李彥凱，汪禮君，宋曉賀

(皖西南生物多樣性和生態(tài)保護(hù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶246133)

冬青衛(wèi)矛葉部病害調(diào)查研究

李彥凱，汪禮君，宋曉賀

(皖西南生物多樣性和生態(tài)保護(hù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶246133)

冬青衛(wèi)矛(EuonymusjaponicusThunb.)葉部病害在我國(guó)普遍發(fā)生且嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值和綠化效果，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整株枯死。系統(tǒng)調(diào)查了冬青衛(wèi)矛葉部病害發(fā)生及危害情況，并對(duì)冬青衛(wèi)矛主要病害病原菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：冬青衛(wèi)矛葉部病害的癥狀表現(xiàn)主要有4種：Ⅰ型病害侵染時(shí)間早，6～7月為發(fā)病盛期；Ⅱ型和Ⅲ型病害常?；旌习l(fā)生，同一葉片可有2種病斑，8～10月為發(fā)病盛期；Ⅳ型病害只能從傷口侵入，該病原菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不嚴(yán)格，具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，且在高溫高濕條件下，易造成病害的迅速流行和爆發(fā)。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列分子鑒定分析，將Ⅳ型病害病原菌鑒定為Neopestalotiopsisfoedans。

冬青衛(wèi)矛(EuonymusjaponicusThunb.)；葉部病害；病原菌；分離鑒定

冬青衛(wèi)矛(EuonymusjaponicusThunb.)又名大葉黃楊，原產(chǎn)日本，為衛(wèi)矛科(Celastraceae)衛(wèi)矛屬(EuonymusL.)常綠灌木和小喬木樹種，由于其具有耐貧瘠、耐干旱、抗污染、生長(zhǎng)快、管理粗放、耐修剪等特點(diǎn)，是園林綠化、觀賞和環(huán)境保護(hù)的重要樹種之一。然而近年來(lái)，冬青衛(wèi)矛葉部病害在我國(guó)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重。輕者病斑累累影響生長(zhǎng)，重者葉片枯死、脫落甚至植株成片死亡，嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值及綠化效果。流行年份造成8～10月間冬青衛(wèi)矛大量落葉，管理粗放的地方發(fā)病尤為嚴(yán)重。因此，開展冬青衛(wèi)矛葉部病害系統(tǒng)調(diào)查，掌握病害的發(fā)生流行規(guī)律，鑒定其主要病害病原菌，對(duì)于挖掘冬青衛(wèi)矛抗病種質(zhì)資源以及制訂有針對(duì)性的綜合防治措施均具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查范圍

2015年4月至2016年10月，分別以合肥、安慶、蕪湖、馬鞍山、南京5個(gè)城市冬青衛(wèi)矛植株為普查對(duì)象，調(diào)查地點(diǎn)包括各城市道路、廣場(chǎng)、公園、機(jī)關(guān)、學(xué)校、城區(qū)、住宅小區(qū)以及苗圃等。

1.2 調(diào)查方法

對(duì)上述5個(gè)城區(qū)冬青衛(wèi)矛葉部病害發(fā)生情況進(jìn)行普查，觀察典型病害的種類、癥狀、發(fā)病情況。在普查的基礎(chǔ)上，選取6個(gè)典型調(diào)查點(diǎn)對(duì)冬青衛(wèi)矛病害發(fā)生情況進(jìn)行詳細(xì)的調(diào)查，每個(gè)調(diào)查點(diǎn)總株數(shù)為100～150株，詳細(xì)記錄調(diào)查日期、調(diào)查地點(diǎn)、發(fā)病株數(shù)、危害部位、分布情況(單株、簇狀、塊狀和片狀)、自然條件及管理水平(地勢(shì)、土質(zhì)及氣候條件)。對(duì)發(fā)病典型的病葉和整株拍照記錄，采樣帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌鑒定。按照表1中冬青衛(wèi)矛病害的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，并按下述公式計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

發(fā)病率=(發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100%

病情指數(shù)=∑(各級(jí)發(fā)病株數(shù)×各級(jí)代表值)/調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值

表1 冬青衛(wèi)矛葉部病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.3 病原菌的鑒定

采用組織分離法對(duì)冬青衛(wèi)矛Ⅳ型病害癥狀典型的病葉進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)。挑取病葉上的繁殖體和培養(yǎng)基上黑色的分生孢子堆，制成臨時(shí)玻片，根據(jù)病原菌形態(tài)特征和癥狀特點(diǎn)初步鑒定病原菌。同時(shí)利用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對(duì)菌絲體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化并測(cè)序。通過(guò)BLAST分析，將測(cè)序菌株ITS序列與Genbank中已知種rDNA進(jìn)行序列比對(duì)分析，確定菌株類別。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬青衛(wèi)矛葉部病害發(fā)病率和病情指數(shù)

