丙酸菌、雙歧桿菌等有益菌在盲腸的定植。21日齡的梭菌目細菌數(shù)及42日齡瘤胃球菌和梭菌目的細菌數(shù)量與YC呈線性關系,說明隨著YC添加量的增加,瘤胃球菌屬和梭菌目細菌的定植能力逐漸增大。此外,二者均屬于硬壁菌門,經(jīng)發(fā)酵作用可產(chǎn)生短鏈脂肪酸以及脂類等代謝產(chǎn)物,促進脂肪的沉積[15],當YC的添加量為1.0%時,細菌數(shù)量達到最多,可能會增加腸道的負擔,并不利于脂肪的代謝,這也解釋了肉仔雞日糧中添加YC與脂肪的代謝出現(xiàn)二次曲線關系的原因。42日齡時YC與雙歧桿菌數(shù)出現(xiàn)二次曲線關系,1.0%YC添加量雙歧桿菌數(shù)量較其他YC組有所降低,這可能是由于高劑量的YC過度的刺激盲腸微生物的發(fā)酵,產(chǎn)生更為復雜的代謝物,抑制有益菌的生長。
在42日齡時日糧中添加YC對腸桿菌科細菌的抑制效果更明顯,且呈現(xiàn)二次和三次的劑量反應關系。這可能是由于隨著雞腸道的發(fā)育成熟,菌群逐漸變得復雜,更多類型的有益菌在腸道內(nèi)定植,對有害菌的抑制效果更明顯。此外,由于YC中的酵母細胞壁含有甘露糖和葡聚糖,這些物質(zhì)可以與有害菌如大腸桿菌和沙門氏桿菌結(jié)合,能夠阻止病原菌在動物腸細胞表面吸附,使其不能在腸黏膜上定植使其死亡并排除體外,相反有益菌更能有效地利用甘露糖[16]。同時,酵母培養(yǎng)物中含有的氨基酸、葡萄糖、維生素、有機酸等營養(yǎng)代謝物為有益菌的生長提供營養(yǎng)物質(zhì),保證有益菌的優(yōu)勢地位,通過自身產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸,能夠降低腸道內(nèi)的pH,進而抑制對酸度敏感的大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的增殖[17],保護腸道健康發(fā)育。肖曼等[18]研究表明,日糧中添加不同濃度的YC均可降低盲腸中大腸桿菌的數(shù)量,這與本研究的結(jié)果相似。
此外,許多研究均指出鞘氨醇單胞菌可降解芳香類化合物[19-20],這是由于鞘氨醇單胞菌可利用各種簡單分子、降解復雜有機物,能夠產(chǎn)生更多有價值的高分子物質(zhì)(如冷凝膠、β-胡蘿卜素),可淬滅與清除機體內(nèi)產(chǎn)生的自由基[21]。本試驗研究中,鞘氨醇單胞菌的檢測數(shù)量與其他6種細菌數(shù)量相比最低,日糧中添加YC后,僅顯著提高了42日齡0.8%YC組盲腸中鞘氨醇單胞菌的數(shù)量,同時與YC并未出現(xiàn)明顯的劑量反應關系。然而鞘氨醇單胞菌是否會促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用,或者產(chǎn)生了一些未知的代謝物,提高機體免疫能力,仍需進一步探究。
表5 飼喂不同濃度YC后不同細菌拷貝數(shù)的對數(shù)值 lg(拷貝數(shù)/g)
日糧中添加YC與肉雞的生長性能并未出現(xiàn)明顯的劑量反應關系,但添加0.8%YC對肉雞平均日增重、飼料轉(zhuǎn)化率及脂肪、鈣、磷的表觀利用率有較好的促進作用。另外,在日糧中添加適量的YC可以不同程度地改善腸道微生物群落,增加有益菌的數(shù)量,降低有害菌的數(shù)量。
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S831.5
A
10.19556/j.0258-7033.2017-06-112
2016-11-09;
2016-12-06
吉林省重大科技攻關項目(2012ZDGG006)
甄玉國(1971-),男,吉林長春人,博士,副教授,主要從事反芻動物營養(yǎng)研究,E-mail: nickzhen@263.net
* 通訊作者