陳杰偉，劉 君，盧佳斌，陳克明，朱明書，楊遠忠，蔡木炎，肖永波

Leica、Dako和Roche的免疫組化自動化染色平臺應(yīng)用體會

陳杰偉，劉 君，盧佳斌，陳克明，朱明書，楊遠忠，蔡木炎，肖永波

免疫組織化學(xué)；自動化；質(zhì)量控制；標準化

從1988年第一臺code-on自動免疫組化儀的誕生，歷經(jīng)30年的不斷改革創(chuàng)新，免疫組織化學(xué)自動化技術(shù)已取得很大的進展，免疫組化染色結(jié)果的一致性、重復(fù)性和可靠性得到很大改善，有效地推進了免疫組化的質(zhì)量控制和標準化進程[1]。但免疫組化自動化染色系統(tǒng)只是高度模擬手工免疫組化操作的所有步驟，在實際應(yīng)用過程中總會出現(xiàn)諸多問題，本文現(xiàn)觀察Leica Bond、Dako AS Link 48和Roche Ventana XT/Ultra三類免疫組化自動化染色平臺在臨床標準化建設(shè)中的應(yīng)用，旨在為臨床病理實驗室選擇和應(yīng)用自動免疫組化儀器推進實驗室標準化平臺建設(shè)提供必要的參考。

1 材料與方法

1.1 標本 選擇中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科在2015年3月～2016年3月期間需行免疫組化染色鑒別診斷和靶向治療的相關(guān)病例(常見的實體腫瘤如乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、腸癌、肝癌等)所用的抗體作為觀察對象，材料包括本院手術(shù)、活檢標本切片和外院會診蠟塊切片及會診白片。不同抗體在三類免疫組化自動化染色平臺上確定一抗最佳反應(yīng)濃度(信噪比)所需要的陽性及陰性切片均來源于病理診斷明確并由病理醫(yī)師一致認為表達較為特異的經(jīng)規(guī)范固定的組織。

1.2 試劑 北京中杉金橋濃縮型一抗，Leica濃縮型一抗，基因濃縮型一抗，英碩力濃縮型一抗，邁新濃縮型一抗，Dako濃縮型一抗和Roche即用型一抗，Leica稀釋液，二抗檢測系統(tǒng)均為三家公司的配套封閉試劑。

1.3 儀器 Leica Bond System、PT Link、Dako AS Link 48、Roche Ventana XT/Ultra。

1.4 方法 針對不同抗體(根據(jù)廠家提供的建議濃度、修復(fù)條件、陽性對照組織等信息)找相應(yīng)的陽性對照組織進行連續(xù)切片，經(jīng)過65 ℃烤片1 h后按三類免疫組化自動化染色平臺的SOP操作。同一抗體在三類免疫組化自動化染色平臺上的測試結(jié)果由病理醫(yī)師和病理技術(shù)質(zhì)控員共同評估、調(diào)整及優(yōu)化。研究期間堅持每天鏡檢，質(zhì)控被列為研究目標的197個常規(guī)診斷抗體在三類免疫組化自動化染色平臺的染色情況，并做好質(zhì)量控制記錄。

2 結(jié)果

2.1 一致性高，有效互補 應(yīng)用三類免疫組化自動化染色平臺的標準化流程進行日常抗體染色，大部分抗體稀釋度差異明顯(表1)；均能達到滿意的染色效果，一致性較高(圖1)；少部分抗體如VEGF等在部分機器上染色效果欠佳，具有機器選擇性。經(jīng)過長時間篩選優(yōu)質(zhì)的一抗和不斷優(yōu)化染色方案，目前常規(guī)診斷抗體的上機率達97.0%(191/197)，Leica、Dako、Roche三類免疫組化自動化染色平臺的抗體測試通過率分別為74.6%(147/197)、73.6%(145/197)、73.1%(144/197)。

圖1 CD30在三類免疫組化自動化染色平臺上經(jīng)過合格測評后染色定位準確，強度合適，背景干凈，與手工一致性較高

表1 同一抗體在三類免疫組化自動化染色平臺獲得滿意的染色效果一抗稀釋度各異

-.抗體在機器上染色效果不佳，不通過評估；☆信噪比：信號強度與背景的噪值之比；Roche Ventana XT/Ultra大部分抗體基本可以共用同一濃度；限于篇幅，僅列舉15個抗體