通過(guò)對(duì)合肥市杏花公園、合肥市肥西縣四十埠公園、南京市玄武湖公園、南京市莫愁湖公園、安慶市菱湖公園、安慶市黃梅戲?qū)W院、安慶師范大學(xué)等處冬青衛(wèi)矛病害的發(fā)生情況(表2)調(diào)查得知，合肥市杏花公園大門冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為90.3%，病情指數(shù)為38.83；合肥市肥西縣四十埠公園冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為20.0%，病情指數(shù)為11.25；南京市玄武湖公園冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為94.1%，病情指數(shù)為41.18；南京市莫愁湖公園冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為66.7%，病情指數(shù)為22.62；安慶師范大學(xué)冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為24.1%，病情指數(shù)為24.14；安慶市黃梅戲?qū)W院冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為17.4%，病情指數(shù)為9.78；安慶市菱湖公園冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為80.6%，病情指數(shù)為34.70。調(diào)查結(jié)果充分說(shuō)明冬青衛(wèi)矛葉部病害發(fā)生普遍且危害嚴(yán)重，尤其在發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)，發(fā)病率高達(dá)90%以上，病情指數(shù)高達(dá)42.00。

表2 冬青衛(wèi)矛葉部病害發(fā)生情況調(diào)查

2.2 冬青衛(wèi)矛葉部的病害癥狀類型

通過(guò)對(duì)冬青衛(wèi)矛葉部病害的系統(tǒng)調(diào)查，并對(duì)采集標(biāo)本進(jìn)行癥狀對(duì)比和鏡檢鑒定，發(fā)現(xiàn)冬青衛(wèi)矛葉部病害癥狀主要有4種類型，分別按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ進(jìn)行編號(hào)。

Ⅰ型病害：病斑較小，初期葉片背面產(chǎn)生水漬狀斑點(diǎn)，逐漸在葉片正面產(chǎn)生許多黃色小突起斑，近圓形，對(duì)光看呈現(xiàn)出透明狀。隨著病情的發(fā)展，黃色突起斑中間變褐，背面水漬狀，有黃色暈圈。后期在葉片的正面和背面產(chǎn)生小黑點(diǎn)，中央灰白色，不規(guī)則排列。嚴(yán)重時(shí)，病斑連成一片，似瘡痂狀，造成葉片提早枯死，脫落(圖1A)。該病害侵染時(shí)間早，5月初開始發(fā)病，6～7月份為發(fā)病盛期。因此，防治要提前，約在5月底至6月初進(jìn)行。

Ⅱ型病害：發(fā)病初期葉片上出現(xiàn)黃色或淡綠色凸起小斑點(diǎn)，后擴(kuò)展成近圓形或不規(guī)則的大斑，有時(shí)微具同心輪紋。病斑邊緣隆起，褐色，隆起的邊緣外有延伸的黃色暈圈，中心黃褐色或灰褐色，病斑上密生絨毛狀黑色小點(diǎn)，即病原菌的子座組織。背面黑色絨毛狀小點(diǎn)少于正面。嚴(yán)重時(shí)病斑連成一片，導(dǎo)致葉片枯死、脫落甚至植株成片死亡(圖1B)。8～10月份該病害大量發(fā)生，發(fā)病率高達(dá)90%以上，11月以后發(fā)病基本停止。管理粗放、樹勢(shì)衰老或有介殼蟲危害時(shí)，會(huì)加重該病害的發(fā)生。

Ⅲ型病害：葉部病斑多從葉緣開始，呈褐色，近圓形或不規(guī)則形，病斑邊緣有較狹的深褐色隆起，中央灰白色，后期在灰白色處形成較粗的圓形或橢圓形小黑點(diǎn)，即病菌分生孢子盤(圖1C)。排列稀疏，多在葉片正面，有時(shí)呈輪紋狀排列。在高溫多濕條件下，產(chǎn)生膠粘狀粉紅色分生孢子堆。該病害常常與Ⅱ型病害混合發(fā)生，同一葉片上可有2種病斑，此病與Ⅱ型病害的區(qū)別之處在于，該病葉片病斑周圍沒(méi)有黃色暈圈，其子實(shí)體較粗大。

Ⅳ型病害：該病害主要危害葉片和葉柄。病斑圓形或不規(guī)則形，病斑邊緣有黃色暈圈，斑上形成小黑粒點(diǎn)狀的分生孢子盤。多在葉片正面，有時(shí)呈輪紋狀排列(圖1D)。常與病害Ⅲ混合發(fā)生。

A：Ⅰ型病害；B：Ⅱ型病害；C：Ⅲ型病害；D：Ⅳ型病害；E：菌落形態(tài)正面；F：菌落形態(tài)背面圖1 冬青衛(wèi)矛葉部病害癥狀類型及Ⅳ型病原菌菌落特征

