王龍濤，葛晨霞，谷 博，孫麗敏，姜懷志

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118）

成年遼寧絨山羊皮膚毛囊周期性發(fā)育不同時期FGF5mRNA的表達(dá)分析

王龍濤，葛晨霞，谷 博，孫麗敏，姜懷志

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118）

成纖維細(xì)胞生長因子（FGF5）基因在次級毛囊的周期性發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用。利用RT-PCR技術(shù)檢測了FGF5基因mRNA在成年遼寧絨山羊皮膚毛囊不同時期（興盛前期、興盛期、退行期和休止期）的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明：FGF5基因mRNA在不同時期的遼寧絨山羊皮膚組織中均有表達(dá)，表達(dá)量由高到低順序依次為休止期、興盛期、退行期和興盛前期；在休止期表達(dá)量最高，興盛前期表達(dá)量最低；其中休止期表達(dá)量與興盛前期和退行期間差異均顯著（P<0.05），興盛前期與其余3個時期間也差異顯著（P<0.05），但休止期與興盛期、興盛期與退行期間差異均不顯著（P>0.05）。因此，F(xiàn)GF5基因表達(dá)可能控制著絨山羊的毛囊從興盛期向退行期轉(zhuǎn)換。

遼寧絨山羊；皮膚毛囊；FGF5基因；RT-PCR

成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）作為一種能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長的活性物質(zhì)，在脊椎動物體內(nèi)和無脊椎動物體內(nèi)廣泛存在。迄今為止，F(xiàn)GF家族一共被鑒定出23種［1］，F(xiàn)GF5是FGF家族的第5個成員。研究表明，F(xiàn)GF5是毛囊周期性活動的一種重要的生長因子，與毛囊的發(fā)育以及被毛生長有著密切關(guān)系［2－3］，是所有已知成纖維因子中控制毛囊從興盛期向休眠期轉(zhuǎn)換的最強(qiáng)有力因子。Suzuki等［4］、高愛琴等［5］、韓薩茹拉［6］研究認(rèn)為，絨山羊被毛的長度與FGF5因子息息相關(guān)，F(xiàn)GF5可能是通過控制毛囊生長期的長短影響被毛的長度，從而達(dá)到抑制毛囊細(xì)胞的生長和分化的目的。目前，有關(guān)FGF5基因?qū)|寧絨山羊皮膚毛囊發(fā)育調(diào)控作用的研究報道還不夠深入。本研究從處于不同周期性發(fā)育時期的成年遼寧絨山羊中采取皮膚組織，采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，對FGF5基因mRNA的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，旨在為揭示遼寧絨山羊皮膚絨毛發(fā)生的分子調(diào)節(jié)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物的選擇及皮膚樣品采集

遼寧絨山羊來自吉林亞亨農(nóng)牧科技發(fā)展有限公司。分別于毛囊年度周期性發(fā)育的不同時期，即3—5月（休止期）、6—8月（興盛前期）、9—11月（興盛期）以及12—翌年2月（退行期），選擇年齡相同、體況相近的周歲遼寧絨山羊5只，在羊體右側(cè)肩胛骨后沿背中線與腹中線的1/3體側(cè)位置取1 cm2大小皮膚樣本，放入液氮中快速冷凍保存。

1.2 主要儀器設(shè)備與試劑

總RNA提取試劑盒購自天根生物有限公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自TOYOBO公司；PCR Master Mix購自康為世紀(jì)公司；DL 2000 DNA Marker、瓊脂糖、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、純化試劑盒、6×DNA loading buffer購自Takala寶生物（大連）有限公司；低溫離心機(jī)購自Sigma公司，電泳儀購自北京六一儀器公司，核算蛋白測定儀、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-rad公司，熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上公布的羊FGF5（HQ678172.1）和βactin mRNA（GQ372826.1）序列，用Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)VEGF和β-actin的引物（表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 表達(dá)基因的引物序列信息

