宋曉峰，王 寧，李亞莎，金先慶，王 佚，李曉慶，周德凱

(重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院胃腸外科及新生兒外科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預防國際科技合作基地/兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014)

雌二醇對EOMA細胞增殖、ERα、ERβ及VEGF表達的影響*

宋曉峰，王 寧，李亞莎，金先慶，王 佚，李曉慶，周德凱△

(重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院胃腸外科及新生兒外科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預防國際科技合作基地/兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014)

目的 探討17β-雌二醇(E2)對鼠源性血管瘤血管內(nèi)皮細胞(EOMA細胞)生長，雌激素α、β受體亞型(ERα、β)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法 用1、10、100 nmol/L 濃度的E2分別作用于EOMA細胞，同時設對照組(不加E2)。四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測不同時間點其對EOMA細胞生長的影響；Western blot檢測EOMA細胞的ERα、β表達強度；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清液中VEGF的分泌水平。結果 1 nmol/L E2組在36 h時高于對照組(P<0．05)；10 nmol/L E2組、100 nmol/L E2組各個時間點OD值均明顯高于對照組(P<0．05)，36 h時OD值最高(P<0．01)。E2作用下10 nmol/L E2組ERα和ERβ水平及100.0 nmol/L E2組ERα水平較對照組均明顯增高(P<0．05)。24、48 h時，各濃度E2組與對照組的VEGF水平比較均差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)，48 h時100 nmol/L E2組和10 nmol/L E2組VEGF水平均高于1 nmol/L E2組(P<0．05)。結論 E2可促進EOMA細胞增殖，可能主要通過ERα、VEGF表達水平上調來實現(xiàn)。

雌二醇；雌激素受體α；雌激素受體β；內(nèi)皮，血管；血管瘤；鼠源性血管內(nèi)皮瘤內(nèi)皮細胞；血管內(nèi)皮生長因子

血管瘤是嬰幼兒最常見的腫瘤，發(fā)病率高達3%～8%。部分血管瘤可出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥，造成患兒機體功能障礙，嚴重毀損容貌，甚至危及生命。而血管瘤的發(fā)病原因、影響其生長的因素目前仍不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)血管瘤的發(fā)生及生長與雌激素密切相關[1-3]。雌激素通過雌激素受體(ER)發(fā)揮生理效應，ER有α和β兩種亞型，二者在雌激素作用下如何發(fā)揮效應有待進一步研究。本實驗擬通過觀察17β-雌二醇(E2)對血管瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及ERα、ERβ表達的影響，探討雌激素影響血管瘤發(fā)生及增殖調控的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 鼠源性血管內(nèi)皮瘤內(nèi)皮細胞(EOMA細胞)購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)；DMEM/F-12細胞培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Invitrogen公司；兔抗小鼠ERα抗體、兔抗小鼠ERβ抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；羊抗人肌動蛋白(actin)抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體及兔抗羊IgG抗體購自北京中杉生物技術公司；E2購自美國Sigma公司；VEGF抗體包被板購自北京四正柏生物科技有限公司；凱基全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

表1 各組不同時間點OD值比較

a：P<0.05，與正常對照組比較；b：P<0.05，與同組36 h比較；c：P<0.05，與1 nmol/L E2組比較。

1.2 方法

1.2.1 血管瘤血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)和傳代 EOMA細胞接種在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12高糖培養(yǎng)基中，置于5%CO237 ℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測E2對EOMA細胞增殖的影響 EOMA細胞以1×105/mL的濃度接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h在細胞單層鋪滿孔底后加入不同濃度的E2，使其培養(yǎng)液中終濃度分別為1、10、100 nmol/L(分別為1、10、100 nmol/L E2組)，每個濃度設6個復孔，同時設正常對照組(不加E2)和空白對照組(與實驗平行不加細胞，其他條件相同的對照孔，比色時以空白孔調零)。培養(yǎng)12、24、36 h后分別于每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結晶物充分融解。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上選擇490 nm波長，測定細胞各孔光密度值(OD值)。實驗重復3次，取其平均值分析。

