藍(lán) 慧，王 翀，楊 輝，潘 虎，盧向陽(yáng)①，田 云②

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.農(nóng)業(yè)生物化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.畜禽廢棄物資源化利用湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)研究所，西藏 拉薩 850032)

原油降解細(xì)菌ODB01的篩選、鑒定及降解特性

藍(lán) 慧1,2,3，王 翀1,2,3，楊 輝1,2,3，潘 虎2,4，盧向陽(yáng)1,2,3①，田 云1,2,3②

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.農(nóng)業(yè)生物化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.畜禽廢棄物資源化利用湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)研究所，西藏 拉薩 850032)

從長(zhǎng)慶油田被原油污染土壤中篩選出1株以原油為唯一碳源的菌株ODB01。經(jīng)菌株生理生化特征及16S rDNA序列分析，鑒定為腸桿菌屬(Enterobactersp.)細(xì)菌；運(yùn)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化細(xì)菌ODB01對(duì)原油的降解條件為pH值為8.91，w(NaCl)為1.19%，油菌比為1∶4.12，溫度為36.78 ℃，在該條件下細(xì)菌ODB01對(duì)原油的降解率為34.6%；分別添加w=0.05%土溫80(Tween 80)和w=0.05%辛基苯基醚(Triton X-100)后，細(xì)菌ODB01對(duì)原油降解率分別達(dá)到42.5%和46.1%。結(jié)果表明，細(xì)菌ODB01對(duì)原油具有一定的降解能力，有望作為一種微生物修復(fù)劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

原油降解細(xì)菌；鑒定；響應(yīng)曲面法；表面活性劑

在石油勘探、開(kāi)采、運(yùn)輸、儲(chǔ)存及生產(chǎn)加工等過(guò)程中大量泄漏的石油進(jìn)入生態(tài)環(huán)境中,不僅污染土壤,導(dǎo)致土質(zhì)惡化,影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[1-2],而且對(duì)人類(lèi)的健康帶來(lái)巨大威脅,尤其是石油烴中的多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)等有毒物質(zhì)具有“三致”(致癌、致畸、致突變)作用,危害極大[3-5]。因此,如何高效地治理石油在開(kāi)采、利用等過(guò)程中造成的污染問(wèn)題迫在眉睫。當(dāng)前,治理石油污染常用的物理、化學(xué)方法均因費(fèi)用昂貴及二次污染受到極大的限制,而微生物修復(fù)治理技術(shù)被公認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)、最有效、最環(huán)保的修復(fù)技術(shù),且無(wú)二次污染[6-7]。1989年美國(guó)在Exxon Vadez泄油事故中利用微生物修復(fù)技術(shù)首戰(zhàn)告捷,為微生物修復(fù)治理石油污染物拉開(kāi)了序幕[8]。

研究證實(shí),自然環(huán)境中廣泛存在能夠利用石油烴為唯一碳源和能源生長(zhǎng)繁殖的微生物[9-10]。YU等[11]分離出2株原油降解菌BacillussubtilisSWH-1和SphingbacteriummultivorumSWH-2,對(duì)原油的降解率分別為33.9%和46.3%。BAYAT等[12]從貽貝中分離得到的ShewanellaalgaeBHA1和Pseudoalteromonassp.BHA8,對(duì)原油的降解率分別為47.24%和27.13%。LIU等[13]從被原油污染的土壤中篩選獲得一株原油降解細(xì)菌BacilluslicheniformisY-1,該細(xì)菌在5 d內(nèi)對(duì)原油的去除率高達(dá)60.2%。LI等[14]用渤海海水中分離得到的5株細(xì)菌(OchrobactrumTCOB-1,BrevundimonasTCOB-2,BrevundimonasTCOB-3,BacillusTCOB-4和CastellaniellaTCOB-5) 構(gòu)成的復(fù)合系在7 d內(nèi)對(duì)原油的降解率達(dá)51.87%。但是,目前所篩選出來(lái)的石油烴降解細(xì)菌大多數(shù)是假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)以及不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)等[15],還沒(méi)有腸桿菌屬(Enterobacter)在石油烴降解方面的報(bào)道。筆者從被原油污染的土壤中分離得到一株對(duì)原油有很好降解效果的腸桿菌ODB01,對(duì)其進(jìn)行鑒定及降解條件的優(yōu)化,并分析了表面活性劑對(duì)其降解率的影響,研究結(jié)果將為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有高性能的原油降解微生物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