2.2 有效降低掉片率 部分外院會診白片存在玻片黏附質(zhì)量差，組織固定處理不佳及切片過厚等質(zhì)量問題。為減少掉片率，實驗偏向在Leica Bond上檢測，Roche Ventana XT/Ultra檢測掉片率偏高，這主要與機器洗片方式和要求高質(zhì)量的親水性玻片密切相關(guān)。

2.3 有效避免白片 外院會診白片的玻片多為非親水性，質(zhì)量參差不一，檢測前建議利用脫脂牛奶浸泡白片30 min，改善玻片親水性，避免產(chǎn)生假陰性，但效果有待進一步觀察總結(jié)；對于這類非親水性玻片可以優(yōu)先選擇在Leica Bond上檢測，有效避免白片的出現(xiàn)。

3 討論

病理技術(shù)標準化日益成為國際和國內(nèi)病理學(xué)的發(fā)展趨勢，隨著病理實驗室對免疫組化染色效率和可靠性的要求越來越高，免疫組化自動化染色將會成為未來病理實驗室的發(fā)展趨勢[1]，下面對免疫組化自動化染色平臺標準化建設(shè)應(yīng)用國際國內(nèi)主流的三家公司的系統(tǒng)情況，結(jié)合試劑和陽性對照進行深入探討。

Leica Bond System最大特點是開發(fā)Covertiles專利技術(shù)，創(chuàng)造“濕盒”微環(huán)境，試劑側(cè)面滴加，最大限度減少對組織的傷害，試劑使用量最小，同時掉片率也最低，這是我科在進行外院會診白片檢測時優(yōu)先選擇Leica Bond的原因。Leica Bond檢測系統(tǒng)采用緊密聚合物技術(shù)，定位準確，敏感度高，有效提高一抗稀釋度。

Dako AS Link 48(半自動)系統(tǒng)最接近手工操作，最大特點是抗原修復(fù)液可以做到脫蠟、水化、修復(fù)三合一。其開發(fā)的EnVision FLEX+二抗檢測系統(tǒng)，可以做到精確的抗原定位，適度的信號強度，高敏感性，干凈、清晰的染色背景；正因為其優(yōu)越的染色效果，這也是科研抗體手工操作首選的檢測放大系統(tǒng)。但目前Dako AS Link 48半自動系統(tǒng)蘇木精背景染色需要手工進行，自動化程度不及Leica Bond和Roche Ventana XT/Ultra。

Roche Ventana XT/Ultra獨有的液體封蓋膜技術(shù)，防止試劑揮發(fā)，同時采用空氣渦流技術(shù)保證均一地分布試劑，避免“邊緣效應(yīng)”及階梯效應(yīng)”；采用噴射式清洗技術(shù)做到均勻而徹底地清洗，降低背景染色，這個技術(shù)也正是造成染色外院會診白片掉片率偏高的主要原因；在實際運用Roche的這兩個系統(tǒng)進行免疫組化染色時，完成后需要用洗潔精洗片去除油膜。

三類免疫組化自動化染色系統(tǒng)相同的是均開放了一抗，采用系統(tǒng)匹配封閉的二抗檢測系統(tǒng)，這是導(dǎo)致每個染色系統(tǒng)一抗稀釋度不一致的主要因素，當(dāng)然，抗原修復(fù)效率差異也是因素之一。三家公司在檢測系統(tǒng)上都不同程度地配有增強劑，如半抗原、Linker等，所以實際上在測試抗體增加增強劑這一步驟時需注意假陽性的發(fā)生。

