黃 瑩萬 斌黃振炎

健脾補肺膏對慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的療效※

黃 瑩1萬 斌2黃振炎3

目的探討脾補肺膏治療慢性阻塞性肺疾?。–OPD）小鼠模型的臨床療效。方法將40只SPF級C57BL/6小鼠隨機分為5組，分別為空白組、COPD模型組、健脾補肺膏高劑量組、中劑量組和低劑量組。除空白組外，其余小鼠均采用煙熏結(jié)合氣管內(nèi)脂多糖（LPS）滴入法制作COPD小鼠模型，待模型穩(wěn)定后，空白組和模型組不予以藥物治療，健脾補肺膏高、中、低劑量組小鼠灌服健脾補肺膏溶液（給藥濃度分別為20.8、10.4、5.2 ml/kg/d）。觀察各小鼠精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化及大小便情況等，檢測各組小鼠吸氣阻力（RI）、肺靜態(tài)順應(yīng)性、功能殘氣量（FRC）、趨化因子（KC）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）值。結(jié)果空白組和健脾補肺膏高劑量組小鼠體重隨飼養(yǎng)周期增大，但健脾補肺膏高劑量組小鼠體重增加較緩慢，而其余 3組小鼠體重均有不同程度減輕；COPD模型組小鼠RI值、肺靜態(tài)順應(yīng)性、FRC值較空白組均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；健脾補肺膏高、中、低劑量組小鼠RI值、肺靜態(tài)順應(yīng)性以及FRC值均較COPD模型組明顯降低，且健脾補肺膏高劑量組小鼠RI值、肺靜態(tài)順應(yīng)性以及FRC值均明顯低于健脾補肺膏中、低劑量組，呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；COPD模型組小鼠炎性細(xì)胞總數(shù)、IL-6、TNF-a、KC值較空白組均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；健脾補肺膏高、中、低劑量組小鼠炎性細(xì)胞總數(shù)、IL-6、TNF-a、KC值均較 COPD模型組明顯降低，且健脾補肺膏高劑量組小鼠炎性細(xì)胞總數(shù)、IL-6、TNF-a、KC值均明顯低于健脾補肺膏中、低劑量組，呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論健脾補肺膏方能顯著增加COPD模型小鼠體重，改善肺功能，同時還能減輕炎性反應(yīng)。

健脾補肺膏；慢性阻塞性肺疾病；肺功能；小鼠

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種以持續(xù)性氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，常與氣道和肺組織接觸煙霧等有害氣體或有害顆粒，出現(xiàn)異常慢性炎癥有關(guān)[1]。目前，臨床針對 COPD主要以西醫(yī)對癥治療為主，如應(yīng)用支氣管擴張劑、激素抗炎劑、祛痰藥、免疫調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑等，但單純西藥治療難以改善肺功能，遠(yuǎn)期療效較差。而中醫(yī)療法通過對COPD穩(wěn)定期患者辨證施治，不但能減緩患者肺功能下降趨勢，還能顯著減少肺泡炎性因子產(chǎn)生、抑制氣道重塑、調(diào)節(jié)機體免疫功能[2-3]。本研究就健脾補肺膏對COPD小鼠模型的療效進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6小鼠，40只，8周齡，體重為20～22 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供（SCXK【京】2014-0004），符合國際動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。小鼠飼養(yǎng)于廣州呼吸疾病研究所動物實驗中心SPF級動物實驗室（SYXK【粵】2011-0074），并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 實驗試劑及藥物脂多糖（LPS，美國 Sigma公司）；健脾補肺膏方（北黃芪300 g、黨參250 g、茯苓200 g、白術(shù)200 g、百合200 g、蒼術(shù)150 g、炙甘草100 g、法半夏100 g、干姜100 g、浙貝母150 g、北杏仁100 g、桔梗100 g、黃精150 g、川樸150 g、熟地黃150 g、山萸肉150 g、葶藶子150 g、生地黃150 g、當(dāng)歸100 g、懷山藥200 g、知母150 g、澤蘭150 g、川紅花50 g、木香100 g、砂仁50 g、陳皮50 g、龜板膠150 g、阿膠150 g、冰糖200 g，由中山市中醫(yī)院中藥房提供）；紅枚牌香煙（廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司）；腫瘤壞死因-a（TNF-a）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、趨化因子（KC）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器及設(shè)備 FinePointeTMPET型小動物肺功能儀（美國Buxco公司）；自制熏煙箱（長寬高分別為50 cm、60 cm、90 cm）；BX 41TF型光學(xué)顯微鏡（日本電子株式會社）。