土壤樣品采集于長(zhǎng)慶油田被原油污染的土壤;原油購(gòu)于中國(guó)石化。

LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂粉15～20 g、蒸餾水1 000 mL,pH 值為7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基:參照文獻(xiàn)[16]。

1.2 原油降解菌株的富集、分離與純化

在裝有100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,加入 5 mL土壤樣品浸提液,添加φ=1%的原油作為唯一的碳源和能源,置于30 ℃、200 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)1周;取φ=10%的富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到已添加φ=1%原油的新鮮無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中,置于30 ℃、200 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)1周,連續(xù)重復(fù)3次。取最后1次富集培養(yǎng)液連續(xù)稀釋至10-5,涂布于φ=0.1%原油的無(wú)機(jī)鹽固體平板培養(yǎng)基上,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取平板上的單菌落反復(fù)進(jìn)行劃線分離純化,得到純化后的菌株,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 原油降解菌株的復(fù)篩

目的菌液的制備:將純化后得到的單菌落分別接種于裝有30 mL LB液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中,37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)至半對(duì)數(shù)期,12 000 r·min-1離心10 min,收集菌體,用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次,再重懸浮至光密度值(D600)為1.0,備用。

原油降解率的測(cè)量方法:先將對(duì)照組培養(yǎng)液全部倒入100 mL分液漏斗中,加入一定量石油醚(30～60 ℃)振蕩萃取培養(yǎng)液中殘留的原油,重復(fù)萃取2次,合并萃取液,60 ℃烘至恒重,用電子天平稱(chēng)重,獲得對(duì)照組原油殘留質(zhì)量并計(jì)算原油回收率;然后用同樣的方法獲得實(shí)驗(yàn)組原油殘留質(zhì)量,并計(jì)算原油降解率。

原油回收率=對(duì)照組原油殘留質(zhì)量/原油加入質(zhì)量×100%，原油降解率=1-實(shí)驗(yàn)組原油殘留質(zhì)量/對(duì)照組原油殘留質(zhì)量×100%。

復(fù)篩:在裝有35 mL含0.5 mL原油的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的50 mL帶蓋的三角瓶中,分別加入2 mL OD600為1.0的菌懸液,置于30 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)組,每組以不加菌懸液為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè)3個(gè)平行。用重量法分別測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在第1、3、5和7 天原油的殘留量和生物質(zhì)的變化，并計(jì)算各菌株原油降解率,選取原油降解率最好、穩(wěn)定性最好的1株菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并將其命名為ODB01。

1.4 原油降解菌株的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征,對(duì)菌株ODB01進(jìn)行鑒定[17-18]。

1.4.2 16S rDNA序列分析

提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌株ODB01的總DNA,用于16S rDNA序列擴(kuò)增。引物:27F，5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系:10×緩沖液，5 μL；ExTaq，0.25μL；dNTP，4 μL,引物各2 μL；模板，2 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序，94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共32個(gè)循環(huán),再72 ℃延伸10 min,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接到pMD18-T質(zhì)粒上,經(jīng)鑒定后送華大基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行在線比對(duì),并用MEGA 6.0軟件選用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 原油降解條件的優(yōu)化

經(jīng)單因素試驗(yàn)確定影響原油降解細(xì)菌ODB01降解原油的環(huán)境因素,并確定最適范圍。在此基礎(chǔ)上,以原油降解率為響應(yīng)值(Y),單因素為自變量(X),利用響應(yīng)曲面法中的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),對(duì)關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的響應(yīng)曲面模型和方差分析,最終確定細(xì)菌ODB01的最佳原油降解條件并進(jìn)行驗(yàn)證,每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行,求其平均值。

1.6 非離子表面活性劑Tween 80和Triton X-100對(duì)原油降解率的影響

按照1.3節(jié)所述方法制備細(xì)菌ODB01的菌懸液,在最佳原油降解條件下,分別將其置于裝有5 mL含不同濃度Tween 80和Triton X-100(w分別為0.01%、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%)液體原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的10 mL帶蓋離心管中,置于200 r·min-1搖床上培養(yǎng)7 d,分別于第1、3、5、7天取樣用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其D600,確定最適生長(zhǎng)的非離子表面活性劑濃度,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行,以不加菌懸液為對(duì)照,用于測(cè)量時(shí)作參比溶液。

