劉磊磊， 趙 帥， 王 歡， 彭 勝2， 郭 婕2

(1.吉首大學 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室, 湖南 張家界 427000；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖南 張家界 427000)

響應面法優(yōu)化超聲波輔助乙醇/鹽雙水相萃取梔子中京尼平苷

LIU Leilei

劉磊磊1,， 趙 帥1， 王 歡1， 彭 勝1,2， 郭 婕1,2

(1.吉首大學 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室, 湖南 張家界 427000；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖南 張家界 427000)

采用超聲波輔助乙醇/鹽雙水相萃取技術對梔子中京尼平苷的提取分離效果進行了系統(tǒng)研究，在單因素試驗基礎上，采用響應曲面試驗設計進行優(yōu)化，進一步比較了該方法與超聲波溶劑提取法、熱回流提取法等傳統(tǒng)方法對京尼平苷的提取效果。結(jié)果表明：超聲波輔助乙醇/鹽雙水相萃取的最佳工藝條件為構(gòu)建10.0 g乙醇/NaH2PO4雙水相體系，其中加入無水乙醇4 mL(即體系中乙醇質(zhì)量分數(shù)為31.56%)，NaH2PO4質(zhì)量分數(shù)為15.00%，超聲波溫度為30 ℃，超聲波時間為30 min，梔子干粉加入量為0.03 g，上相中京尼平苷的得率為51.77 mg/g。該方法提取時間短、提取溫度較低，而且得率較高，對梔子中京尼平苷的提取效果明顯優(yōu)于超聲波溶劑提取法和熱回流提取法等傳統(tǒng)方法。

雙水相體系；超聲波輔助；梔子；京尼平苷

茜草科植物梔子的果實是我國一味傳統(tǒng)中藥，是衛(wèi)生部公布的第1批藥食兩用資源，具有護肝、利膽、降壓、鎮(zhèn)靜、止血、消腫等作用，中醫(yī)臨床上常用于治療黃疸型肝炎、扭挫傷、高血壓、糖尿病等[1-3]。京尼平苷(GP)屬于環(huán)烯醚萜類結(jié)構(gòu)，是梔子的主要藥效成分，隨產(chǎn)地和采摘時間不同含GP為3%～8%，GP對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)疾病有顯著療效，具有抗癌、抗炎和治療軟組織損傷的作用[4-8]。GP的傳統(tǒng)提取分離方法，一般從梔子干果或梔子黃色素廢液中提取，選用甲醇、乙醇、水等極性溶劑作為提取溶劑，采用冷浸、滲漏、熱回流等方法提取，活性炭脫色，乙酸乙酯脫脂，再用柱層析進一步分離純化，洗脫液用丙酮重結(jié)晶可得京尼平苷單體，一般100 g梔子可得到2.0 g GP單體[9]。由此可見，傳統(tǒng)分離方法步驟繁多、繁瑣耗時，產(chǎn)率偏低，成本較高，同時存在溶劑殘留問題。雙水相萃取技術(ATPS)作為一種新型液/液萃取分離技術，具有易于放大、可連續(xù)化操作、易集成技術、綠色環(huán)保等優(yōu)點[10]。自從1956年Albertsson[11]首次采用聚合物/聚合物ATPS技術實現(xiàn)葉綠素的分離以來，ATPS技術在黃酮、生物堿、萜類及多酚等天然產(chǎn)物的分離純化中有著廣泛的應用[12-13]。近年來，ATPS技術被報道用于GP的提取分離。Pan等[14]采用ATPS技術從500 g梔子中得到純度為77%的GP產(chǎn)品39 g，同時發(fā)現(xiàn)增加鹽濃度和減少PE62濃度均能增加GP在鹽相的分配系數(shù)。ATPS組成一般有2種聚合物、聚合物和鹽、離子液體和鹽、小分子親水有機溶劑和鹽等體系。特別是親水有機溶劑/鹽ATPS體系，具有溶劑容易回收、成本低廉、易于放大等優(yōu)點，在天然活性成分分離中具有獨特的優(yōu)勢，與超聲波及微波技術聯(lián)用后，利用超聲波與微波的空化作用、機械作用和熱效應原理，實現(xiàn)提取分離同步完成，簡化傳統(tǒng)工藝，能有效提高提取效率，在中藥活性成分的分離中應用較多，比如，降香中鷹嘴豆芽素A[15]、丹參中紫草酸B[16]、金銀花中黃酮和糖[17]、木豆根中染料木素和芹菜素[18]。本研究構(gòu)建多種親水性有機溶劑/鹽ATPS體系，輔助超聲波提取技術提取分離梔子中GP，采用單因素試驗和響應曲面優(yōu)化提取分離工藝，并與超聲波溶劑提取法、熱回流提取法進行了對比，旨在尋找適合梔子中京尼平苷提取分離的時間短、能耗低、得率高的有效方法。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

