劉鷺，蘆晶，王瑩，逄曉陽，許嫚，張書文，呂加平

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，北京 100193）

基于差異蛋白質(zhì)組學解析紫色桿菌素抑制結(jié)腸癌細胞HT29的作用機制

劉鷺，蘆晶，王瑩，逄曉陽，許嫚，張書文，呂加平

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，北京 100193）

【目的】對紫色桿菌素作用后的結(jié)腸癌細胞HT29進行差異蛋白質(zhì)組學分析，探究其影響的代謝通路，揭示其抑制癌細胞生長的作用機制，為新型抗癌藥物的開發(fā)提供一定的參考?！痉椒ā恳圆煌瑒┝康淖仙珬U菌素處理HT29 24、48、72 h，通過MTT試驗以及透射電鏡分析其對結(jié)腸癌細胞的有效抑制劑量及抑制情況。在此基礎(chǔ)上，對提取的3個處理組的蛋白進行同位素標記，利用反相液相色譜（RP-LC）聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜（AB SCIEX Triple TOF 5600）獲得樣品中的多肽及其相對豐度信息，通過數(shù)據(jù)庫（NCBI. Human. protein database）搜索比對，鑒定差異表達蛋白。利用GO分析、KEGG信號通路分析，解析紫色桿菌素抑癌作用代謝途徑。【結(jié)果】紫色桿菌素對HT29的抑制作用呈一定的時間、劑量依賴性。當紫色桿菌素對HT29的抑制率達50%時，僅為陽性藥物5-Fu劑量的1/6，具有更明顯的抑制效果。電鏡下觀察顯示，隨著紫色桿菌素劑量增大，細胞內(nèi)部線粒體出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，質(zhì)膜出泡；當濃度達30 mg·L-1時，細胞膜消失，染色質(zhì)邊集。通過差異蛋白質(zhì)組學分析，共鑒定出4 258個蛋白，表達差異在2倍以上的蛋白共為757個。其中高劑量組處理差異蛋白數(shù)為492個，低劑量組處理的差異蛋白數(shù)為112個，陽性對照組差異蛋白數(shù)為336個。KEGG分析顯示這些差異蛋白共參與50條信號通路。其中有10條信號通路具有顯著性（P＜0.05），主要參與核糖體循環(huán)途徑、三羧酸循環(huán)途徑和RNA降解途徑等?！窘Y(jié)論】紫色桿菌素主要通過影響HT29細胞生命活動中的蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進而發(fā)揮抑制作用。