按照1.3節(jié)制備細(xì)菌ODB01菌懸液,在最佳降解條件和最適濃度表面活性劑情況下降解15 d,測(cè)定原油降解率,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 原油降解菌株的篩選

以原油為唯一碳源和能源初步篩選出14株能利用原油生長(zhǎng)的菌株,通過(guò)監(jiān)測(cè)原油降解過(guò)程中原油的殘留量以及生物質(zhì)的增長(zhǎng)變化進(jìn)一步復(fù)篩出1株降解效率最高、穩(wěn)定性最好的菌株進(jìn)行研究,將其命名為ODB01。菌株ODB01的復(fù)篩結(jié)果見(jiàn)圖1,在菌株ODB01降解原油的過(guò)程中,原油殘留量隨降解時(shí)間的延續(xù)而不斷減少,生物質(zhì)含量隨著降解時(shí)間的延續(xù)而不斷增加,從而證實(shí)菌株ODB01確實(shí)能夠利用原油進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,對(duì)原油具有一定的降解效果,計(jì)算得出第7天時(shí)原油回收率為94.1%,菌株ODB01的初始原油降解率為24.1%。

*表示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著(P<0.05);**表示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間差異極顯著(P<0.01)。

2.2 原油降解菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征

菌株ODB01在固體平板上的單菌落形態(tài)為較規(guī)則圓形,濕潤(rùn),易挑起,呈淡黃色,油鏡下觀察單菌株形態(tài)為直桿狀,長(zhǎng)1.2～3.0 μm,寬0.6～1.0 μm,是革蘭陰性菌(圖2)。菌株ODB01的部分生理生化特征見(jiàn)表1。

放大倍數(shù)為1 000。

表1 菌株ODB01的生理生化特征

Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain ODB01

特征結(jié)果特征結(jié)果革蘭染色-生產(chǎn)H2S-葡萄糖氧化發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣KCN+接觸酶+吲哚+氧化酶-明膠水解+脲酶+鳥(niǎo)氨酸脫羧酶+MR試驗(yàn)-賴氨酸脫羧酶+VP試驗(yàn)+精氨酸雙水解酶-

“-”表示陰性,“+”表示陽(yáng)性。

2.2.2 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

菌株ODB01 16S rDNA測(cè)序結(jié)果最終獲得1.5 kb的序列,經(jīng)GenBank Blast序列同源性比較,結(jié)果顯示與腸桿菌屬(Enterobactersp.)有99%的同源性。采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)表明菌株ODB01與路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)在同一個(gè)分支上。所以,結(jié)果形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定菌株ODB01隸屬于腸桿菌屬(Enterobactersp.)細(xì)菌。

圖3 原油降解菌ODB01的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 降解條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)

為了對(duì)細(xì)菌ODB01的原油降解條件進(jìn)行優(yōu)化,首先通過(guò)單因素試驗(yàn)最終選定pH值、w(NaCl)、油菌比和溫度4個(gè)關(guān)鍵的單因素進(jìn)行優(yōu)化(圖4)。pH值過(guò)低或過(guò)高都將會(huì)造成降解率的重大變化,當(dāng)pH值小于5.0時(shí),細(xì)菌ODB01生長(zhǎng)受到抑制,隨后pH值不斷增加,降解率不斷增大,直到pH值為9.0時(shí),降解率達(dá)到最大值。當(dāng)pH值大于12時(shí),細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。因此,選取9.0為自變量pH值的0水平。當(dāng)w(NaCl)超過(guò)1%時(shí),隨著NaCl濃度的增加，細(xì)菌ODB01降解率開(kāi)始減小,達(dá)到8%左右時(shí)細(xì)菌不生長(zhǎng),這說(shuō)明高濃度NaCl會(huì)使溶液中滲透壓增大,造成細(xì)菌ODB01脫水,影響其生化反應(yīng),故選取1%為自變量NaCl濃度的0水平。當(dāng)油菌比增大時(shí),原油降解率也隨之增加,當(dāng)油菌比為1∶4時(shí),原油降解率達(dá)到最大值,故取1∶4為自變量油菌比的0水平。當(dāng)溫度低于25 ℃時(shí),細(xì)菌ODB01的生長(zhǎng)受到抑制,隨著溫度的增加,降解率呈上升趨勢(shì),在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值。因此,選取35 ℃為自變量溫度的0水平。