應(yīng)用自動化檢測平臺效果和效率如何，其中一抗的質(zhì)量起了很大的影響，在選購不同公司的一抗時首先需要考慮到抗體的效價、染色質(zhì)量、試劑的認證要求等因素，其次送貨效率，售后服務(wù)也是一個不得不考慮的問題，在實際工作中，因為片量比較大，基本在800～1 100張之間，臨床診斷抗體種類繁多，達197種，大部分采購濃縮型一抗，抗體效價有保證，利于染色穩(wěn)定性的控制；在一些與患者靶向用藥方面的抗體主要采購與機器相匹配的RTU抗體，如HER-2、D5F3、C-Met等，高品質(zhì)的RTU是未來發(fā)展的趨勢。技術(shù)質(zhì)量控制要求監(jiān)測所有的試劑需在合適的貯存條件下及有效期內(nèi)，而且需要進行有效的驗證才能用于臨床檢測[2]。所以有必要定期對抗體，尤其是平時用量較少的抗體進行陽性對照和陰性對照試驗，排除抗體失效可能[3]；測試中發(fā)現(xiàn)抗體在不同儀器染色結(jié)果稍有差異，但通過調(diào)整儀器染色程序中抗原修復(fù)液pH值、修復(fù)溫度、一抗孵育時間和溫度，是否需要添加Linker等，條件優(yōu)化后大部分抗體在不同系統(tǒng)染色結(jié)果能達到一致性和可重現(xiàn)性良好，但仍然有部分抗體只能選擇用其中的一兩類平臺才能通過測試，經(jīng)過長時間篩選優(yōu)質(zhì)的一抗和不斷優(yōu)化染色方案，三類免疫組化自動化染色平臺抗體測試通過率基本在74%左右；三類染色平臺具有一定的互補性，目前常規(guī)診斷抗體的上機率可達97.0%(191/197)；這三類平臺基本上可以互補地解決臨床病理實驗室免疫組化標準化染色過程中遇到的各種問題，可以有效地提高免疫組化染色的質(zhì)量控制水平和加快臨床病理實驗室規(guī)范化及標準化建設(shè)。

在應(yīng)用免疫組化自動化染色平臺的前提是，實驗室需要建立適當(dāng)?shù)年栃詫φ阵w系，這是免疫組化染色規(guī)范化和標準化的關(guān)鍵因素[4]，也是免疫組化自動化染色平臺高效運行的必備條件。而實驗室操作人員需要和工程師一起嚴格做好自動化檢測儀器的日常維護，即是免疫組化自動化平臺高效運行必需條件。

在免疫組化高度自動化的實驗室，病理技術(shù)員不應(yīng)滿足于只會簡單的機器操作，更應(yīng)該不斷提高專業(yè)知識，定期參與熟練能力水平測試[1]，為機器設(shè)定最佳染色程序，確保對整個染色流程及機器嚴格精確把控，為臨床診斷提供高質(zhì)量的免疫組化染色片，同時，實驗室應(yīng)定期參與室間質(zhì)控，這也是促使免疫組化染色標準化和規(guī)范化的有效途徑。

綜上所述，免疫組化自動化染色系統(tǒng)對組化實驗室構(gòu)建染色流程規(guī)范化和標準化的過程起了至關(guān)重要的作用，建立自動化、標準化免疫組化染色平臺需要病理技術(shù)人員提高專業(yè)知識，從檢測系統(tǒng)和試劑選購與驗證，陽性對照設(shè)置與應(yīng)用，室間質(zhì)控參與等方面做好把關(guān)。

[1] 石善溶, 顧 江, 吳秉銓. 抗原修復(fù)技術(shù)-免疫組織化學(xué)發(fā)展史上的里程碑[M]. 北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2014:315.

[2] Bancroft J D, Gamble M. 組織學(xué)技術(shù)的理論與實踐[M]. 6版. 周小鴿, 劉 勇, 主譯. 北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2010:409-423.

[3] 周建云, 何 松, 劉玉山, 等. 全自動免疫組化染色儀染色失敗的常見原因及改進措施[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2013,29(3):345-346.

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2015中大青年項目(520101210104)

中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科，廣州 510060

陳杰偉，男，碩士，主管技師。E-mail: chenjiew@sysucc.org.cn 肖永波，男，主管技師，通訊作者。E-mail: xiaoyb@sysucc.org.cn

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.031.html

R 446

B

1001-7399(2017)04-0465-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.031

接受日期：2016-12-27