差異蛋白質(zhì)組學；紫色桿菌素；HT29；iTRAQ同位素相對標記和絕對定量；透射電鏡

0 引言

【研究意義】天然色素具有安全、營養(yǎng)、多功能性的特點。目前所研究的天然色素主要以紅、黃色調(diào)為主，如利用紅曲菌生產(chǎn)紅色素、利用 Phaffia rhodozyma酵母、Micrococcus roseus、Brevibacterium linens等菌生產(chǎn)類胡蘿卜素[1-4]。天然藍色素是天然色素中的稀缺色素。紫色桿菌素（violacein，Vio）是微生物的次級代謝產(chǎn)物，屬于吲哚類衍生物，為天然色素，對絲綢、棉、毛等天然原料具有良好著色效果；它除了著色功能，同時兼具抑菌、殺錐蟲、抗病毒（皰疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒）以及抑制癌細胞（大細胞肺瘤、結(jié)腸癌等）增殖的作用[5-11]。BROMBERG等[12]發(fā)現(xiàn)埃希氏腹水瘤對紫色桿菌素的敏感性是正常淋巴細胞對紫色桿菌素的兩倍。紫色桿菌素可使細胞短時間內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS），降低體內(nèi)谷胱甘肽（GSH）水平，進而對埃希氏腹水瘤細胞產(chǎn)生一定的抑制作用。KODACH等[13]認為紫色桿菌素可增加5-Fu對細胞的毒性，誘導細胞發(fā)生程序性死亡，抑制Akt磷酸化作用，終止信號轉(zhuǎn)導。紫色桿菌素對結(jié)腸癌細胞的治療很有前景?！厩叭搜芯窟M展】產(chǎn)紫色桿菌素（violacein，Vio）的細菌來源較為廣泛，包括海洋、淡水、冰川及土壤等。產(chǎn)紫色桿菌素的細菌種類也較多，如 Collimonas、 Duganella、 Janthinobacterium、Microbulbifer sp.、Pseudoalteromonas[10,11,14-20]。筆者實驗室從山羊乳中分離獲得一株高產(chǎn)紫色桿菌素的Janthinobacterium lividum ZSJ。經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，Vio產(chǎn)量最高可達2.87 g·L-1[5]。研究認為紫色桿菌素對結(jié)腸癌細胞凋亡過程的活性氧簇物（reactiveoxygenspecies，ROS）的產(chǎn)生有很大的影響。CARVALHO等[21]認為由紫色桿菌素誘導所產(chǎn)生的活性氧簇物是導致線粒體膜發(fā)生崩潰的關(guān)鍵因子。活性氧簇物導致Caco-2細胞中Caspase3的激活、細胞色素C和鈣釋放至細胞質(zhì)中。但紫色桿菌素不能增加 HT29細胞內(nèi)的活性氧簇物的含量，紫色桿菌素對不同的細胞具有特異性。MENEZES等[14]對比了紫色桿菌素對9種人類癌細胞的抑制作用，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素對不同的細胞抑制程度不同，對NCI/ADR-RES細胞具有選擇抑制性。紫色桿菌素可以引起HL60細胞發(fā)生凋亡，但對人的正常淋巴細胞和單核細胞沒有影響[7]?！颈狙芯壳腥朦c】目前對紫色桿菌素抑癌的研究主要聚焦于對具體通路（如調(diào)亡通路）的研究：如何引起細胞凋亡，對凋亡因子（caspase-2、caspase-9、caspase-3等）以及凋亡誘導因素（ROS）的分析[10-11,20]。而利用高通量篩選技術(shù)全面解析紫色桿菌素作用機制的研究較少。蛋白質(zhì)組學是對機體、組織或細胞的全部蛋白質(zhì)的表達水平、蛋白修飾與功能、蛋白之間相互作用等進行高通量的篩選和分析。相比于傳統(tǒng)單個蛋白的研究，蛋白組學研究更能夠準確反映機體的狀態(tài)和揭示新的作用途徑?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從不同劑量處理的癌細胞中蛋白質(zhì)的生物學差異出發(fā)，利用高通量的iTRAQ技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)組學策略，分析與鑒定差異表達蛋白；并通過GO分析、KEGG代謝通路分析，全面解析紫色桿菌素的作用途徑，為揭示紫色桿菌素的作用機制提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于 2014年在中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所和北京蛋白質(zhì)組研究中心進行。

1.1 試驗材料與設(shè)計

HT29細胞購自北京協(xié)和細胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、胎牛血清等購自美國Gibco-BRL公司；凍存管、培養(yǎng)皿、24孔板購自美國Corning公司；青鏈霉素、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、四氮甲基偶氮唑鹽（MTT）、蛋白酶抑制劑、色譜級乙腈、色譜級乙醇、丙酮、尿素等購自美國Sigma公司；5-氟尿嘧啶（5-Fu）購自上海晶純生化科技。

將不同劑量的紫色桿菌素與HT29細胞共同孵育24、48、72 h，采用MTT分析其存活率，同時設(shè)置不同劑量的5-Fu為陽性對照；以透射電鏡于8 000×觀察作用后的細胞結(jié)構(gòu)的變化。在此基礎(chǔ)上，以 1 mg·L-1紫色桿菌素為低劑量處理，30 mg·L-1紫色桿菌素為高劑量處理，分別作用HT29細胞48 h，同時設(shè)置5-Fu為陽性藥物作用于HT29。作用完畢，收集細胞，裂解、酶解。采用iTRAQ試劑盒標記蛋白，通過反相液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)對提取的蛋白進行蛋白組學分析，這部分試驗在北京蛋白質(zhì)組研究中心進行。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的 HT29細胞接種于培養(yǎng)皿中，用含5%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3—5 d。每3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代一次。正常生長狀態(tài)下的HT29細胞為上皮樣，單層貼壁生長。