1.2.3 Western blot檢測ERα、ERβ蛋白在EOMA細胞中的表達水平 EOMA細胞接種于培養(yǎng)瓶中，在細胞接近鋪滿瓶底后加入不同濃度的E2，使其培養(yǎng)液中終濃度分別為1、10、100 nmol/L(分別為1、10、100 nmol/L E2組)，每個濃度設5個培養(yǎng)瓶，同時設對照組(加入等體積溶劑)。培養(yǎng)24 h后收集EOMA細胞，凱基全蛋白提取試劑盒按步驟提取全蛋白。蛋白樣品按4∶1比例加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液中，沸水浴加熱后電泳。電泳完畢后，將目的蛋白位置的濃縮膠切下，置入電轉緩沖液中；SDS-PAGE 凝膠在電轉緩沖液中浸泡后，將濾紙、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和SDS-PAGE 凝膠安裝好并置入電轉槽中，100 v恒壓轉膜90 min；電轉完畢，取下PVDF膜置入TBS-T中漂洗，根據(jù)Marker剪出所需的蛋白的PVDF膜；將PVDF膜置于封閉液中，常溫下輕微搖動1 h；TBS-T洗PVDF膜；分別加入稀釋一抗，置入4 ℃冰箱孵育過夜(稀釋比例：兔抗小鼠ERα抗體為1∶200，兔抗小鼠ERβ抗體為1∶200，羊抗人β-actin為1∶3 000)；TBS-T洗PVDF膜；分別加入1∶5 000稀釋二抗孵育1 h；TBS-T洗PVDF膜；電化學發(fā)光(ECL)試劑盒進行化學發(fā)光，成像并存儲數(shù)據(jù)；Quantity-One軟件獲得同次電泳所得的目的蛋白和β-actin條帶灰度值數(shù)據(jù)，以各組的目的蛋白/β-actin的灰度比值作為相對表達水平。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清液中VEGF的分泌水平 EOMA細胞以1×105/mL的濃度接種于24孔板，每孔0.5 mL，培養(yǎng)24 h在細胞單層鋪滿孔底后加入不同濃度的E2，使其培養(yǎng)液中終濃度分別為1、10、100 nmol/L(分別為1、10、100 nmol/L E2組)，每個濃度設5個復孔，同時設溶劑對照組(不加E2，加入等體積溶劑)。培養(yǎng)24、48 h后分別收集培養(yǎng)上清液。ELISA法檢測不同培養(yǎng)條件下細胞上清液中VEGF的分泌水平。在450 nm下測OD值，VEGF濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出各組的VEGF濃度。

2 結 果

2.1 MTT法檢測E2對EOMA細胞增殖活性的影響 1 nmol/L E2組在12、24 h和正常對照組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.086、0.154)，在36 h時高于正常對照組(P<0．05)；10、100 nmol/L E2組各個時間點OD值均明顯高于正常對照組(P<0．05)，36 h時OD值最高(P<0．01)。36 h時，1 nmol/L E2組與10 nmol/L E2組、100 nmol/L E2組OD值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，10 nmol/L E2組與100 nmol/L E2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.275)，見表1。

2.2 Western blot檢測E2對EOMA細胞ERα、ERβ蛋白表達水平的影響 E2作用下對照組中ERα蛋白表達強度大于ERβ(P=0.047)。E2作用下ERα 10 nmol/L E2組及100 nmol/L E2組較對照組均明顯增高(P<0．05)，但不同劑量組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)。E2作用下ERβ表達數(shù)值較對照組有上升趨勢，但僅100 nmol/L E2組較對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)，不同劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)，見圖1、表2。

A：β-Actin；B：ERα；C：ERβ。

圖1 Western blot檢測ERα、ERβ蛋白表達

2.3 ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清液中VEGF的分泌水平 與溶劑對照組比較，不同濃度E2均增加EOMA細胞VEGF的分泌水平。24、48 h時，各濃度E2組與溶劑對照組的VEGF水平比較均差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。24 h時各濃度E2組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)；48 h時100 nmol/L E2組和10 nmol/L E2組均高于1 nmol/L E2組(P<0．05)。同組在各個時間點間比差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)，見表3。

表2 Western blot檢測EOMA細胞ERα、ERβ蛋白表達水平

a：P<0.05，與對照組比較。

組別24h48h溶劑對照組129.74±8.28167.00±11.051nmol/LE2組226.12±50.42a233.64±28.75a10nmol/LE2組242.92±40.21a293.60±19.87ab100nmol/LE2組279.26±34.98a313.78±42.92ab

a：P<0.05，與溶劑對照組比較；b：P<0.05，與1 nmol/L E2組比較。

3 討 論

臨床觀察發(fā)現(xiàn)血管瘤瘤體增生與高水平雌激素有著密切聯(lián)系：血管瘤患兒女性明顯多于男性；肝硬化患兒由于肝功能減退，滅活雌激素的能力降低而出現(xiàn)肝掌、蜘蛛痣；裸鼠血管瘤移植模型在適當?shù)耐鈦泶萍に氐母深A下，移植腫瘤增殖穩(wěn)定；課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)血管瘤患兒血清E2水平明顯高于對照組。