2.3.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,4個(gè)自變量(X1:pH值;X2:w(NaCl);X3:油菌比;X4:溫度)設(shè)計(jì)的因素與3水平為:X1為-1(8)、0(9)、1(10);X2為-1(0)、0(1%)、1(2%);X3為-1(1∶2)、0(1∶4)、1(1∶6);X4為-1(30 ℃)、0(35 ℃)、1(40 ℃)。以原油降解率為響應(yīng)值(Y),采用響應(yīng)曲面法中的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表2結(jié)果,利用Design Expert 8.0軟件對(duì)該結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)曲面回歸性分析,分析得到響應(yīng)值原油降解率(Y)對(duì)自變量pH值(X1)、w(NaCl)(X2)、油菌比(X3)、溫度(X4)的二次回歸方程:

Y=35.25-1.27X1+1.66X2+0.68X3+3.04X4+1.40X1X2+0.38X1X3-0.26X1X4+0.57X2X3+0.86X2X4-0.51X3X4-5.70X12-4.95X22-5.08X32-4.50X42。

圖4 pH值、NaCl濃度、油菌比和溫度對(duì)細(xì)菌ODB01原油降解率的影響

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 The results of response surface analysis

試驗(yàn)號(hào)pH值(X1)w(NaCl)(X2)/%油菌比(X3)溫度(X4)/℃降解率/%110-1021.32200-1127.933110026.724010-123.375-100-121.79600-1-121.7470-10126.038000036.389010129.8910100-120.2911011028.8512-101026.3913-110025.6614-100130.6115000036.02160-1-1023.031701-1026.7318001-124.62190-11022.8720101023.30211-10020.9422-10-1025.9423000035.1924001128.7725000033.77260-10-122.9627100128.0728000034.8929-1-10025.49

對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明:該模型總回歸方程的P<0.000 1,達(dá)到極顯著水平,失擬項(xiàng)P=0.390 7,說(shuō)明失擬性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著,其余因素對(duì)試驗(yàn)影響較小,該模型穩(wěn)定,可以作為響應(yīng)值對(duì)各自變量進(jìn)行預(yù)測(cè)。再者,模型決定系數(shù)R2=0.969 6,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所得的真實(shí)值與該模型的預(yù)測(cè)值有很好的相關(guān)性,模型校正決定系數(shù)Radj2=0.939 3,說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性很好,可信度高。另外,從X12、X22、X32、X42個(gè)因素的P值可以看出這4個(gè)因素對(duì)降解率的影響均極顯著,從F值來(lái)判斷,這4個(gè)因素對(duì)降解率的影響程度為X4>X2>X1>X3。對(duì)所得到的回歸方程求偏導(dǎo)微積分,獲得結(jié)果為X1=8.91,X2=1.19%,X3=1∶4.12,X4=36.78,Y=36.03%。即pH值為8.91,w(NaCl)為1.19%,油菌比為1∶4.12,溫度為36.78 ℃,此時(shí)分析預(yù)測(cè)的最大原油降解率為36.03%。

2.3.3 預(yù)測(cè)理論值的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證響應(yīng)曲面法軟件預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,在其預(yù)測(cè)的最佳原油降解條件和其他前提條件不變的情況下,試驗(yàn)測(cè)試原油的降解情況,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行,求其平均值。實(shí)驗(yàn)原油降解率為34.6%,是優(yōu)化前的1.44倍,與用響應(yīng)曲面法軟件預(yù)測(cè)的最佳降解率36.03%比較接近,說(shuō)明該模型能夠很好地預(yù)測(cè)原油降解的實(shí)際情況,預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.4 非離子表面活性劑Tween 80和Triton X-100對(duì)原油降解率的影響

2.4.1 不同濃度非離子表面活性劑Tween 80和Triton X-100對(duì)原油降解細(xì)菌ODB01生長(zhǎng)的影響

非離子表面活性劑能降低表面張力,提高石油烴化合物的溶解度,從而提高石油烴的生物利用度[19]。選用Tween 80和Triton X-100這2種非離子表面活性劑來(lái)研究它們對(duì)原油降解細(xì)菌ODB01的原油降解效果是否有影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度非離子表面活性劑Tween 80和Triton X-100對(duì)原油降解細(xì)菌ODB01生長(zhǎng)的影響