1.2.2 細胞活力測定—MTT法 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)至其密度為1×104/mL。將其接種于96孔板中，每孔加入細胞懸液200 μL，置于5% CO2、37℃條件下進行培養(yǎng)。待80%細胞融合后，按試驗分組進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL MTT（5 mg·mL-1），孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩5 min使結(jié)晶物充分溶解，在酶標儀上以波長490 nm處測定A值。設(shè)5-Fu為陽性藥物對照。

1.2.3 培養(yǎng)細胞電鏡樣品的制備 利用透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)。

取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)至細胞密度為1×104/mL接種于24孔板中，培養(yǎng)條件同1.2.1。待80%細胞融合后，分別以0.1 mg·L-1、1 mg·L-1、10 mg·L-1和30 mg·L-1不同劑量的紫色桿菌素作用于HT29細胞24 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，用細胞刮收集細胞，與培養(yǎng)液一起1 500 r/min離心5 min，棄上清，采用2.5%戊二醛固定液固定細胞團塊2—4 h，0.1 moL·L-1PBS洗滌3次，1%鋨酸固定1 h，0.1 moL·L-1PBS洗滌3次，梯度濃度酒精、丙酮脫水，618環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色，于透射電鏡（H7500，日本）下觀察及拍照。

表1 同位素標記Table 1 Isotope labeling

1.2.4 蛋白組學測定

1.2.4.1 細胞樣品制備、裂解及蛋白提取 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)至其密度為1×104/mL。將其接種于24孔板中，培養(yǎng)條件同1.2.1。待細胞單層貼壁后，分別采用高劑量（30 mg·L-1）、低劑量（1 mg·L-1）的紫色桿菌素作用于鋪板的細胞48 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，采用胰酶消化細胞，離心，PBS洗滌兩次，收集沉淀。加入尿素和蛋白酶抑制劑溶液，冰水浴超聲波破碎（2 S、2 S，1 min，22%）。離心收集上清，加入4倍體積的預冷丙酮沉淀，離心收集沉淀。再加入復溶劑和0.1%SDS，超聲（2 S、2 S，1 min，22%），離心收集上清。采用Bradford法進行蛋白質(zhì)定量。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)還原、封閉及消化 蛋白質(zhì)還原烷基化：每組樣品各取75 μg，用復溶buffer補足體積至20 μL，加入2 μL還原劑，60℃孵育1 h，冷卻，加入半胱甘酸1 μL，室溫避光孵育10 min。

蛋白質(zhì)的消化：每個樣品管加入2 μL 0.5 μg·μL-1胰蛋白酶，37℃過夜；次日補加2 μL 0.5 μg·μL-1胰蛋白酶，37℃孵育2 h。

1.2.4.3 肽段的 iTraq標記 采用 iTraq4試劑盒（iTR AQ 4 plex，AB SCIEX）對不同樣品進行不同大小的同位素標記（表1）。

1）將標記試劑平衡至室溫；

2）每管標記試劑中加入70 μL色譜級乙醇，旋渦振蕩1 min，離心甩至管底；

3）將混好的標記試劑加入到肽段中，不同樣品用不同大小的同位素標記；

4）混勻后，甩至管底，室溫靜置2 h；

5）真空抽干標記；

6）4℃保存。

1.2.4.4 質(zhì)譜測定 質(zhì)譜鑒定所用儀器為美國 AB SCIEX公司的AB Sciex Triple TOF 5600 -液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀。采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式進行數(shù)據(jù)采集；PMF的質(zhì)譜掃描范圍：一級采集質(zhì)量范圍為350—1 250 Da，二級采集質(zhì)量范圍為100—1 500 Da。離子源電壓為2 500 v。富集柱為C18，5 μm，20 mm Length；分離柱為C18，3 μm，150 mm Length。流動相：A，1.9% ACN+98% H2O+0.1% FA；B，98% ACN+1.9% H2O+0.1% FA，流速為330 nL·min-1。