雌激素是一種重要的脂溶性類固醇激素，主要由卵巢、睪丸及腎上腺皮質分泌產(chǎn)生，主要包括E2、雌酮(estrone，E1)和雌三醇(estriol，E3),其中濃度最高且生理活性最強的是E2[4]。

經(jīng)典理論認為雌激素通過與其受體結合而發(fā)揮生理作用，其生理作用主要由ERα、β兩種亞型介導，ERα和ERβ由不同的基因編碼，具有不同的cDNA和蛋白質分子結構，在不同組織器官中分布不同及相應mRNA表達差異是對雌激素靶器官和組織的生理、病理產(chǎn)生不同影響的雌激素作用的組織特異性的物質基礎[5]。基因表達圖譜顯示ERα能夠上調與細胞生長相關基因的表達，而ERβ能調節(jié)與信號轉導、細胞周期進展及細胞凋亡相關基因的表達[6]。學者研究發(fā)現(xiàn)E2干預下可影響胃癌細胞株的增殖活力和ERα蛋白質表達水平[7]。E2刺激膜相關的結合位點ER并誘導快速的細胞內(nèi)信號轉導和組織反應，其中ERα轉染的乳腺癌細胞與ERα陰性對照細胞相比細胞增殖增加[8]。研究發(fā)現(xiàn)大鼠子宮同時有ERα、ERβ兩種受體亞型的表達，但ERα mRNA表達水平明顯強于ERβ，E2可明顯上調去勢大鼠子宮ERα的mRNA表達，但對ERβ無明顯作用，推測E2可通過ERα/ERβ比率升高，改變二聚體構成，促進子宮內(nèi)膜的增殖[9]。

ERα、ERβ在血管瘤上皮細胞增殖中的作用機制尚不明確，二者是共同介導了雌激素對血管瘤上皮細胞的增殖作用，還是相互拮抗發(fā)揮生物學效應，需要實驗進一步研究。課題組在前期研究基礎上發(fā)現(xiàn)ERα、ERβ在EOMA細胞胞質均有表達，ERα的表達水平顯著高于ERβ，推測ERα為雌激素作用的經(jīng)典靶組織。本次實驗通過MTT、Western blot、ELISA法檢測E2對EOMA細胞增殖、對ERα、ERβ表達強度及對VEGF的分泌水平的影響。

在MTT法檢測E2對EOMA細胞增殖的影響實驗中觀察到：不同劑量組在各個時間點表現(xiàn)出效應-時間相關性，推測雌激素的促進增殖效應可能與E2作用時間有關。100 nmol/L E2組與10 nmol/L E2組OD值比較差異無統(tǒng)計學意義，推測可能與E2作用下ER飽和有關。1 nmol/L E2組在36 h時與100 nmol/L E2組、10 nmol/L E2組OD值比較差異有統(tǒng)計學意義，表現(xiàn)出在一定濃度范圍內(nèi)的劑量-效應相關性。通過MTT實驗可以看出E2有明顯的促進EOMA細胞增殖的作用，同時表現(xiàn)出時間、劑量-效應相關性。

通過Western blot檢測ERα、ERβ 蛋白在EOMA細胞中的表達水平，實驗結果顯示：E2作用下對照組中ERα蛋白表達強度高于ERβ，和課題組前期通過其他檢查方式得出的結論一致，即ERα的表達顯著高于ERβ。在10、100 nmol/L的E2作用下可上調ERα蛋白的表達水平。僅100 nmol/L劑量的E2可上調ERβ蛋白的表達水平。推測E2主要通過上調ERα的表達發(fā)揮生理效應，這和其他學者的發(fā)現(xiàn)一致。