1.4 方法

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄操作。以反轉(zhuǎn)錄所得 cDNA為模板，對 FGF5和 β-actin基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：FGF5基因，95℃ 2 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)，72℃ 5 min；β-actin基因，95℃ 2 min，95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)，72℃ 5 min，4℃保存。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以純化后的cDNA為模版，以β-actin基因作為內(nèi)參基因，采用SYBR熒光染料方法，對目的基因FGF5進(jìn)行相對定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μM）各0.8 μL，cDNA模版 2 μL，RNase Free H2O 6.4 μL，總體積 20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 60 s；95℃15 s，60℃15 s，72℃45 s，40個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件計(jì)算實(shí)時熒光定量PCR重復(fù)樣品間Ct值及標(biāo)準(zhǔn)偏差；采用2－ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，分析基因相對表達(dá)差異量。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行單因子方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 遼寧絨山羊皮膚組織總RNA提取

由圖1中可見，所提取的總RNA電泳條帶清晰，并沒有基因組DNA污染，完整性良好。用核酸蛋白測定儀對其純度進(jìn)行測定，所有樣品的OD260/OD280值均在1.8～2.0之間，符合后續(xù)試驗(yàn)對RNA質(zhì)量的要求。

圖1 總RNA電泳結(jié)果

2.2 PCR擴(kuò)增目的片段

瓊脂糖凝膠電泳（1%）檢測FGF5基因目的片段的擴(kuò)增情況，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到的片段與目的基因基本相符，沒有二聚體產(chǎn)生（圖2）。

2.3 熒光定量PCR分析

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增曲線 反應(yīng)結(jié)束完成后，根據(jù)各擴(kuò)增曲線得到的Ct值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖3可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線上的4個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)都在一條直線上，擬合度高；PCR溶解曲線形成單峰，說明擴(kuò)增特異性較好，可信度較高。

圖2 FGF5和β-actin基因的PCR產(chǎn)物

2.3.2 qPCR檢測 采用qPCR方法，檢測不同時期的成年遼寧絨山羊皮膚毛囊組織中FGF5基因的表達(dá)量，并通過Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個樣品基因與相應(yīng)內(nèi)參基因的表達(dá)相對值（表2）。結(jié)果表明，F(xiàn)GF5基因mRNA在不同時期的遼寧絨山羊皮膚組織中均有表達(dá)，在休止期表達(dá)量達(dá)到最高峰，在興盛前期表達(dá)量達(dá)到最低峰：其中表達(dá)量在休止期與興盛前期和退行期間差異顯著（P<0.05），興盛前期與其余3個時期間也差異顯著（P<0.05），休止期與興盛期、興盛期與退行期間差異均不顯著（P>0.05）。

表2 FGF5熒光定量PCR定量結(jié)果

圖3 FGF5基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線

3 討論

FGF5與毛囊的發(fā)育有著密切的關(guān)系，是影響被毛生長最重要的生長因子。Hebert等［2］和Sundberg等［7］分別采用基因敲除等方法研究證實(shí)，F(xiàn)GF5與毛囊發(fā)育有著密切關(guān)系，是毛囊周期性活動以及被毛生長的一個極其重要的生長因子，是已知的調(diào)控毛囊發(fā)育的各種因子中控制毛囊從興盛期向休眠期轉(zhuǎn)換最強(qiáng)有力的因子。隨后Housley等［8］、Dr?gemüller等［9］、李春笑等［10］在犬、貓和兔等動物的研究中證實(shí)，F(xiàn)GF5基因外顯子突變與動物的產(chǎn)毛量相關(guān)聯(lián)。劉海英等［11］和韓薩茹拉等［6］通過對FGF5基因在內(nèi)蒙古絨山羊不同時期皮膚的表達(dá)證實(shí)，該基因可以在絨山羊皮膚毛囊發(fā)育周期中的各個時期表達(dá)，并且該基因突變位點(diǎn)僅與絨山羊的纖維長度和含絨率相關(guān)，而與絨纖維直徑不相關(guān)。高愛琴等［5］研究表明，在內(nèi)蒙古絨山羊毛囊的生長旺盛期和退行期FGF5基因均有表達(dá)。而何永新等［12］在太行黑山羊的研究中發(fā)現(xiàn)，興盛期的FGF5基因mRNA表達(dá)量顯著高于退行期。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF5基因在不同時期的遼寧絨山羊皮膚組織中均有表達(dá)，并以興盛期為最高。與上述相關(guān)研究報道相一致，說明FGF5主要控制著絨山羊的毛囊從興盛期向退行期轉(zhuǎn)換。