搜索參數(shù)如下：數(shù)據(jù)庫為 NCBI.Human.protein-20130701；酶為胰蛋白酶；搜索引擎：AB官方ProteinPilot?Software Beta(4.5)；一級誤差：10 ppm，二級誤差：20 ppm。

1.2.4.5 數(shù)據(jù)分析 原始文件（mgf）用 Proteomics Tools分析軟件抽提肽段報告離子峰定量信息，分別以S1（115）、S2（116）、S3（117）為內(nèi)參對信號強度進行歸一化分析處理，采用軟件計算各肽段比值的加權(quán)平均值作為蛋白質(zhì)定量結(jié)果，將定量及鑒定結(jié)果進行合并處理，將差異表達蛋白進行生物信息學分析（GO分析、KEGG代謝通路分析）。

2 結(jié)果

2.1 紫色桿菌素對HT29細胞活力的影響

以不同濃度的紫色桿菌素作用HT29細胞一定時間，同時設(shè)置5-Fu為陽性對照，對比分析24、48、72 h紫色桿菌素對細胞活性的影響。圖1顯示紫色桿菌素對HT29細胞生長有明顯的抑制作用。紫色桿菌素濃度為 5mg·L-1時，抑制率超過 50%；濃度為 10 mg·L-1及30 mg·L-1時，抑制效果更加明顯，抑制率達61.37%、70.23%。陽性藥物對照組，5-Fu濃度為 5 mg·L-1時，其24、48、72 h的抑制率分別為16.5%、21.8%和34.24%。空白組的抑制率為1.938%。紫色桿菌素對HT29的抑制效果明顯優(yōu)于5-Fu。

圖1 紫色桿菌素對HT29細胞活性的影響Fig. 1 Effects of violacein on the inhibition rate against HT29

2.2 細胞掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)

藥物作用時間、劑量以及所用細胞的種類都會影響細胞的機構(gòu)變化。有研究報道，相比于Caco2細胞，HT29細胞對于紫色桿菌素的耐受力更大[18-19]。MTT結(jié)果表明，相比于同劑量的陽性藥物5-Fu，紫色桿菌素對HT29的抑制作用更加明顯。在此基礎(chǔ)上，分別以0.1、1、10和30 mg·L-1不同劑量的紫色桿菌素作用于HT29細胞24 h，采用透射電鏡觀察紫色桿菌素對細胞超微結(jié)構(gòu)的影響。

對照組培養(yǎng)的HT29細胞染色質(zhì)均勻分布，有核仁，細胞膜完整，線粒體均勻分布在細胞質(zhì)中。0.1 mg·L-1、1 mg·L-1劑量組的細胞出現(xiàn)線粒體空泡化現(xiàn)象及質(zhì)膜出泡現(xiàn)象。隨著劑量的增加，細胞變圓，胞漿濃縮。細胞內(nèi)出現(xiàn)少量大小不等的空泡，泡內(nèi)容物的電子密度與基質(zhì)相似。細胞核不規(guī)則，染色質(zhì)邊集、濃縮，呈斷裂狀。部分線粒體腫脹，吞噬體顆粒增多。10 mg·L-1劑量組的空泡化現(xiàn)象較多，質(zhì)膜出現(xiàn)破碎。30 mg·L-1劑量組出現(xiàn)細胞膜消失，染色質(zhì)邊集，細胞器形成碎片（圖2）。