梔子購于安徽省亳州市貢藥飲片廠(批號：140624)，粉碎，80 ℃烘干后放置在干燥器內(nèi)，避光常溫保存，備用(京尼平苷為5.8%)；京尼平苷對照品(批號：141115，HPLC測得純度≥98%)，上海如吉生物科技有限公司；無水乙醇、正丙醇、異丙醇和無機鹽均為分析純；甲醇，HPLC色譜純試劑，購于天津康科德科技有限公司；水為去離子水。

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；SB-25-12DT型超聲波清洗儀，寧波新藝生物科技股份有限公司；TDL- 40B型離心機，上海安亭科學儀器廠；AL204型萬分之一天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

圖1 雙水相相圖Fig.1 The phase diagrams of aqueous two-phase at room temperature

1.2 雙水相相圖的繪制

為了確定小分子醇和2種無機鹽水溶液的分相范圍，采用濁點法[19]繪制了正丙醇、異丙醇、乙醇 3種小分子醇與NaH2PO4和(NH4)2SO4兩種無機鹽所組成的雙水相相圖，結(jié)果見圖1。如圖1所示，圖中描繪的曲線為雙節(jié)線，在曲線上方區(qū)域內(nèi)為分相區(qū)域，在曲線下方為均相區(qū)域。在分相區(qū)域內(nèi)，上相為富集小分子醇相，下相為富集無機鹽相，由此確定分相時醇及鹽的質(zhì)量分數(shù)。實驗過程中，先配置一定濃度無機鹽水溶液，通過滴定管逐滴滴加小分子醇，逐漸增加小分子醇的用量來改變濁點位置，從而繪制雙節(jié)線。當小分子醇加入過多時，由于鹽析作用導致無機鹽結(jié)晶析出，影響雙水相體系組成的確定。

1.3 超聲波輔助雙水相萃取梔子中京尼平苷

在15 mL具塞PP離心管中精確加入一定質(zhì)量的無機鹽和去離子水，充分溶解后，加入一定質(zhì)量的無水乙醇，使得雙水相體系總質(zhì)量為10.0 g。稱取一定質(zhì)量的梔子干粉加入到該雙水相體系中，在超聲波作用(功率為240 W)下于一定溫度下提取一定時間；然后進行離心處理(4 000 r/min，15 min)，以加快雙水相體系分相速率，離心后上下兩相間界面清晰(GP主要富集于上相中)，梔子殘渣全部富集在上下兩相之間。將上下相溶液全部移出置于有刻度的10 mL玻璃試管內(nèi)，分別記錄上、下相體積。上、下相溶液過0.45 μm有機濾膜，并進行HPLC檢測。通過式(1)～(3)計算分配系數(shù)(K)、相比(R)和得率(Y)。

K=Ct/Cb

(1)

R=Vt/Vb

(2)

Y=CtVt/(1 000md)

(3)

式中：Ct、Cb—上、下兩相中GP的質(zhì)量濃度，mg/L；Vt、Vb—上、下兩相溶液的體積，mL；md—梔子加入量，g。

1.4 GP的HPLC檢測

GP色譜條件：液相色譜柱為Agilent TC C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相為甲醇- 0.1%磷酸水溶液，體積比35∶65；檢測波長238 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。

精密稱取一定量的GP對照品于5 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容，得到1 046 mg/L的 GP對照品儲備液，4 ℃保存，備用。采用逐級稀釋法將對照品儲備液稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為 2.1、10.7、26.8、66.9、167.4、418.4和1 046 mg/L GP的對照品溶液。按上述色譜條件進行HPLC檢測，以對照品質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)，繪制對照品標準曲線，進行線性回歸分析，確定回歸方程為：Y=30 188X+71 261(R2=0.999 9，n=8)，線性范圍為2.1～1 046 mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對超聲波輔助雙水相萃取效果的影響