1.4 方法

1.4.1 制備健脾補肺膏 按照動物數(shù)量及給藥時間計算藥物劑量，取膏方組成藥物加適量水浸泡 24 h后煎煮取汁，用脫脂棉和紗布過濾 3次，將濾液混合后濃縮至2000 ml左右，加入冰糖200 g煉制收膏。每1毫升膏劑含生藥1.26 g，將膏方滅菌冷卻后置于4 ℃冰箱中保存。

1.4.2 實驗分組及COPD模型建立 將40只小鼠隨機均分為空白組、COPD模型組、健脾補肺膏高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組 8只。除空白組不進行COPD模型制備外，其余小鼠均需采用熏煙聯(lián)合氣道內(nèi)LPS滴入法制作COPD穩(wěn)定期小鼠模型。將各組小鼠（除空白組）分別置于熏煙箱中進行人為被動吸煙，熏煙時間為每天4次，上下午各2次，每次1小時（每次熏煙間隔15 min，上、下午間隔3～4 h，每小時10支香煙，每周6天），整個熏煙持續(xù)12周，在第1天和第14天向小鼠氣管內(nèi)注射LPS，劑量為7.5 μg/只。

藥物用量按陳奇[4]提供的常用動物與人藥物劑量換算公式計算，模型制備完成后，健脾補肺膏高、中、低劑量組灌服健脾補肺膏溶液（給藥濃度分別為20.8、10.4、5.2 ml/kg/d）。整個實驗持續(xù)4個周期（4周），每個周期完成后均需測量小鼠體重[5-7]。

1.4.3 一般行為觀察 觀察各小鼠精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化及大小便情況等。

1.4.4 肺功能測定 治療 4周后，測量各組小鼠肺功能，包括吸氣阻力（RI）、肺靜態(tài)順應(yīng)性及功能殘氣量（FRC）。具體操作如下：于小鼠腹腔注射 1%戊巴比妥鈉（空白組按100 mg/kg，其余各組小鼠按70 mg/kg）進行麻醉采用，于頸部甲狀腺處切開氣管，氣管插管，連接小動物通氣機進行機械通氣，設(shè)定潮氣量10 ml/kg，吸氣壓力為8～12 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa），每分鐘呼吸120次，吸呼比10:15，待圖形穩(wěn)定后，開始測定肺通氣功能。

1.4.5 肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)目以及TNF-a、IL-6和KC值測定 小鼠麻醉后，暴露氣道，予以留置針氣管內(nèi)插管結(jié)扎，再用加EDTA的PBS緩沖液沖洗支氣管肺泡，回收肺泡灌洗液，得到的灌洗液在每分鐘1500 r條件下離心10 min（離心半徑15 cm），完成后收集上清液保存于-80 ℃冰箱中。向剩余的沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液 200 μl混勻，常溫下反應(yīng)3～5 min，離心棄上清，加入PBS緩沖液1 ml，混勻，取10 μl于細(xì)胞計數(shù)板上行細(xì)胞計數(shù)[8-9]。最后，-80 ℃保存的上清液使用ELISA試劑盒測定TNF-a、IL-6和KC值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用F檢驗，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般行為觀察空白組和健脾補肺膏高劑量組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)順滑干凈有光澤，體重隨飼養(yǎng)周期增大，但健脾補肺膏高劑量組小鼠體重增加較緩慢，而其余3組小鼠體重均有不同程度減輕；另外，模型組小鼠與其他組小鼠相比，精神狀態(tài)較差，行動遲緩，呼吸急促，毛發(fā)缺少光澤，局部脫落，進食量減少。見表1。

表1 各組小鼠治療前后體重比較(g,±s)

表1 各組小鼠治療前后體重比較(g,±s)

組別 只數(shù) 0周 1周 2周空白組 8 22.4±1.3 24.8±0.9 26.4±1.1 COPD模型組 8 22.9±1.5 21.7±1.1 20.8±0.8高劑量組 8 22.1±1.0 22.3±1.3 22.7±0.7中劑量組 8 21.7±1.3 21.8±1.5 21.4±1.8低劑量組 8 22.6±0.7 22.3±1.1 21.9±0.8組別 只數(shù) 3周 4周空白組 8 27.8±1.4 29.6±1.5 COPD模型組 8 20.1±0.6 19.6±1.2高劑量組 8 23.1±0.8 24.6±1.7中劑量組 8 21.7±0.9 21.5±1.1低劑量組 8 21.6±1.0 21.1±1.6