2.3 差異蛋白質(zhì)組學分析

蛋白質(zhì)組學是從系統(tǒng)生物學的角度研究蛋白質(zhì)的各種性質(zhì)，包括序列、表達水平、修飾狀態(tài)、亞細胞分布、活性結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而揭示基因的功能，最終解釋遺傳和環(huán)境是如何通過相互作用控制細胞的功能?；?MTT及透射電鏡下觀察結(jié)果，本研究采用紫色桿菌素低劑量（1 mg·L-1）、高劑量（30 mg·L-1）分別作用HT29細胞，并設(shè)定一個陽性對照處理（5-Fu），嘗試通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)從系統(tǒng)生物學角度探索紫色桿菌素抑制癌細胞代謝通路及作用機制。

2.3.1 差異蛋白整體分析 所有串級譜圖通過搜索引擎進行 NCBI.Human.protein-20130701人種屬數(shù)據(jù)庫檢索。使用獲得置信度在0.95以上的蛋白結(jié)果，共發(fā)現(xiàn)鑒定4 258個蛋白。本試驗將各標記組豐度差異大于 2.0（P＜0.05）作為差異蛋白的篩選標準，篩選出差異蛋白為757個。其中高劑量組處理的差異蛋白數(shù)492個，低劑量組處理的差異蛋白數(shù)112個，陽性對照組的差異蛋白數(shù)336個（表2）。差異蛋白篩選情況及組分間蛋白質(zhì)分布（proteinpilot軟件計算）情況均顯示：高劑量Vio處理細胞比5-Fu處理出現(xiàn)的差異蛋白更多，且高劑量組比低劑量組的差異蛋白變化更顯著。

2.3.2 差異蛋白基因本體論（GO）分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的信息和注釋，對鑒定得到的差異蛋白譜進行GO分析（圖3—5、表3）。從蛋白生物學途徑（Process）、蛋白成分分布（Component）和蛋白功能（Function）3個方面進行富集分析。對差異蛋白的生物學途徑（Process）富集分析（圖 3）表明，差異蛋白主要表現(xiàn)為下調(diào)，低劑量和高劑量紫色桿菌素差異蛋白富集情況僅有部分相同，紫色桿菌素劑量的高低對蛋白表達有顯著影響。

圖2 不同劑量紫色桿菌作用HT29超微結(jié)構(gòu)比較（8000×）Fig. 2 Comparison of cell ultrastructure treated by multiple dosage of violacein for 24 h

表2 差異蛋白篩選情況Table 2 Comparison of differential protein among three treatments

對差異蛋白的組分分布（Component）富集分析（圖 4）表明，紫色桿菌素作用于細胞的差異蛋白主要表現(xiàn)為下調(diào)，陽性藥物組的差異蛋白主要位于胞內(nèi)細胞器及核酸上；紫色桿菌素組的差異蛋白主要位于在細胞質(zhì)上，其高劑量組和低劑量組的差異蛋白總體分布大致相同。

對差異蛋白的功能（Function）富集分析（圖5）表明，差異蛋白主要集中在結(jié)合功能方面，紫色桿菌素對具有結(jié)合功能的蛋白質(zhì)表達有影響，低劑量的紫色桿菌素主要影響具有結(jié)合RNA功能的蛋白。

圖3 差異蛋白生物學途徑富集分析Fig. 3 Process classification of differential proteins

2.3.3 差異蛋白的信號通路（pathway）分析 代謝通路分析顯示差異蛋白在KEGG ORTHOLOGY共參與了50個代謝通路。屬于KEGG ORTHOLOGY的6個標準類別中的 5個類別。具體如下：參與代謝（metabolism）類別的有24個代謝通路，參與人類疾?。╤uman diseases）的有7個代謝通路，參與有機體系統(tǒng)（organismal systems）類別的有1個代謝通路，參與細胞過程（cellular processes）類別的有6個代謝通路，參與遺傳信息處理（genetic information processing）類別的有12個代謝通路，參與環(huán)境信息處理（environmental information processing）類別的有0個代謝通路。