2.1.1 雙水相體系 在前期研究中，考察了乙醇與NaH2PO4、(NH4)2SO4、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4和NaCl共6種無機鹽的分相情況[20]，結(jié)果顯示：NaCl溶液和乙醇不能形成雙水相體系，KH2PO4在水中溶解度偏小，其他4種無機鹽可以和乙醇形成穩(wěn)定的雙水相體系。由于K3PO4和K2HPO4的水溶液顯弱堿性，而GP分子對堿性溶液敏感，所以重點考察了(NH4)2SO4和NaH2PO4兩種無機鹽的分相能力。文獻報道[21]，正丙醇、異丙醇和乙醇3種小分子醇的分相能力為：正丙醇>異丙醇>乙醇，與圖1結(jié)果一致。因此，選用(NH4)2SO4和NaH2PO4作為分相無機鹽，正丙醇、異丙醇和乙醇作為分相有機溶劑，構(gòu)建雙水相體系，分別對梔子中GP進行提取分離，由醇、無機鹽和水構(gòu)建10.0 g雙水相體系，加入0.1 g梔子干粉，超聲波輔助萃取溫度30 ℃，超聲波作用時間30 min，結(jié)果見表1。由表1可知，乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/NaH2PO4對梔子中GP具有較好的分離效果，但是(NH4)2SO4在構(gòu)建的雙水相體系中很容易結(jié)晶析出，而且乙醇/NaH2PO4所組成的雙水相體系可以得到較高的得率、分配系數(shù)和相比，所以選用乙醇/NaH2PO4為最佳ATPS體系。

2.1.2 NaH2PO4質(zhì)量分數(shù) 為了優(yōu)化NaH2PO4的質(zhì)量分數(shù)，分別稱取1.50～2.70 g(即質(zhì)量分數(shù)15%～27%)的NaH2PO4與質(zhì)量分數(shù)30%乙醇構(gòu)建10.0 g雙水相體系，加入0.1 g梔子干粉，溫度30℃,超聲波時間30 min,結(jié)果見表1。由表1可知，隨著NaH2PO4質(zhì)量分數(shù)的增加，GP的得率先由47.68 mg/g增加到48.14 mg/g，后又下降至39.06 mg/g。由此可以推斷，隨著NaH2PO4質(zhì)量分數(shù)的增加，GP分子與無機鹽之間的靜電作用增大，導致GP易富集到上相；同時相比變小，乙醇相體積減小，導致上相中GP得率先升高后下降。所以選擇NaH2PO4的質(zhì)量分數(shù)為18%。

表1 不同醇/無機鹽雙水相體系對梔子中GP提取分離效果的影響

2.1.3 乙醇質(zhì)量分數(shù) 由圖1可知，當乙醇質(zhì)量分數(shù)低于20%時，需要較高質(zhì)量分數(shù)的NaH2PO4水溶液才能形成雙水相體系，而當乙醇質(zhì)量分數(shù)大于36%時，雙水相體系中有NaH2PO4析出。為了優(yōu)化乙醇的質(zhì)量分數(shù)，向含有1.80 g(18%)NaH2PO4的雙水相體系中，加入2.40～3.20 g(24%～32%)乙醇和 0.1 g梔子干粉，溫度30 ℃，超聲波提取30 min，結(jié)果見圖2(a)。由圖2(a)可知，當乙醇質(zhì)量分數(shù)由24%增加到32%時，分配系數(shù)和相比呈現(xiàn)明顯增大趨勢，而GP的得率在乙醇質(zhì)量分數(shù)為30%時達到最大。由此可知，乙醇質(zhì)量分數(shù)是影響GP提取分離的重要影響因素。所以選用18%NaH2PO4/30%乙醇雙水相體系進行后續(xù)研究。

2.1.4 提取溫度 在由18%NaH2PO4與30%乙醇組成的雙水相體系中，加入0.1 g梔子干粉，設定超聲波作用時溫度在20 ℃到60 ℃之間，提取30 min，實驗結(jié)果見圖2(b)。由圖2(b)可知，溫度由20 ℃上升到30 ℃時，GP的得率明顯增加；溫度在30 ℃到50 ℃變化時，GP的得率變化不明顯，當溫度達到60 ℃時，GP的得率明顯下降。原因可能是升高溫度可以增強超聲波傳質(zhì)作用，增大GP的得率；而溫度過高時，梔子中更多雜質(zhì)溶出，抑制了GP的溶出，導致GP的得率減小?；诘湍芎囊螅x用30 ℃作為超聲波提取溫度。