2.2 治療后各組小鼠肺功能改變COPD模型組小鼠RI值、肺靜態(tài)順應(yīng)性、FRC值較空白組均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）；健脾補肺膏高、中、低劑量組小鼠RI值、肺靜態(tài)順應(yīng)性以及FRC值均較COPD模型組明顯降低，且健脾補肺膏高劑量組小鼠RI值、肺靜態(tài)順應(yīng)性以及FRC值均明顯低于健脾補肺膏中、低劑量組，呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 治療后各組小鼠肺功能改變

2.3 治療后各組小鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞總數(shù)及各因子表達(dá)量比較COPD模型組小鼠炎性細(xì)胞總數(shù)、IL-6、TNF-a、KC值較空白組均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；健脾補肺膏高、中、低劑量組小鼠炎性細(xì)胞總數(shù)、IL-6、TNF-a、KC值均較COPD模型組明顯降低，且健脾補肺膏高劑量組小鼠炎性細(xì)胞總數(shù)、IL-6、TNF-a、KC值均明顯低于健脾補肺膏中、低劑量組，呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 治療后各組小鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞總數(shù)及各因子表達(dá)量比較(±s)

表2 治療后各組小鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞總數(shù)及各因子表達(dá)量比較(±s)

組別 只數(shù) 細(xì)胞總數(shù)計數(shù)(109/L) IL-6 (pg/ml) KC (pg/ml) TNF-a (nmol/L)空白組 8 16.2±1.8 7.5±0.9 45.5±1.2 33±3模型組 8 136.3±19.7 19.6±2.5 157.5±8.8 86±10高劑量組 8 37.5±1.5 10.2±1.1 66.4±6.8 56±7中劑量組 8 58.4±3.8 12.6±1.1 76.5±9.5 68±8低劑量組 8 89.8±6.4 16.1±2.0 96.2±7.2 76±8

3 討論

COPD不僅累及肺，也可以引起顯著全身反應(yīng)。目前，COPD居全球病死原因第四位，世界衛(wèi)生組織公布，至2020年COPD將位居世界疾病經(jīng)濟負(fù)擔(dān)的第五位[10]。我國最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全國約4000萬COPD患者，40歲以上人群COPD患病率為8.2%，每年因 COPD病死人數(shù)達(dá)100萬人，致殘人數(shù)達(dá)500～1000萬人，COPD居我國疾病負(fù)擔(dān)首位，給患者及其家庭、社會帶來沉重經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[11]。CPOD發(fā)病機制仍有很大爭議，目前炎性細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)在氣道炎癥中起重要作用的觀點得到越來越多人的認(rèn)同，其中包括IL-6、KC及TNF-a[12]。慢性炎性反應(yīng)可誘發(fā)肺實質(zhì)損傷（產(chǎn)生肺氣腫），造成小氣道纖維化。這些改變可導(dǎo)致氣體陷閉和進行性氣流受限，誘發(fā)呼吸困難和COPD其他癥狀。西醫(yī)對COPD的治療包括藥物治療、機械通氣、康復(fù)治療及自我管理等綜合措施[13-14]。西醫(yī)針對 COPD患者，一般予以規(guī)律劑量的短效支氣管擴張劑，同時輔以吸氧、抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素及無創(chuàng)或有創(chuàng)正壓通氣等治療，但治療效果并不理想。中醫(yī)治療COPD方法多樣，如針灸、推拿（穴位按摩）、中藥穴位貼、中藥霧化吸入、中藥支氣管肺泡灌洗、中藥灌腸等外治法，對COPD均有較好的療效。

COPD在中醫(yī)病名中屬于“咳嗽”“肺脹”等范疇，辨證屬本虛標(biāo)實之證，本虛主要為肺、脾、腎三臟之虛，早期多為肺氣虛，繼而累及脾腎，致肺、脾、腎三臟俱虛；標(biāo)實則為痰、熱、瘀交互錯雜致病，病情遷延難愈，其穩(wěn)定期又以肺脾腎虛衰為主[15]。中醫(yī)認(rèn)為，COPD穩(wěn)定期的病機特點為外邪已去，本病病位首先在肺，繼則影響脾腎，后期病及于心；由于久病耗氣，肺氣不利，不能正常宣發(fā)肅降，肺氣上逆而致咳嗽。肺金為脾土之子，久病肺氣虧虛，子盜母脾主肌肉，久則致脾氣虧虛，不能正常輸布津液，聚而成痰，上歸于肺而成濁痰，即《醫(yī)宗必讀?痰飲》“脾土虛濕，清者難升，濁者難降，流中滯膈，郁而成痰”之謂。痰貯于肺，阻礙氣機，氣機不暢則發(fā)咳嗽、咳痰、胸脹滿、氣短。反之，脾氣虛弱，運化失常，土不生金，致肺氣更虛。因此，在穩(wěn)定期，應(yīng)充分發(fā)揮中醫(yī)培本固元的優(yōu)勢，培土以生金以助生化之源，可有效改善患者營養(yǎng)不良狀態(tài)、提高抗邪復(fù)元能力，從而延緩肺功能下降。本研究立足于COPD穩(wěn)定期肺脾兩虛特點，選用陳夏六君子湯為主方研制的健脾補肺膏方，甘溫益氣而不礙邪，行氣化滯而不傷正，使脾氣充盈而運化復(fù)健，濕濁去而痰滯漸，全方起健脾肺、補腎納氣化痰止咳之效[16]。