不同濃度非離子表面活性劑Tween 80和Triton X-100對(duì)其生長(zhǎng)有很大影響。對(duì)于非離子表面活性劑Tween 80而言,原油降解細(xì)菌ODB01在w為0.05%時(shí)要優(yōu)于0.01%的生長(zhǎng)情況,隨后,隨著濃度的增加,ODB01的生長(zhǎng)情況越來(lái)越差,當(dāng)w為0.20%時(shí),ODB01生長(zhǎng)受到抑制。因此,非離子表面活性劑Tween 80對(duì)ODB01的最適生長(zhǎng)濃度為0.05%。然而,對(duì)于Triton X-100來(lái)說(shuō),當(dāng)Triton X-100的w為0.01%時(shí),ODB01的生長(zhǎng)情況比w為0.05%時(shí)差,之后,隨著濃度的增大,細(xì)菌ODB01的生長(zhǎng)情況越來(lái)越差。與表面活性劑Tween 80相比,當(dāng)Triton X-100w為0.20%時(shí)并沒(méi)有出現(xiàn)生長(zhǎng)受到抑制的現(xiàn)象,說(shuō)明ODB01對(duì)表面活性劑Triton X-100有很寬的適用濃度。所以,非離子表面活性劑Triton X-100對(duì)ODB01的最適生長(zhǎng)濃度也是0.05%。由此可見(jiàn),高濃度非離子表面活性劑將抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),降低原油降解率。SALEK等[20]用3株細(xì)菌(Achromobactersp. 4,Pseudomonasstutzeri9，Rahnellasp. EK12)研究對(duì)柴油的生物降解過(guò)程中添加ρ為120 mg·L-1的Triton X-100時(shí),柴油降解率得到很大提高。KACZOREK等[21]研究了不同濃度Triton X-100對(duì)細(xì)菌PseudomonasfluorescensP1降解石油烴化合物的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)ρ(Triton X-100)為150 mg·L-1時(shí),石油烴化合物的降解率大約提高8%。KUMAR等[16]用4株細(xì)菌(Pseudoalteromonassp.、Ruegeriasp.、Exiguobacteriumsp.和Acinetobactersp.)構(gòu)建復(fù)合系統(tǒng)研究對(duì)引擎油的降解中,添加w為0.05%的Tween 80 15 d時(shí)引擎油降解率提高將近1倍。

2.4.2 最佳降解條件和最適非離子表面活性劑濃度下原油降解率的測(cè)定

為了評(píng)估原油降解細(xì)菌ODB01在最佳降解條件和最適非離子表面活性劑濃度下原油的降解效果,分最適非離子表面活性劑濃度的Tween 80和Triton X-100以及不加表面活性劑3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每組設(shè)3個(gè)平行。用重量法分別測(cè)量第1、5、10、15天原油殘留量的變化,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 在ODB01對(duì)原油降解的最佳條件下原油殘留量的變化

Table 3 The changes of total residual crude oil weight under optimal condition with crude oil-degrading strain ODB01

處理第1天第5天第10天第15天無(wú)添加表面活性劑9.27±0.04a7.59±0.13a6.58±0.11a5.83±0.07aw(Tween80)=0.05%9.17±0.10b6.33±0.08b5.75±0.10b5.27±0.09bw(TritonX-100)=0.05%9.11±0.17b5.91±0.07c5.42±0.11b4.91±0.13c

同一列數(shù)據(jù)后英文小寫(xiě)字母不同表示不同處理間某指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。