2.1.5 提取時間 在確定雙水相體系組成為18%NaH2PO4和30%乙醇，加入0.1 g 梔子干粉，提取溫度為30 ℃條件下，選擇提取時間為20～60 min，考察時間對GP得率的影響，結(jié)果見圖2(c)。由圖2(c)可知，在提取時間為30 min時，分配系數(shù)、相比和得率均達到最大值；提取時間超過30 min后，分配系數(shù)、相比和得率均逐漸下降。原因可能是延長提取時間，可以將GP更充分溶出，萃取更加徹底；但是過長的提取時間導致更多的雜質(zhì)溶出，影響雙水相萃取的選擇性分配，使GP得率下降。所以提取時間選用30 min。

2.1.6 梔子干粉加入量 在上述優(yōu)化實驗條件下，梔子干粉加入量選擇為0.03～0.50 g，實驗結(jié)果見圖2(d)。由圖2(d)可知，梔子干粉加入量對相比影響不大；梔子干粉加入量在0.03～0.40 g范圍內(nèi)，分配系數(shù)逐漸降低，當梔子干粉加入量為0.50 g時，分配系數(shù)略有升高；隨著梔子干粉加入量的增加，GP得率則是先增加到50.18 mg/g，后下降至41.02 mg/g。這可能是由于梔子干粉加入量為0.05 g時，GP在上相中溶解達到飽和，增加梔子干粉加入量，上相中GP的量仍然保持不變，所以導致GP得率先增加后下降[22]。此外，隨著梔子干粉加入量的增加，體系中GP分子和雜質(zhì)也都增加，減弱了雙水相體系的分離效果，導致GP得率下降。所以梔子干粉加入量選用0.05 g。

圖2 不同條件對分配系數(shù)、相比和得率的影響

2.2 響應曲面法優(yōu)化實驗結(jié)果與分析

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，在超聲波提取溫度30 ℃和提取時間30 min條件下，選擇NaH2PO4質(zhì)量分數(shù)(X1)、乙醇質(zhì)量分數(shù)(X2)和梔子干粉加入量(X3)為自變量，GP得率(Y)為應變量，采用Desgin-Expert 8.05b軟件進行3因素3水平響應曲面回歸分析，響應曲面分析試驗因素設計及試驗結(jié)果見表2。

表2 響應曲面試驗設計與結(jié)果

對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析

響應曲面圖可以用來解釋變量之間的相互作用以及用來測定在最大響應條件下每個變量的最佳水平。依據(jù)二次多元回歸方程，固定其中某一個因素，可以作出另外2個因素的響應曲面圖，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在所選范圍內(nèi)存在極值點，即響應面最高點，其中圖3(a)中曲線坡度較陡，表明NaH2PO4和乙醇質(zhì)量分數(shù)交互作用明顯，而圖3(b)和3(c)中圖曲面平緩，表明梔子干粉加入量和NaH2PO4以及梔子干粉加入量和乙醇質(zhì)量分數(shù)之間的交互作用較小，這與方差分析結(jié)果一致。由Design-Expert軟件對模型方程進行GP得率的最大化分析，得到GP的最大響應值(Y)時，因素X1、X2、X3對應的值分別為15.00%、31.19%、0.03 g，GP得率最大預測值為52.28 mg/g。

圖3 響應曲面圖

2.3 驗證試驗

為檢測響應曲面法所得結(jié)果的可靠性，進行驗證實驗。考慮到實驗的可操作性，加入無水乙醇 4 mL(即體系中乙醇質(zhì)量分數(shù)為31.56%)，NaH2PO4質(zhì)量分數(shù)15.00%，梔子干粉加入量0.03 g，超聲波溫度為30 ℃，提取時間為30 min，進行6次平行實驗，GP得率分別為51.94、51.83、52.14、51.56、51.59和51.54 mg/g，平均值為51.77 mg/g，RSD為0.24%，接近模型最佳預測值52.28 mg/g，由此可知該模型可靠。