本研究結(jié)果表明，健脾補肺膏方能顯著增加COPD模型小鼠體重，改善肺功能，同時還能減輕炎性反應(yīng)。RI值增高，說明氣道不完全可逆性狹窄；Cchord值增大，說明肺組織彈性下降。另外，COPD穩(wěn)定期給予中醫(yī)治療，除了能減少患者COPD急性發(fā)作的次數(shù)以外，還能有效改善患者營養(yǎng)不良狀態(tài)、提高抗邪復(fù)元能力，增強抵抗力，從而從根本緩解COPD急性加重，延緩患者肺功能下降。本研究使用的膏方制作簡單，解決了患者長期煎服中藥的困擾，使患者用藥更方便，利于患者長期堅持服用。

綜上所述，本實驗通過健脾補肺膏治療 COPD穩(wěn)定期小鼠模型，一定程度上對COPD疾病的進展起到了良好的干預(yù)作用，同時各種檢測結(jié)果也均與該病臨床治療結(jié)果相符。所以，本研究的進行為COPD穩(wěn)定期的早期臨床治療及基礎(chǔ)研究提供一個可靠的新方法。

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The effect of Jianpi tonifying lung paste on mice with chronic obstructive pulmonary disease

Huang Ying Wan Bin Huang Zhenyan

ObjectiveTo investigate the clinical effect of spleen tonifying lung paste in treating chronic obstructive pulmonary disease in mice.Methods40 SPF C57BL/6 mice were randomly divided into 5 groups,namely control group,COPD model group,jianpibufei ointment in high dose group,middle dose group and low dose group,except the blank group,the remaining mice were exposed to tobacco smoke by intratracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS) COPD mice model,to be the model is stable,not to the blank group and the model group medication,jianpibufei cream high in the low dose group of mice orally jianpibufei paste solution(drug concentration were 20.8,10.4,5.2 ml/kg/d).To observe the mice mental state,diet,body weight changes and urine,were detected inspiratory resistance(RI), static pulmonary compliance,functional residual capacity (FRC),chemokine(KC),tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin-6 (IL-6) value.ResultsThe blank group and the weight of spleen and lung extract high dose group of mice with feeding period increase,but jianpibufei ointment in high dose group mice increased more slowly, while the remaining 3 groups of mice had different degrees of weight loss;COPD model group,RI value,static lung compliance,FRC values were significantly higher than the control group,the difference there was statistically significant (P＜0.05);jianpibufei paste,high medium and low dose group of mice RI,static lung compliance and FRC were significantly higher than COPD model group decreased,and jianpibufei ointment in high dose group of RI value,staticlung compliance and FRC value were significantly lower than that of tonifying spleen lung extract medium and low dose group,dose dependently,the differences were statistically significant(P＜0.05);COPD model group,the number of inflammatory cells,IL-6,TNF-a,KC values were significantly higher than the control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);jianpibufei paste,high medium and low dose group of mice the number of inflammatory cells,IL-6, TNF-a,KC values were lower than COPD model group decreased obviously,and jianpibufei ointment in high dose group of total inflammatory cells,IL-6,TNF-a,KC values were significantly lower than that of jianpibufei ointment in the low dose group,dose dependently,the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionInvigorating spleen and tonifying lung paste can significantly increase the body weight of COPD mice,improve lung function,but also reduce the inflammatory response.

Jianpibufei Gao;Chronic obstructive pulmonary disease;Pulmonary function;Mice

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.05.011

1廣州中醫(yī)院大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，廣東中山 528400

2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510120

3廣州呼吸病研究所國家呼吸疾病重點實驗室，廣東廣州 510120

2016年中山市衛(wèi)生和計劃生育局課題（編號：2016J082）