圖4 差異蛋白組分分布富集分析Fig. 4 Component classification of differential proteins

本研究的目的就是探索紫色桿菌素通過何種代謝途徑對HT29細胞產(chǎn)生抑制作用。因此，對代謝類別的信號通路進行進一步分析。在所鑒定的757個差異蛋白中，共有165個差異表達蛋白參與代謝（metabolism）類別中的24個代謝通路。分析顯示，多個蛋白可同時參與同一信號通路，同一蛋白也可對多條信號通路起作用。差異蛋白對其中的10條信號通路具有顯著影響（P＜0.05），具體為核糖體途徑、剪接體途徑、三羧酸循環(huán)途徑、糖異生途徑、亨廷頓氏病途徑、氨酰tRNA生物合成和RNA降解途徑等（表4）。除了亨廷頓氏病途徑（與疾病類別有關(guān)），其余 9條皆屬于代謝類（metabolism）途徑。

圖5 差異蛋白的分子功能富集分析Fig. 5 Functional classification of differential proteins

表3 差異蛋白富集分析（GO分析）Table 3 Gene ontology of significantly differential protein

表4 蛋白參與信號通路KEGG分析Table 4 KEGG analysis of proteins involved in signaling pathways

3 討論

前人研究顯示紫色桿菌素可引起很多腫瘤細胞系的凋亡[6,20-24]。針對紫色桿菌素作用于 Caco-2細胞和HT29細胞的研究顯示，紫色桿菌素可引起Caco-2細胞產(chǎn)生大量活性氧簇，激活 Caspase-3，釋放細胞色素C、鈣到細胞質(zhì)，從而導致細胞凋亡。由紫色桿菌素誘導細胞產(chǎn)生的活性氧簇是導致線粒體膜崩潰的關(guān)鍵因子。研究還表明，紫色桿菌素不能提高HT29細胞內(nèi)的活性氧簇水平。因此，研究者認為紫色桿菌素對不同的細胞有不同的作用途徑[20-21]。本研究將紫色桿菌素作用于HT29細胞，同時設(shè)置5-Fu為陽性對照。5-Fu主要通過影響DNA的合成，干擾蛋白質(zhì)進而達到抑癌的作用。當抑制率為 50%時，紫色桿菌素的作用劑量僅為5-Fu的1/6。但Hoechst33342/PI染色顯示，與對照組相比，細胞凋亡沒有發(fā)生。透射電鏡下觀察均顯示，紫色桿菌素作用后的細胞呈現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)時間劑量效應。隨著濃度增大，逐漸出現(xiàn)質(zhì)膜破碎、凹陷。當濃度達到30 mg·L-1，細胞出現(xiàn)染色質(zhì)邊集效應，細胞膜消失。這與前人的研究和假設(shè)相一致。本研究也認為紫色桿菌素不是通過凋亡的途徑作用于HT29細胞，需要采用別的方法對其進行更深入的研究。

蛋白質(zhì)組學（Proteomics）是一門以全面的蛋白質(zhì)性質(zhì)研究為基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)水平對疾病機理、細胞模式、功能聯(lián)系及基因調(diào)控等方面進行探索的科學[25-27]。通過對疾病狀態(tài)和正常狀態(tài)的蛋白質(zhì)譜表達差異進行比較和分析，開發(fā)新的藥物作用靶點，探索和深入認知其內(nèi)在機制。有研究利用二維電泳或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析外界脅迫條件下（如砷脅迫、金屬鐵離子脅迫、pH脅迫或饑餓脅迫）產(chǎn)紫色桿菌素的Chromobacterium violaceum菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)組學的變化[28-30]，發(fā)現(xiàn)菌體內(nèi)的差異蛋白參與了響應氧化應激、DNA修復、脂肪代謝等途徑。外界脅迫條件可導致菌體內(nèi)與生物合成途徑、分子回收、能源生產(chǎn)有關(guān)的受體、轉(zhuǎn)運蛋白的表達發(fā)生變化，但利用蛋白組學技術(shù)研究紫色桿菌素如何作用于癌細胞的研究還鮮有報道。