2.4 與傳統(tǒng)提取方法對比

對比實驗中選擇《中華人民共和國藥典》2015版一部中梔子中GP的提取方法和經(jīng)典的熱回流提取作為參考。《中華人民共和國藥典》中提取方法：稱取梔子干粉1.00 g，加50%甲醇水溶液10 mL，超聲波處理40 min，過濾，定容至25 mL，濾液進行HPLC定量檢測；熱回流提取法：稱取梔子干粉1.00 g，加20 mL去離子水，溫度設定為100 ℃，回流時間為1 h，回流次數(shù)為2次，過濾，定容至100 mL，濾液進行HPLC定量檢測。3種提取方法的比較結(jié)果如表4所示。由表4可知，熱回流提取法提取效果最好，超聲波輔助乙醇/鹽雙水相萃取(UAATPE)法次之，《藥典》提取法最差。進一步對比3種提取方法的提取時間和提取溫度可知，UAATPE法所用提取時間最短、提取溫度較低，而且得率與熱回流提取法相差不大。由此可知，UAATPE法提取梔子中GP具有提取效果良好、提取時間短、能耗低等優(yōu)點。

3 結(jié) 論

3.1 采用超聲波輔助乙醇/鹽雙水相萃取(UAATPE)梔子中京尼平苷(GP)，在單因素試驗基礎上進行響應面試驗設計篩選出最優(yōu)的雙水相體系及最佳工藝條件為：在10.0 g乙醇/NaH2PO4雙水相體系中，加入無水乙醇4 mL(即體系中乙醇質(zhì)量分數(shù)為31.56%)、NaH2PO4質(zhì)量分數(shù)15.00%、超聲波溫度 30 ℃、時間30 min、梔子干粉加入量0.03 g，上相中GP的得率高達51.77 mg/g。

3.2 該UAATPE技術對梔子干粉中GP的提取涉及液-固萃取和液-液萃取2個過程，在液-固分離中，超聲波作用加快了提取速度；在液-液萃取中，利用雙水相萃取技術的選擇性分配原理將GP主要富集在上相中，而雜質(zhì)和全部不溶物被保留在水相或兩相界面間，從而實現(xiàn)梔子中GP的提取和分離同步完成。與《中華人民共和國藥典》中超聲波溶劑提取法及熱回流提取法等傳統(tǒng)方法相比，UAATPE技術提取時間最短、提取溫度較低，而且得率也較高，作為一種多功能萃取方法，具有提取時間短、能耗低等優(yōu)點，提取分離效果優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

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Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Geniposide from Gardenia Fruits by Using Ethanol/Salt Aqueous Two-phase System with Response Surface Method

LIU Leilei1,2, ZHAO Shuai1, WANG Huan1, PENG Sheng1,2, GUO Jie1,2

(1.Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China;2.Hunan Co-innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Zhangjiajie 427000, China)

An ultrasonic-assisted technology combined with ethanol/NaH2PO4aqueous two-phase system (UAATPE) was developed for the extraction and purification of geniposide (GP) from gardenia fruits. Based on the results of single factor experiments, the Box-Behnken Design combined with response surface methodology was applied to optimize the operating parameters. Furthermore, the comparisons with ultrasonic solvent extraction, heat reflux extraction, and ultrasonic-assisted aqueous two-phase extraction were also assessed. GP was mainly extracted into the top ethanol-rich phase. And the optimal experimental conditions were 10.0 g ethanol/salt aqueous two-phase system,NaH2PO4mass fraction 15.00%, ethanol 4 mL(ethanol mass fraction 31.56%), extraction temperature 30 ℃, extraction time 30 min and sample loading 0.03 g. And the maximum yield of GP in top phase was 51.77 mg/g. The comparison results indicated that ultrasonic-assisted aqueous two-phase extraction was more efficient and environmentally friendly than ultrasonic solvent extraction and heat reflux extraction, for the technique had the shorter extraction time, the lower extraction temperature and the higher extraction efficiency.

aqueous two-phase systems; ultrasonic assisted; gardenia fruits; geniposide

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.02.012

2016- 06-27

國家自然科學基金資助項目(31560105);湖南省自然科學基金資助項目(14JJ6037)

劉磊磊(1984— )，男，河南汝州人，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學與分離新方法研究；E-mail:liull126@126.com。

TQ35

A

0253-2417(2017)02- 0093- 08

劉磊磊，趙帥，王歡，等.響應面法優(yōu)化超聲波輔助乙醇/鹽雙水相萃取梔子中京尼平苷[J].林產(chǎn)化學與工業(yè)，2017，37(2)：93-100.