VEGF是一個高度特異的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂原，對血管內(nèi)皮細胞有強烈的促分裂和趨化作用，能特異性地刺激內(nèi)皮細胞增殖，還具有促血管通透性作用。學者研究發(fā)現(xiàn)血管瘤細胞中ER的陽性表達與VEGF陽性表達呈正相關，雌激素和VEGF同時存在時，對血管瘤血管內(nèi)皮細胞的促增殖作用更加顯著，二者存在協(xié)同作用[10-12]。Hyder等[13]進一步研究發(fā)現(xiàn)：VEGF基因上有2個核苷酸序列與ER基因中的雌激素反應元件高度同源，分別位于VEGF基因的5和3非翻譯區(qū)，這2個序列可與ER特異性地結合，雌激素與ER結合可影響VEGF的表達。

課題組通過ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清液中VEGF的分泌水平，實驗結果顯示：3個濃度的E2均增加EOMA細胞VEGF的分泌水平，與對照組比較均有顯著差別，24 h時不同劑量組間比較差異無統(tǒng)計學意義，48 h時1 nmol/L E2組分別與10 nmol/L E2組、100 nmol/L E2組比較差異有統(tǒng)計學意義，提示存在劑量-時間-效應相關性。但同一劑量組在兩個時間點間比較沒有顯著差異。

本次研究結果顯示E2能增加EOMA細胞VEGF的分泌，并協(xié)同VEGF促進EOMA細胞的增殖水平；E2上調ERα、ERβ的表達，其效應以上調ERα更為顯著，推測E2主要通過ERα信號通路調節(jié)血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖。本次研究進一步證實了血管瘤生長的雌激素依賴性，為血管瘤發(fā)生及增殖機制的研究提供新的實驗依據(jù)。同時由于當前臨床對于血管瘤的治療往往是經(jīng)驗性的，缺乏充分的理論基礎及實驗依據(jù)，而深入的對雌激素及其受體的研究有助于為血管瘤的基因或內(nèi)分泌治療提供新的靶點，為診斷及指導治療提供新的思路。

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Effect of E2on the expression of estrogen receptor α，β and VEGF and the proliferation of EOMA cells*

SongXiaofeng,WangNing,LiYasha,JinXianqing,WangYi,LiXiaoqing,ZhouDekai△

(DepartmentofGastrointestinalandNeonatalSurgery,theChildren′sHospital,ChongqingMedicalUniversity/MinistryofEducationKeyLaboratoryofChildDevelopmentandDisorders/ChongqingInternationalScienceandTechnologyCooperationCenterforChildDevelopmentandDisorders/KeyLaboratoryofPediatricsinChongqing，Chongqing400014,China)

Objective To explore the effect of 17β-estradiol (E2) on proliferation of murine endothelial (EOMA) cells and the expression of estrogen receptor(ERα and ERβ) and vascular endothelial growth factor (VEGF).Methods Different concentrations of E2(1,10,100 nmol/L) were used in EOMA cells.At the same time,We set the control group (without E2).MTT assay was used to detect the effect of EOMA on the growth of EOMA cells at different time points.Western blot was used to detect the expression of ERα and β in EOMA cells;and the secretion level of VEGF in supernatant was detected by ELISA．Results TheODvalue of E2group(10 nmol/L) was significantly higher than that of control group at 36 h(P<0.05).TheODvalues of E2group(10 nmol/L and 100 nmol/L)were significantly higher than that of control group(P<0.05) at each time,and theODvalue was the highest at 36 h(P<0.01).The expression of ERα and ERP in EOMA cells cultured with E2(10 nmol/L) and the expression of ERα in EOMA cells cultured with(100 nmol/L) were significantly higher than those in the control group(P<0.05).At 24,48 h,the expression of VEGF of each E2group was higher than that of the control group;and at 48 h,the VEGF levels in the E2group(10 nmol/L and 100 nmol/L)were significantly higher than E2group(1 nmol/L)(P<0.05)．Conclusion E2could promote the proliferation of EOMA cells,mainly through the expression of ERα,VEGF to achieve.

estradiol;estrogen receptor alpha;estrogen receptor beta；endothelium,vascular；hemangioma；murine endothelial cells；vascular endothelial growth factor

·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.003

國家臨床重點?？平ㄔO項目(國衛(wèi)辦醫(yī)函[2013]544)；重慶市自然科學基金資助項目(cstc2011jjA10087)；重慶市衛(wèi)生局基金資助項目(2011-2-252)；重慶市教委科學技術研究資助項目(KJ120308)。 作者簡介：宋曉峰(1970-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事血管瘤發(fā)病機制及治療方面研究?！?/p>

，E-mail:732587579@qq.com。

R726.5

A

1671-8348(2017)14-1878-03

2016-11-24

2017-01-12)