2.3 Ⅳ型病害病原菌鑒定

PDA培養(yǎng)基上菌落呈白色絮狀，生長(zhǎng)繁茂，呈輪紋擴(kuò)展，產(chǎn)生濃墨汁液滴狀的分生孢子盤。背面有淺黃色素沉積(圖1E、F)。分生孢子5個(gè)細(xì)胞，長(zhǎng)梭形，中間3個(gè)細(xì)胞為褐色，頂胞無(wú)色，頂端具有附屬絲2～3根，尾胞無(wú)色，三角形，具有中生式柄1根。分生孢子萌發(fā)時(shí)，第3色胞萌發(fā)，膨大變圓，產(chǎn)生侵入釘侵入寄主細(xì)胞。以冬青衛(wèi)矛Ⅳ型病害病原菌菌株DNA作為模板，用通用引物ITS1/ITS4對(duì)其核糖體rDNA的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為600bp的擴(kuò)增片段。在Genbank中搜索同源序列，用BLAST進(jìn)行比對(duì)，該分離菌株與Neopestalotiopsisfoedans(Genbank:KU593530.1)的同源性為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子鑒定分析，將該病原菌鑒定為污斑多毛孢Neopestalotiopsisfoedans。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)連續(xù)2a的系統(tǒng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)冬青衛(wèi)矛葉部病害的發(fā)生日趨嚴(yán)重，且分布廣泛。尤其在管理粗放樹勢(shì)衰老的植株上，發(fā)病尤為嚴(yán)重，造成葉片大量的早落，整個(gè)枝條甚至整株枯死，嚴(yán)重影響植株的生長(zhǎng)，降低了綠化及觀賞效果。共調(diào)查到冬青衛(wèi)矛葉部病害有6種，其中有2種葉部病害只有零星分布，其余4種病害在每個(gè)調(diào)查點(diǎn)均有發(fā)生且嚴(yán)重，阻礙了冬青衛(wèi)矛的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致觀賞性降低，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，是冬青衛(wèi)矛葉部的主要病害。

Ⅰ型病害病菌主要以菌絲體或分生孢子盤在病葉中越冬，次年5月份，病菌孢子開始萌發(fā)侵染，其發(fā)病時(shí)間要早于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型病害，病斑較小，易造成病葉發(fā)黃、脫落。因此防治時(shí)間要提前，約在5月底防治為宜。Ⅱ型病害病菌主要以菌絲或子座在病葉中越冬，安慶地區(qū)7月中、下旬開始發(fā)病，8月下旬至9月下旬為發(fā)病盛期，發(fā)病率可達(dá)90%以上。Ⅲ型病害往往與Ⅱ型病害混合發(fā)生，一個(gè)葉片常有2種不同的病斑，濕度大時(shí)，可見膠粘狀粉紅色孢子堆。此病害發(fā)生期較Ⅱ型病害稍遲。Ⅳ型病害病菌只能從傷口侵入，主要危害葉片和葉柄，病葉上密生小黑點(diǎn)狀的分生孢子堆。對(duì)該病害病原菌進(jìn)行分離純化，通過(guò)柯赫氏法則證明，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定，將該病原菌確定為Neopestalotiopsisfoedans。在致病性測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，該病原菌無(wú)傷接種、針刺1針和針刺10針接種葉片，差異顯著，說(shuō)明該病害的發(fā)生程度與傷口的大小有關(guān)(結(jié)果待發(fā)表)。冬青衛(wèi)矛需要定期修剪以保持特定的造型，葉片修剪造成的傷口非常有利于該病菌的侵入，加之該病原菌易分離培養(yǎng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)、溫度、濕度的要求均不嚴(yán)格，適應(yīng)能力強(qiáng)，因此該病害的發(fā)生和流行趨勢(shì)很大。

我國(guó)冬青衛(wèi)矛病害發(fā)生較為普遍，從南到北均有發(fā)生，說(shuō)明我國(guó)南北各地的氣候和立地環(huán)境均適合病害的發(fā)生，高溫多濕是易發(fā)病的主要因素。調(diào)查表明冬青衛(wèi)矛4種主要病害對(duì)冬青衛(wèi)矛的健康生長(zhǎng)均具有很大的威脅，應(yīng)引起高度重視，以降低不必要的經(jīng)濟(jì)損失。目前，本課題組均已獲得這4種主要病害的病原菌，下一步將會(huì)對(duì)這些病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性、致病機(jī)理及病害綜合防治等方面研究，為新型藥劑的篩選、優(yōu)良抗病品種的選育奠定基礎(chǔ)。

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[編輯] 余文斌

2017-04-17

留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目(皖人社秘[2015]229號(hào))；安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2016A435)。

李彥凱(1983-)，男，碩士，助教，主要從事植物病蟲害綜合防治研究。通信作者：宋曉賀，sxhapril@163.com。

S792.11;S432.4

A

1673-1409(2017)10-0005-04

[引著格式]李彥凱，汪禮君，宋曉賀.冬青衛(wèi)矛葉部病害調(diào)查研究[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2017，14(10)：5～8.