在最佳降解條件和沒(méi)有添加表面活性劑情況下,15 d時(shí)ODB01對(duì)原油的降解率為37.1%,在添加w=0.05% Tween 80情況下,降解率達(dá)42.5%,在添加w=0.05% Triton X-100情況下,降解率高達(dá)46.1%。因此,非離子表面活性劑w=0.05% Tween 80和w=0.05% Triton X-100均能一定程度增強(qiáng)ODB01對(duì)原油的降解能力,但w=0.05% Triton X-100比w=0.05% Tween 80顯著。無(wú)添加表面活性劑、添加w=0.05% Tween 80和添加w=0.05% Triton X-100處理間殘留的原油質(zhì)量有顯著差異(P<0.05)。同時(shí),ODB01在初始5 d內(nèi)對(duì)原油的降解效果較高,隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)原油的降解率反而降低,特別是15 d后,原油降解率變化很小。這說(shuō)明原油降解菌ODB01可能會(huì)代謝產(chǎn)生一些中間產(chǎn)物,這些中間代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)ODB01產(chǎn)生毒害作用或抑制其生長(zhǎng)。YANTO等[22]發(fā)現(xiàn)添加w=1.0%的非離子表面活性劑Tween 80后Pestalotiopsissp. NG007對(duì)柏油的降解率提高41%。MOHANTY等[23]則發(fā)現(xiàn)添加臨界膠團(tuán)濃度(CMC)的Triton X-100時(shí),Burkholderiamultivorans對(duì)NAPL-A1降解率由41%提高到90%。然而,TIAN等[24]發(fā)現(xiàn),非離子表面活性劑Tween 80對(duì)原油的降解率沒(méi)有影響。同時(shí),近幾年也有學(xué)者認(rèn)為化學(xué)表面活性劑增加微生物對(duì)石油烴的生物利用度是有爭(zhēng)議的[25-26]。

3 結(jié)論

(1)從長(zhǎng)慶油田被原油污染的土壤中分離篩選出1株原油降解菌株ODB01。經(jīng)鑒定該菌株ODB01為腸桿菌屬(Enterobactersp.)細(xì)菌,在原油初始濃度w=1%情況下,7 d對(duì)原油的降解率為24.1%,細(xì)菌ODB01對(duì)原油具有一定的降解作用。

(2) 利用響應(yīng)曲面法Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)菌ODB01的原油降解條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的最佳原油降解條件為pH值為8.91,w(NaCl)為1.19%,油菌比為1∶ 4.12,溫度為36.78 ℃,此條件下原油降解率為34.6%,是優(yōu)化前的1.44倍。

(3) 在最佳降解條件和分別添加w=0.05% Tween 80和w=0.05% Triton X-100情況下,15 d 后原油降解率分別為42.5%和46.1%,比沒(méi)有添加表面活性劑條件下的降解率(37.1%)分別提高12.7%和24.2%。這表面活性劑Tween 80和Triton X-100都能在一定程度上增加細(xì)菌ODB01對(duì)原油的降解能力,但Triton X-100比Tween 80效果好些。

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(責(zé)任編輯： 陳 昕)

Isolation, Identification and Degradation Characters of a Crude Oil-Degrading Strain ODB01.

LANHui1,2,3，WANGChong1,2,3，YANGHui1,2,3，PANHu2,4，LUXiang-yang1,2,3，TIANYun1,2,3

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2.Hunan Province University Key Laboratory for Agricultural Biochemistry and Biotransformation, Changsha 410128, China;3.Hunan Engineering Laboratory for Resource Utilization of Animal Faeces Wastes, Changsha 410128, China;4.Institute of Agricultural Product Quality Standard and Testing Research, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lhasa 850032, China)

A crude oil-degrading bacteria ODB01 was isolated from crude oil-contaminated soil of Changqing Oilfield, capable of utilizing crude-oil as the sole source of carbon for growth, and identified asEnterobactersp., based on physiological characteristics and the analysis of 16S rDNA gene sequence. The optimization of crude oil degradation condition was carried out by response surface methodology (Box-Behnken), the results are as follows: pH, 8.91; NaCl concentration, 1.19%; oil-bacteria liquid proportion, 1∶4.12; temperature, 36.78 ℃, and degradation rate reaches to 34.6% under the optimum condition; In addition, adding to 0.05% Tween 80 or 0.05% Triton X-100, the degradation rates of crude oil reached to 42.5% and 46.1%, respectively. These results indicated that the bacterium ODB01 had the capability of biodegrading crude oil and it maybe developed as a remediation agent.

crude oil-degrading bacterium; identification; response surface methodology; surfactant

2016-06-22

湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵共性技術(shù)導(dǎo)向類(lèi)項(xiàng)目(2015GK1017);西藏自治區(qū)財(cái)政專(zhuān)項(xiàng)資金

X253

A

1673-4831(2017)05-0466-08

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.05.012

藍(lán)慧(1987—) 男,江西贛州人,碩士生,主要從事環(huán)境微生物方面的研究。E-mail: 664604602@qq.com

① 通信作者E-mail: xiangyangcn@163.com

② 共同通信作者E-mail: tianyun@hunau.edu.cn