本研究采用的是反相高效液相色譜（HP-RPLC）分離模式來分離蛋白質(zhì)。這在很大程度上克服了2DE的局限性，避免低豐度蛋白的丟失，其與質(zhì)譜的聯(lián)用是目前蛋白質(zhì)組學研究廣為采用的技術(shù)。相比于2DE，可更準確、靈敏地鑒定出更多蛋白。

4 結(jié)論

紫色桿菌素對 HT29細胞的抑制作用呈時間、劑量依賴性。相比于陽性藥物5-Fu，紫色桿菌素的抑制效果更明顯。在抑制率為50%時，紫色桿菌素的劑量僅為5-Fu劑量的1/6。透射電鏡顯示，隨著Vio劑量增大，細胞內(nèi)部線粒體出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，質(zhì)膜出泡；當濃度為30 mg·L-1時，細胞膜消失，染色質(zhì)邊集。利用 iTRAQ標記不同處理組的蛋白，通過反向色譜進行肽段分離，結(jié)合高分辨串聯(lián)質(zhì)譜分析，通過數(shù)據(jù)庫搜索、鑒定出 757個差異蛋白。KEGG分析顯示，差異蛋白顯著影響 10條信號通路，主要為核糖體循環(huán)途徑、三羧酸循環(huán)途徑和RNA降解途徑等。據(jù)此推測，紫色桿菌素通過影響細胞生命活動中的蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進而發(fā)揮抑制作用。

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（責任編輯 趙伶俐）

Antitumor Effect of Violacein Against HT29 by Comparative Proteomics

LIU Lu, LU Jing, WANG Ying, PANG XiaoYang, XU Man, ZHANG ShuWen, Lü JiaPing
(Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Food Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

【Objective】The objective of this experiment is to investigate proteomic profile of HT29 treated with high-dosage-violacein and low-dosage-violacein, and to analyze its involved metabolic pathway and mechanism. 【Method】Cytotoxic activity of violacein was analyzed by MTT assay and observed by using transmission electron microscopy. After that, the total protein was extracted from the cells．To obtain relative abundance of peptides information, total proteins labeled with multiple iTRAQ stable isotopes were segregated and analyzed with RP-LC-MS/MS. The differential expression proteins were identified through NCBI. Human. protein database. The metabolic pathway was analyzed through Go analysis and KEGG analysis. 【Result】Violacein inhibited the growth of HT29 in dose-dependent and time-dependent manner. Compared with 5-Flu, 5 mg·L-1violacein resulted in 50% inhibition of HT29. Its dosage was one sixth of the dosage of 5-Fu. With the increasing violacein, vacuoles in the mitochondrion and membrane blebs were found under transmission electron micrograph. Violet pigment at 30 mg·L-1inducedmargination of nuclear chromatin and disappearance of cell membrane. Through quantitative proteomic analysis of these three cells, 4 258 proteins were identified with MS, 757 of which were differential expression proteins (fold change of protein expression≥2). Among these differential expression proteins, there were 492 proteins in cells treated with high dosage of violacein, 112 proteins in cells treated with low dosage of violacein, and 336 proteins in cells treated with 5-Fu. Analysis of enriched KEGG pathway showed that most of these differential expression proteins were involved in 50 signaling pathways, 10 of which were enriched significantly (P＜0.05), such as ribosome, citrate cycle and RNA degradation. 【Conclusion】The antitumor mechanism of violacein against colon cancer cells are mainly involved in transcription and translation in cell life cycle.

comparative proteomics; violacein; iTRAQTM; HT29; transmission electron microscopy

2016-08-24；接受日期：2017-02-22

國家自然科學基金面上項目（31371763）、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（S2016JC01）、國家留學基金委訪問學者項目（留金發(fā)2013[3018]）

聯(lián)系方式：劉鷺，E-mail：13910666179@163.com。通信作者張書文，E-mail：zswmaster@163.com。通信作者呂加平，E-mail：lvjp586@vip.sina.com