［1］ Souletl，Chevete，Lemaitreg，et al.FGFs and their receptors，in vitroand in vivo studies：newFGF receptor in the brain，F(xiàn)GF-1 in muscle，and the use of functional analogues of low-affinity heparin-binding growth factor receptors in tissue repair［J］.Mol Reprod Dev，1994，39-49.

［2］ Hebert J M，Rosenquist T，Martin G R.FGF5as a regulator of the hair growth cycle：Evidence from targeted and spontaneous mutations［J］. Cell，1994，78：1017-1025.

［3］ Petho-Schramm A，Muller H J，Paus R.FGF5and the murine hair cycle［J］.Arch Dermatol Res，1996，288（5/6）：264-266.

［4］ Suzuki S，Ota Y，Ozawa K，et al.Dual-mode regulation of hair growth cycle bytwoFGF5gene products［J］.J Invest Dermatol，2000，114（3）：456-463.

［5］ 高愛琴，李寧，李金泉，等.不同發(fā)育階段絨山羊皮膚中FGF5基因mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2008，23（1）：36-37.

［6］ 韓薩茹拉.成纖維生長因子5（FGF5）在絨山羊皮膚中表達(dá)及多態(tài)性分析［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［7］ Sundberg J P，Rourk M H，Boggess D，et al.Angora mouse mutation： altered hair cycle，follicular dystrophy，phenotypic maintenance of skin grafts，and changes in keratin expression［J］.Veterinary Pathology，1997，34（3）：171-179.

［8］ Housley D J，Venta P J.The long and the short of it：evidence that FGF5is a major determinant of canine‘hair’-itability［J］.Animal Genetics，2006，37（4）：309-315.

［9］ Dr?gemüller C，Rüfenacht S，Wichert B，et al.Mutations within the FGF5gene are associated with hair length in cats［J］.Animal Genetics，2007，38（3）：218-221.

［10］李春笑，蔣美山，陳仕毅，等.兔成纖維細(xì)胞生長因子（FGF5）基因SNP及其與產(chǎn)毛量的相關(guān)分析［J］.遺傳，2008，30（7）：893-899.

［11］劉海英，楊桂芹，張薇，等.FGF5基因?qū)?nèi)蒙古絨山羊絨毛性狀的影響［J］.遺傳，2009，31（2）：175-179.

［12］何永新，陳玉林，姜維，等.太行黑山羊FGF5基因CDs區(qū)的序列特征及其表達(dá)規(guī)律研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，39（12）：45-50.

Expression of FGF5mRNA in Hair Follicles of Adult Liaoning Cashmere Goats in Different Periods

WangLongtao，Ge Chenxia，JiangHuaizhi，et al
（College ofScience and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

FGF5plays an important role in the developmental processes of secondary follicle.Using RT-PCR technology,this study was conducted to detect the expression pattern of FGF5mRNA of adult Liaoning cashmere goats in different periods.The result showed that FGF5gene mRNA were expressed in skin tissue of Liaoning cashmere goats in different periods，while the expression levels，from high to low，were telogen，anagen，catagen and proanagen，respectively.The expression level reached a peak in telogen and reached minimum peak in proanagen.The expression level between telogen and proanagen，catagen had significantdifferences（P＜0.05），andthedifferencebetweenproanagenandtheanagenwas significant（P＜0.05）.

Liaoningcashmeregoat；hair follicle；skin；FGF5gene；RT-PCR

S827.2

A

2095-3887（2017）02-0005-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.002

2017-03-28

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2009BADA5B03）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20080212）

王龍濤（1975-），男，博士。

姜懷志（1968-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事綿山羊遺傳育種與種質(zhì)資源創(chuàng)新研究工作。